周連寧，郝文龍，吳屬連，李 錕，王 波（.深圳海岸與大氣研究重點實驗室，廣東 深圳 58057；.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 58057）

不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究

周連寧1，2，郝文龍2，吳屬連2，李 錕2，王 波1
（1.深圳海岸與大氣研究重點實驗室，廣東 深圳 518057；
2.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司，廣東 深圳 518057）

采用響應(yīng)曲面法對加速溶劑萃取法提取小球藻油脂過程的影響因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）進(jìn)行研究。在試驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過方差分析和多項式回歸構(gòu)建擬合度良好的模型，模型顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.0821），R2=0.9917，R2adj=0.9811，能客觀科學(xué)地反映小球藻油脂的真實萃取情況。方差分析還表明，萃取時間對油脂提取量的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.0001），萃取溫度達(dá)到顯著水平（P=0.0496），氯仿-甲醇體積比則不顯著（P=0.5792）。橢圓形的等高線表明因素間存在兩兩相互作用，結(jié)合方差分析發(fā)現(xiàn)，萃取溫度和氯仿-甲醇體積比的交互作用達(dá)到極顯著水平（P=0.0057）。模型預(yù)測的小球藻油脂最高提取量為16.06%，對應(yīng)各因素的水平為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。此條件下的實際油脂提取量為16.10%，接近預(yù)測值。

小球藻；加速溶劑萃取法；響應(yīng)面；生物柴油

周連寧，郝文龍，吳屬連，等. 不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：126-132.

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，能源問題日益突顯，含油微藻作為一種清潔生物質(zhì)能源受到極大關(guān)注［1］。含油微藻是一種很有潛力的生物柴油原料，具有生長快、含油高、不占用耕地等優(yōu)點［2］。微藻油脂提取是產(chǎn)生物柴油的關(guān)鍵過程［3］，其提取方法的優(yōu)化極為重要。Folch法［4］和Bligh-Dyer法［5］是兩種較經(jīng)典、傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取方法，兩種方法均采用氯仿甲醇溶劑系統(tǒng)，但溶劑配比不同。Sheng等［6］評估了多種溶劑及系統(tǒng)對集胞藻6803的油脂提取效率，發(fā)現(xiàn)基于氯仿-甲醇系統(tǒng)的Folch法和Bligh-Dyer法展現(xiàn)出最高的提取效率，可作為實驗室油脂提取方法的黃金標(biāo)準(zhǔn)。氯仿-甲醇對油脂的高效提取是因為該溶劑系統(tǒng)具有較好的細(xì)胞膜穿透能力和較合適的極性，并且其與氫鍵有較大的相互作用。當(dāng)微藻細(xì)胞處于正已烷、氯仿等非極性有機(jī)溶劑中時，溶劑會穿過細(xì)胞膜與胞質(zhì)中的中性脂質(zhì)（如甘油三酯）通過范德華力相互作用，形成“有機(jī)溶劑-中性脂質(zhì)”復(fù)合體，該復(fù)合體可順著有機(jī)溶劑濃度梯度擴(kuò)散至細(xì)胞外圍的有機(jī)溶劑。部分中性脂質(zhì)與胞質(zhì)中的極性脂質(zhì)（如磷脂、糖脂）形成復(fù)合體，并通過氫鍵與細(xì)胞膜上的蛋白緊密相連，非極性有機(jī)溶劑與中性脂質(zhì)間的范德華力不足以破壞基于膜脂質(zhì)與蛋白間的聯(lián)系，但甲醇這類極性溶劑可以。故氯仿-甲醇混合液可保證中性脂質(zhì)的完全萃取，不論是以自由脂滴形式存在，還是以蛋白結(jié)合的復(fù)合體形式存在，在總脂萃取上展示了較高的效率［7］。雖然上述兩種經(jīng)典的有機(jī)溶劑提取方法油脂提取效率較高，但提取過程中的有毒溶劑使用量較大，耗時也較長，因此有必要尋找更快捷高效的提取方法。有學(xué)者認(rèn)為超臨界CO2萃取法可取代傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法［8-9］，因其采用超臨界CO2作為萃取溶劑，可快速提取油脂，而且避免使用有毒溶劑，具有環(huán)境友好性。但該法所用儀器昂貴，且對極性化合物的提取效率較低［10］。Richter等［11］于1996年研發(fā)出一套自動萃取的方法，即加速溶劑萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE），該法用有機(jī)溶劑在高溫高壓下進(jìn)行目標(biāo)化合物的萃取，既提高了目標(biāo)化合物的溶解度，加快了溶劑的擴(kuò)散和物質(zhì)的遷移，同時也降低了溶劑的粘度和表面張力。相比于傳統(tǒng)方法和超臨界CO2法，ASE法所用的溶劑量少，萃取時間短，且可自動化運行，還可保持樣品處于無氧無光的環(huán)境中，有效降低了萃取物的降解［12］。本研究采用前人方法中可高效萃取油脂的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng)，運用響應(yīng)曲面法對ASE中影響油脂提取的參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，為微藻生物柴油的發(fā)展提供參考。

1　材料與方法

1.1藻種培養(yǎng)與收集

供試藻種為小球藻（Chlorella sorokiniana），由深圳海岸與大氣研究重點實驗室保藏。

小球藻細(xì)胞置于液體BG-11培養(yǎng)基［13］，在恒溫光照搖床（TS2112B，上海秣馬恒溫設(shè)備廠）中持續(xù)光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2 000 lx，溫度為22℃，搖床轉(zhuǎn)速為80 r/min。培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，6 000 r/min離心2 min收集藻細(xì)胞，再用去離子水洗滌3次，獲得的濕藻泥用于油脂提取。

1.2小球藻含水率的測定

離心收集藻細(xì)胞，用去離子水清洗3次后稱量，記錄濕重為M1（mg），之后放入臺式冷凍干燥機(jī)（FreeZone 2.5 L，Labconco）中，冷凍干燥完成后再次稱量，記錄干重為M2（mg），計算含水率：

1.3小球藻油脂的提取

采用ASE法提取小球藻的油脂。稱取適量藻細(xì)胞，重量記為M3（mg），將其置于萃取池中，待溶劑充滿萃取池后，壓強(qiáng)升高并恒定為8 963.1841 kPa；之后加熱萃取池，進(jìn)行靜態(tài)萃取；沖洗體積設(shè)為60%，萃取溶劑、萃取溫度、萃取時間則按后續(xù)實驗設(shè)計設(shè)置。收集的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干大部分溶劑，剩余用氮氣吹干至恒重，稱量所得的油脂，記為M4（mg），計算小球藻油脂提取量：

1.4試驗設(shè)計

1.4.1單因素試驗設(shè)計 采用氯仿-甲醇雙溶劑系統(tǒng)萃取小球藻油脂，以小球藻油脂提取量為響應(yīng)值，對可能影響提取量的因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）進(jìn)行單因子3水平試驗，具體試驗設(shè)計見表1。

表1 單因素變量試驗因素水平

1.4.2響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上，挑選各因素中油脂提取量較高的水平區(qū)間，運用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模型，以小球藻油脂提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素（萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比）3水平（-1、0、1）的響應(yīng)面試驗設(shè)計，以期獲得最優(yōu)參數(shù)組合，最大化油脂提取量。試驗各因素的水平賦值見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計各因素水平

2　結(jié)果與分析

2.1小球藻含水率

試驗培養(yǎng)的小球藻分別于冷凍干燥前后稱重，通過公式計算得出離心收集的濕藻泥含水率為58.78%，作后續(xù)試驗參考。

2.2單因素試驗結(jié)果

2.2.1萃取溫度對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取時間為4 min，氯仿-甲醇體積比為1∶1，研究萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響，結(jié)果見圖1。油脂提取量在130℃時達(dá)到最高，為8.12%。當(dāng)萃取溫度不高于130℃時，隨著萃取溫度的上升，油脂提取量呈上升趨勢，這是因為高溫可提高油脂在有機(jī)溶劑中的溶解度，同時加快了油脂在有機(jī)溶劑中的擴(kuò)散速率。值得注意的是，ASE的高溫是在高壓（8 963.1841 kPa）基礎(chǔ)上達(dá)到的，而高壓又能提高分子間共價鍵的穩(wěn)定性，阻礙油脂的降解［10］，對油脂有一定的保護(hù)作用。本研究中，當(dāng)溫度高于130℃時，油脂的熱降解效應(yīng)較大，并且隨著溫度的升高而增加，最終導(dǎo)致了油脂提取量的下降。Sch?fer［14］在用ASE提取谷物、雞蛋黃和雞胸肌的脂肪酸時，得到了類似的規(guī)律，即隨著萃取溫度的升高，提取量呈先增加后降低的趨勢。

圖1 萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響

2.2.2萃取時間對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取溫度為130℃，氯仿-甲醇體積比為1∶1，研究萃取時間對小球藻油脂提取量的影響，結(jié)果見圖2。隨著萃取時間的延長，油脂提取量逐漸上升后小幅下降。當(dāng)萃取時間為12 min時，油脂提取量最高，為12.67%。說明油脂長時間暴露于高溫高壓環(huán)境中時，也會出現(xiàn)一定的降解。

圖2 萃取時間對小球藻油脂提取量的影響

2.2.3氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取溫度為130℃，萃取時間為12 min，研究氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響，結(jié)果見圖3。油脂提取量最大為15.58%，此時氯仿-甲醇體積比為2∶1，與Folch法［4］的溶劑配比剛好相符。氯仿-甲醇體積比直接決定了混合液的極性，而溶質(zhì)與溶劑的相互作用遵循極性相似原則，即極性相似的物質(zhì)可以互溶，由此可推測小球藻細(xì)胞所含油脂的絕大部分，其極性與體積比為2∶1的氯仿-甲醇混合液相當(dāng)。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗

圖3 氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇各因素響應(yīng)值較高的水平區(qū)間（如萃取溫度，選擇120～140℃），運用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken模型進(jìn)行3因素3水平的試驗設(shè)計，得到17組試驗，結(jié)果見表3。從表3可以看出，各因素不同水平組合下的小球藻油脂提取量介于14.46%～16.06%之間。對所得的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多項式回歸擬合，得到小球藻油脂提取量對萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比的

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

回歸方程，即：

油脂提取量=16.01+0.066A+0.36B+0.016C+ 0.11AB+0.15AC+0.11BC-0.33A2-0.89B2-0.083C2。

對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4，模型P＜0.0001，達(dá)到極顯著水平，失擬項P=0.0821＞0.05，未達(dá)顯著水平，校正確定系數(shù)R2=0.9917，表明模型擬合度良好［15］，能較好地反映各因素水平對響應(yīng)值的影響，可用于預(yù)測小球藻油脂提取量。3個因素中萃取時間對油脂提取量的影響達(dá)到極顯著水平，萃取溫度達(dá)到顯著水平，氯仿-甲醇體積比則不顯著。因素間兩兩交互作用響應(yīng)面和等高線見圖4～圖6，其中等高線均為橢圓形，結(jié)合表4中交互作用的P值發(fā)現(xiàn)，3個因素兩兩交互作用對小球藻油脂提取量的影響均顯著。根據(jù)上述構(gòu)建的回歸方程求解，獲得了最大小球藻油脂提取量，為16.06%，對應(yīng)的最佳因素水平為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。采用軟件預(yù)測的最佳條件進(jìn)行試驗驗證，得到實際小球藻油脂提取量為16.10%，非常接近預(yù)測值，證明所建模型較好地預(yù)測了實際油脂提取情況。

表4 Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA）

圖4 萃取溫度和萃取時間對小球藻油脂提取量的影響的響應(yīng)面及等高線

圖5 萃取溫度和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應(yīng)面及等高線

圖6 萃取時間和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應(yīng)面及等高線

3　結(jié)論與討論

本研究構(gòu)建了擬合度良好的模型，能科學(xué)客觀地加速溶劑萃取法中萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響，模型預(yù)測的最佳組合為：萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1，預(yù)測的最大提取量為16.06%，實際試驗結(jié)果為16.10%，非常接近預(yù)測值，再次證明了模型的可靠性。

存量有限的石化能源持續(xù)被消耗，能源短缺日益加重，作為清潔可持續(xù)能源的微藻生物柴油備受矚目，但微藻生物柴油的技術(shù)瓶頸導(dǎo)致其工業(yè)化的成本相對較高，進(jìn)程比較緩慢。ASE作為一種新型提取方法可快速完成油脂的高效萃取，同時對有機(jī)溶劑的需求量較小，大大降低了時間和物質(zhì)成本，可以為微藻生物柴油的發(fā)展提供一定的助力。本研究用到的氯仿、甲醇溶劑雖可高效萃取油脂，但其毒性相對較大，故有必要尋找同樣高效且毒性較低的可替代溶劑來完善ASE，以加快微藻生物柴油的工業(yè)化進(jìn)程。

［1］ Chisti Y. Biodiesel from microalgae［J］. Biotechnology advances，2007，25（3）：294-306.

［2］ de Boer K，Moheimani N R，Borowitzka M A，et al. Extraction and conversion pathways for microalgae to biodiesel：a review focused on energy consumption［J］. Journal of AppliedPhycology，2012，24（6）：1681-1698.

［3］ Cheng C H，Du T B，Pi H C，et al. Comparative study of lipid extraction from microalgae by organic solvent and supercritical CO2［J］. BioresourceTechnology，2011，102（21）：10151-10153.

［4］ Folch J，Lees M，Sloane-Stanley G H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］. Journal of Biological Chemistry，1957，226：497-509.

［5］ Bligh E G，Dyer W J. A rapid method of total lipid extraction and purification［J］. Canadian journal of biochemistry and physiology，1959，37（8）：911-917.

［6］ Sheng J，Vannela R，Rittmann B E. Evaluation of methods to extract and quantify lipids from Synechocystis PCC 6803［J］. BioresourceTechnology，2011，102（2）：1697-1703.

［7］ dos Santos R R，Moreira D M，Kunigami C N，et al. Comparison between several methods of total lipid extraction from Chlorella vulgaris biomass ［J］. Ultrasonicssonochemistry，2015，22：95-99.

［8］ Babovic N，Djilas S，Jadranin M，et al. Supercritical carbon dioxide extraction of antioxidant fractions from selected Lamiaceae herbs and their antioxidant capacity［J］. Innovative Food Science & Emerging Technologies，2010，11（1）：98-107.

［9］ Zizovic I，Stameni? M，Orlovi? A，et al. Supercritical carbon dioxide essential oil extraction of Lamiaceae family species：Mathematical modelling on the micro-scale and process optimization［J］. Chemical Engineering Science，2005，60（23）：6747-6756.

［10］ Hossain M B，Barry-Ryan C，Martin-Diana A B，et al. Optimisation of accelerated solvent extraction of antioxidant compounds from rosemary（Rosmarinusofficinalis L.），marjoram（Origanummajorana L.）and oregano （Origanumvulgare L.）using response surface methodology ［J］. Food Chemistry，2011，126 （1）：339-346.

［11］ Richter B E，Jones B A，Ezzell J L，et al. Accelerated solvent extraction：a technique for sample preparation［J］. Analytical Chemistry，1996，68（6）：1033-1039.

［12］ Denery J R，Dragull K，Tang C S，et al. Pressurized fluid extraction of carotenoids from Haematococcuspluvialis and Dunaliellasalina and kavalactones from Piper methysticum ［J］. Analyticachimicaacta，2004，501（2）：175-181.

［13］ Wahlen B D，Willis R M，Seefeldt L C. Biodiesel production by simultaneous extraction and conversion of total lipids from microalgae，cyanobacteria，and wild mixed-cultures［J］. Bioresource Technology，2011，102（3）：2742-2730.

［14］ Sch?fer K. Accelerated solvent extraction of lipids for determining the fatty acid composition of biological material［J］.AnalyticaChimicaActa，1998，358（1）：69-77.

［15］ 歐陽輝，余佶，張永康. 纖維素酶提取湘西椪柑皮中總黃酮的工藝優(yōu)化研究［J］. 食品科學(xué)，2010，31（12）：67-70.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

Effects of different accelerated solvent extraction
conditions on lipids extraction from
Chlorella sorokiniana

ZHOU Lian-ning1，2，HAO Wen-long2，WU Shu-lian2，LI Kun2，WANG Bo1
（1. Shenzhen Key Laboratory for Coastal and Atmospheric Research，Shenzhen 518057，China）
（2. Shenzhen-HongKong Institution of Industry，Education&
Research Environmental Technique Co.，Ltd.，Shenzhen 518057，China）

Response surface analysis （Box-Behnken） was carried out to investigate the effects of three factors on lipids extraction from Chlorella sorokiniana using accelerated solvent extraction technique. Factors presented here were extraction temperature，extraction time and chloroform-methanol volume-ratio. Based on experimental data，ANOVA and quadratic regression reswts showed that， model was significant （P＜0.0001），in which lack of fit was not significant and R2was 0.9917，close to 1 and R2adj（0.9811）. ANOVA also indicated that the effects of extraction time and extraction temperature on lipids extraction were significant，while that of chloroform-methanol volume-ratio was not. Elliptic contour plots showed the presence of interaction between factors. The highest amount ofextract of predicted and experimental values were 16.06% and 16.10%，corresponding condition in which extraction temperature was 132.37℃，extraction time was 12.79 min and chloroform-methanol volume-ratio was 2.26∶1.

Chlorella sorokiniana；accelerated solvent extraction；response surface methodology；biodiesel

TK63

A

1004-874X（2016）07-0126-07

2015-12-29

國家自然科學(xué)基金（513080061006239）；深圳市科技計劃項目（JCYJ20140703164828240，JCYJ20140829093714177）

周連寧（1984-），男，碩士，工程師，E-mail：z.l.ning@163.com

王波（1979-），男，碩士，高級工程師，E-mail：wb@ierec.com