周連寧,郝文龍,吳屬連,李 錕,王 波(.深圳海岸與大氣研究重點實驗室,廣東 深圳 58057;.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司,廣東 深圳 58057)
不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究
周連寧1,2,郝文龍2,吳屬連2,李 錕2,王 波1
(1.深圳海岸與大氣研究重點實驗室,廣東 深圳 518057;
2.深圳市深港產(chǎn)學(xué)研環(huán)保工程技術(shù)股份有限公司,廣東 深圳 518057)
采用響應(yīng)曲面法對加速溶劑萃取法提取小球藻油脂過程的影響因素(萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比)進行研究。在試驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,通過方差分析和多項式回歸構(gòu)建擬合度良好的模型,模型顯著(P<0.0001),失擬項不顯著(P=0.0821),R2=0.9917,R2adj=0.9811,能客觀科學(xué)地反映小球藻油脂的真實萃取情況。方差分析還表明,萃取時間對油脂提取量的影響達到極顯著水平(P<0.0001),萃取溫度達到顯著水平(P=0.0496),氯仿-甲醇體積比則不顯著(P=0.5792)。橢圓形的等高線表明因素間存在兩兩相互作用,結(jié)合方差分析發(fā)現(xiàn),萃取溫度和氯仿-甲醇體積比的交互作用達到極顯著水平(P=0.0057)。模型預(yù)測的小球藻油脂最高提取量為16.06%,對應(yīng)各因素的水平為:萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。此條件下的實際油脂提取量為16.10%,接近預(yù)測值。
小球藻;加速溶劑萃取法;響應(yīng)面;生物柴油
周連寧,郝文龍,吳屬連,等. 不同加速溶劑萃取條件對小球藻油脂提取的影響研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,43(7):126-132.
隨著經(jīng)濟的發(fā)展,能源問題日益突顯,含油微藻作為一種清潔生物質(zhì)能源受到極大關(guān)注[1]。含油微藻是一種很有潛力的生物柴油原料,具有生長快、含油高、不占用耕地等優(yōu)點[2]。微藻油脂提取是產(chǎn)生物柴油的關(guān)鍵過程[3],其提取方法的優(yōu)化極為重要。Folch法[4]和Bligh-Dyer法[5]是兩種較經(jīng)典、傳統(tǒng)的有機溶劑提取方法,兩種方法均采用氯仿甲醇溶劑系統(tǒng),但溶劑配比不同。Sheng等[6]評估了多種溶劑及系統(tǒng)對集胞藻6803的油脂提取效率,發(fā)現(xiàn)基于氯仿-甲醇系統(tǒng)的Folch法和Bligh-Dyer法展現(xiàn)出最高的提取效率,可作為實驗室油脂提取方法的黃金標準。氯仿-甲醇對油脂的高效提取是因為該溶劑系統(tǒng)具有較好的細胞膜穿透能力和較合適的極性,并且其與氫鍵有較大的相互作用。當(dāng)微藻細胞處于正已烷、氯仿等非極性有機溶劑中時,溶劑會穿過細胞膜與胞質(zhì)中的中性脂質(zhì)(如甘油三酯)通過范德華力相互作用,形成“有機溶劑-中性脂質(zhì)”復(fù)合體,該復(fù)合體可順著有機溶劑濃度梯度擴散至細胞外圍的有機溶劑。部分中性脂質(zhì)與胞質(zhì)中的極性脂質(zhì)(如磷脂、糖脂)形成復(fù)合體,并通過氫鍵與細胞膜上的蛋白緊密相連,非極性有機溶劑與中性脂質(zhì)間的范德華力不足以破壞基于膜脂質(zhì)與蛋白間的聯(lián)系,但甲醇這類極性溶劑可以。故氯仿-甲醇混合液可保證中性脂質(zhì)的完全萃取,不論是以自由脂滴形式存在,還是以蛋白結(jié)合的復(fù)合體形式存在,在總脂萃取上展示了較高的效率[7]。雖然上述兩種經(jīng)典的有機溶劑提取方法油脂提取效率較高,但提取過程中的有毒溶劑使用量較大,耗時也較長,因此有必要尋找更快捷高效的提取方法。有學(xué)者認為超臨界CO2萃取法可取代傳統(tǒng)的有機溶劑提取法[8-9],因其采用超臨界CO2作為萃取溶劑,可快速提取油脂,而且避免使用有毒溶劑,具有環(huán)境友好性。但該法所用儀器昂貴,且對極性化合物的提取效率較低[10]。Richter等[11]于1996年研發(fā)出一套自動萃取的方法,即加速溶劑萃取法(Accelerated Solvent Extraction,ASE),該法用有機溶劑在高溫高壓下進行目標化合物的萃取,既提高了目標化合物的溶解度,加快了溶劑的擴散和物質(zhì)的遷移,同時也降低了溶劑的粘度和表面張力。相比于傳統(tǒng)方法和超臨界CO2法,ASE法所用的溶劑量少,萃取時間短,且可自動化運行,還可保持樣品處于無氧無光的環(huán)境中,有效降低了萃取物的降解[12]。本研究采用前人方法中可高效萃取油脂的氯仿-甲醇溶劑系統(tǒng),運用響應(yīng)曲面法對ASE中影響油脂提取的參數(shù)進行了優(yōu)化,為微藻生物柴油的發(fā)展提供參考。
1.1藻種培養(yǎng)與收集
供試藻種為小球藻(Chlorella sorokiniana),由深圳海岸與大氣研究重點實驗室保藏。
小球藻細胞置于液體BG-11培養(yǎng)基[13],在恒溫光照搖床(TS2112B,上海秣馬恒溫設(shè)備廠)中持續(xù)光照培養(yǎng),光照強度為2 000 lx,溫度為22℃,搖床轉(zhuǎn)速為80 r/min。培養(yǎng)至穩(wěn)定期后,6 000 r/min離心2 min收集藻細胞,再用去離子水洗滌3次,獲得的濕藻泥用于油脂提取。
1.2小球藻含水率的測定
離心收集藻細胞,用去離子水清洗3次后稱量,記錄濕重為M1(mg),之后放入臺式冷凍干燥機(FreeZone 2.5 L,Labconco)中,冷凍干燥完成后再次稱量,記錄干重為M2(mg),計算含水率:
1.3小球藻油脂的提取
采用ASE法提取小球藻的油脂。稱取適量藻細胞,重量記為M3(mg),將其置于萃取池中,待溶劑充滿萃取池后,壓強升高并恒定為8 963.1841 kPa;之后加熱萃取池,進行靜態(tài)萃??;沖洗體積設(shè)為60%,萃取溶劑、萃取溫度、萃取時間則按后續(xù)實驗設(shè)計設(shè)置。收集的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干大部分溶劑,剩余用氮氣吹干至恒重,稱量所得的油脂,記為M4(mg),計算小球藻油脂提取量:
1.4試驗設(shè)計
1.4.1單因素試驗設(shè)計 采用氯仿-甲醇雙溶劑系統(tǒng)萃取小球藻油脂,以小球藻油脂提取量為響應(yīng)值,對可能影響提取量的因素(萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比)進行單因子3水平試驗,具體試驗設(shè)計見表1。
表1 單因素變量試驗因素水平
1.4.2響應(yīng)面試驗設(shè)計 在單因素試驗基礎(chǔ)上,挑選各因素中油脂提取量較高的水平區(qū)間,運用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken模型,以小球藻油脂提取量為響應(yīng)值,進行3因素(萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比)3水平(-1、0、1)的響應(yīng)面試驗設(shè)計,以期獲得最優(yōu)參數(shù)組合,最大化油脂提取量。試驗各因素的水平賦值見表2。
表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計各因素水平
2.1小球藻含水率
試驗培養(yǎng)的小球藻分別于冷凍干燥前后稱重,通過公式計算得出離心收集的濕藻泥含水率為58.78%,作后續(xù)試驗參考。
2.2單因素試驗結(jié)果
2.2.1萃取溫度對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取時間為4 min,氯仿-甲醇體積比為1∶1,研究萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響,結(jié)果見圖1。油脂提取量在130℃時達到最高,為8.12%。當(dāng)萃取溫度不高于130℃時,隨著萃取溫度的上升,油脂提取量呈上升趨勢,這是因為高溫可提高油脂在有機溶劑中的溶解度,同時加快了油脂在有機溶劑中的擴散速率。值得注意的是,ASE的高溫是在高壓(8 963.1841 kPa)基礎(chǔ)上達到的,而高壓又能提高分子間共價鍵的穩(wěn)定性,阻礙油脂的降解[10],對油脂有一定的保護作用。本研究中,當(dāng)溫度高于130℃時,油脂的熱降解效應(yīng)較大,并且隨著溫度的升高而增加,最終導(dǎo)致了油脂提取量的下降。Sch?fer[14]在用ASE提取谷物、雞蛋黃和雞胸肌的脂肪酸時,得到了類似的規(guī)律,即隨著萃取溫度的升高,提取量呈先增加后降低的趨勢。
圖1 萃取溫度對小球藻油脂提取量的影響
2.2.2萃取時間對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取溫度為130℃,氯仿-甲醇體積比為1∶1,研究萃取時間對小球藻油脂提取量的影響,結(jié)果見圖2。隨著萃取時間的延長,油脂提取量逐漸上升后小幅下降。當(dāng)萃取時間為12 min時,油脂提取量最高,為12.67%。說明油脂長時間暴露于高溫高壓環(huán)境中時,也會出現(xiàn)一定的降解。
圖2 萃取時間對小球藻油脂提取量的影響
2.2.3氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響 設(shè)定萃取溫度為130℃,萃取時間為12 min,研究氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響,結(jié)果見圖3。油脂提取量最大為15.58%,此時氯仿-甲醇體積比為2∶1,與Folch法[4]的溶劑配比剛好相符。氯仿-甲醇體積比直接決定了混合液的極性,而溶質(zhì)與溶劑的相互作用遵循極性相似原則,即極性相似的物質(zhì)可以互溶,由此可推測小球藻細胞所含油脂的絕大部分,其極性與體積比為2∶1的氯仿-甲醇混合液相當(dāng)。
2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗
圖3 氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量的影響
在單因素試驗基礎(chǔ)上,選擇各因素響應(yīng)值較高的水平區(qū)間(如萃取溫度,選擇120~140℃),運用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken模型進行3因素3水平的試驗設(shè)計,得到17組試驗,結(jié)果見表3。從表3可以看出,各因素不同水平組合下的小球藻油脂提取量介于14.46%~16.06%之間。對所得的試驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸擬合,得到小球藻油脂提取量對萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比的
表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果
回歸方程,即:
油脂提取量=16.01+0.066A+0.36B+0.016C+ 0.11AB+0.15AC+0.11BC-0.33A2-0.89B2-0.083C2。
對該回歸模型進行方差分析,結(jié)果見表4,模型P<0.0001,達到極顯著水平,失擬項P=0.0821>0.05,未達顯著水平,校正確定系數(shù)R2=0.9917,表明模型擬合度良好[15],能較好地反映各因素水平對響應(yīng)值的影響,可用于預(yù)測小球藻油脂提取量。3個因素中萃取時間對油脂提取量的影響達到極顯著水平,萃取溫度達到顯著水平,氯仿-甲醇體積比則不顯著。因素間兩兩交互作用響應(yīng)面和等高線見圖4~圖6,其中等高線均為橢圓形,結(jié)合表4中交互作用的P值發(fā)現(xiàn),3個因素兩兩交互作用對小球藻油脂提取量的影響均顯著。根據(jù)上述構(gòu)建的回歸方程求解,獲得了最大小球藻油脂提取量,為16.06%,對應(yīng)的最佳因素水平為:萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1。采用軟件預(yù)測的最佳條件進行試驗驗證,得到實際小球藻油脂提取量為16.10%,非常接近預(yù)測值,證明所建模型較好地預(yù)測了實際油脂提取情況。
表4 Box-Behnken試驗數(shù)據(jù)方差分析(ANOVA)
圖4 萃取溫度和萃取時間對小球藻油脂提取量的影響的響應(yīng)面及等高線
圖5 萃取溫度和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應(yīng)面及等高線
圖6 萃取時間和氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取量影響的響應(yīng)面及等高線
本研究構(gòu)建了擬合度良好的模型,能科學(xué)客觀地加速溶劑萃取法中萃取溫度、萃取時間、氯仿-甲醇體積比對小球藻油脂提取的影響,模型預(yù)測的最佳組合為:萃取溫度132.37℃、萃取時間12.79 min、氯仿-甲醇體積比2.26∶1,預(yù)測的最大提取量為16.06%,實際試驗結(jié)果為16.10%,非常接近預(yù)測值,再次證明了模型的可靠性。
存量有限的石化能源持續(xù)被消耗,能源短缺日益加重,作為清潔可持續(xù)能源的微藻生物柴油備受矚目,但微藻生物柴油的技術(shù)瓶頸導(dǎo)致其工業(yè)化的成本相對較高,進程比較緩慢。ASE作為一種新型提取方法可快速完成油脂的高效萃取,同時對有機溶劑的需求量較小,大大降低了時間和物質(zhì)成本,可以為微藻生物柴油的發(fā)展提供一定的助力。本研究用到的氯仿、甲醇溶劑雖可高效萃取油脂,但其毒性相對較大,故有必要尋找同樣高效且毒性較低的可替代溶劑來完善ASE,以加快微藻生物柴油的工業(yè)化進程。
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(責(zé)任編輯 崔建勛)
Effects of different accelerated solvent extraction
conditions on lipids extraction from
Chlorella sorokiniana
ZHOU Lian-ning1,2,HAO Wen-long2,WU Shu-lian2,LI Kun2,WANG Bo1
(1. Shenzhen Key Laboratory for Coastal and Atmospheric Research,Shenzhen 518057,China)
(2. Shenzhen-HongKong Institution of Industry,Education&
Research Environmental Technique Co.,Ltd.,Shenzhen 518057,China)
Response surface analysis (Box-Behnken) was carried out to investigate the effects of three factors on lipids extraction from Chlorella sorokiniana using accelerated solvent extraction technique. Factors presented here were extraction temperature,extraction time and chloroform-methanol volume-ratio. Based on experimental data,ANOVA and quadratic regression reswts showed that, model was significant (P<0.0001),in which lack of fit was not significant and R2was 0.9917,close to 1 and R2adj(0.9811). ANOVA also indicated that the effects of extraction time and extraction temperature on lipids extraction were significant,while that of chloroform-methanol volume-ratio was not. Elliptic contour plots showed the presence of interaction between factors. The highest amount ofextract of predicted and experimental values were 16.06% and 16.10%,corresponding condition in which extraction temperature was 132.37℃,extraction time was 12.79 min and chloroform-methanol volume-ratio was 2.26∶1.
Chlorella sorokiniana;accelerated solvent extraction;response surface methodology;biodiesel
TK63
A
1004-874X(2016)07-0126-07
2015-12-29
國家自然科學(xué)基金(513080061006239);深圳市科技計劃項目(JCYJ20140703164828240,JCYJ20140829093714177)
周連寧(1984-),男,碩士,工程師,E-mail:z.l.ning@163.com
王波(1979-),男,碩士,高級工程師,E-mail:wb@ierec.com