鐘楊生，陳恒文，林碧敏，林健榮，陳芳艷（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 5064；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 5064）

桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

鐘楊生1，陳恒文1，林碧敏2，林健榮1，陳芳艷1
（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；
2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，廣東 廣州 510642）

利用逐因子試驗(yàn)和 Box-Behnken試驗(yàn)，以水為溶劑對(duì)桑葉γ-氨基丁酸（GABA）的萃取工藝進(jìn)行了條件優(yōu)化研究。結(jié)果表明，最佳提取條件為，桑葉粉∶水=1（g）∶30（mL），提取溫度50℃，提取時(shí)間2.13 h，此工藝條件下提取率為0.464%，其中影響因素貢獻(xiàn)率為提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。

桑葉；γ-氨基丁酸；提?。籅ox-Behnken試驗(yàn)

鐘楊生，陳恒文，林碧敏，等. 桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（7）：120-125.

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱GABA）是一種具有重要生理功能的活性物質(zhì)，在動(dòng)物中有降血壓、抗驚厥、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流、增進(jìn)腦活力、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌、健肝利腎的作用，是哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)［1-5］。GABA在植物的抗逆中也發(fā)揮著積極的生理活性作用［6-8］。由于具有多種特殊的功能，GABA越來(lái)越引起醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)的關(guān)注，成為開發(fā)研究的熱點(diǎn)。

經(jīng)研究，發(fā)現(xiàn)作為藥食同源的桑葉富含GABA，尤其在桑嫩芽中含量高［9-11］。桑樹在我國(guó)種植廣泛，而且具有易種植、生產(chǎn)成本低、全年生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)量高的資源優(yōu)勢(shì)，利用桑葉挖掘、發(fā)展新的GABA生物新材料，開發(fā)GABA功能食品和保健品，對(duì)拓展我國(guó)桑葉在非絹絲產(chǎn)業(yè)上的新用途是一種創(chuàng)新性的研究。響應(yīng)面分析（Response Surface Methodology，RSM）廣泛應(yīng)用于提取方法的優(yōu)化。作為響應(yīng)面分析方法之一，Box-Behnken Design （BBD）是一種不包含嵌入因子或部分因子的獨(dú)立二次設(shè)計(jì)［12］。由于可以建立二次響應(yīng)面，BBD方法比其他響應(yīng)面設(shè)計(jì)容易安排和解釋實(shí)驗(yàn)，并且效率更高［13］，已成功應(yīng)用于從天然材料中提取多酚類物質(zhì)的條件優(yōu)化［14］。本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法研究桑葉GABA的提取工藝條件，為后續(xù)功能食品和保健品的開發(fā)提供技術(shù)和工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

抗青10號(hào)桑葉，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供，60℃干燥粉碎后置于4℃條件下冷藏備用。

γ-氨基丁酸，美國(guó)Sigma公司；無(wú)水甲醇、次氯酸鈉、重蒸酚、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、三氯化鑭、三氯化鋁、醋酸鉛、鹽酸、NaOH、正丁醇、醋酸、丙酮、鹽酸、氨水等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1GABA含量的測(cè)定 參照冀憲領(lǐng)改進(jìn)的Berthelot法［9］測(cè)定GABA含量。稱取0.1000 g GABA標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水定容至100 mL，標(biāo)樣濃度為1 mg/mL。分別取待用標(biāo)樣0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于2 mL離心管中，加蒸餾水至1 mL，然后加入120 μL的1 mol/L LaCl3溶液，震蕩混勻15 min，12 000 r/min離心5 min；取上清500 μL于1.5 mL離心管中，加入300 μL 的1 mol/L KOH溶液，震蕩混勻5 min，12 000 r/min離心5 min；取上清600 μL置于15 mL具塞試管中，分別依次加入400 μL碳酸鹽緩沖液（pH值為10）、200 μL 60%重蒸酚溶液、1 mL 7.5%NaClO溶液，充分混勻，旋緊管塞，置于100℃水浴中恒溫反應(yīng)10 min后置冰浴中10 min；分別向各試管中加入4 mL 60%乙醇溶液，在645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程y=0.6827x+0.0249（R2=0.9923），表明GABA濃度與吸光度具有良好的線性。取適量樣品溶液測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品每克干桑葉中GABA的含量。

1.2.2桑葉GABA水提取法的單因素試驗(yàn) 桑葉粉的預(yù)處理：取桑葉粉，用甲醇脫色、50℃干燥后備用。

（1）提取溫度對(duì)桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經(jīng)預(yù)處理的桑葉粉6份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在溫度為20、30、40、50、60、70℃的條件下提取2 h，提取1次，然后測(cè)定提取液中GABA的含量。

（2）不同料液比對(duì)桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經(jīng)預(yù)處理的桑葉粉6份，按料液比（g∶ mL）：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水，在50℃的條件下提取2 h，提取1次，然后過(guò)濾，測(cè)定提取液中GABA的含量。

（3）提取時(shí)間對(duì)桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經(jīng)預(yù)處理的桑葉粉6份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在50℃條件下分別提取1 、2 、3 、4 、5 、6 h，提取1次，然后測(cè)定提取液中GABA的含量。

（4）提取次數(shù)對(duì)桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經(jīng)預(yù)處理的桑葉粉3份，按料液比1（g）∶20（ mL）加水，在50℃條件下分別提取1、2、3次，每次2 h，然后測(cè)定提取液中GABA的含量。

1.2.3BBD法組合優(yōu)化提取條件 在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取適當(dāng)?shù)囊蛩厮?，根?jù)表1進(jìn)行BBD法組合優(yōu)化，優(yōu)選出提取桑葉GABA的最適條件和方法。

表1 傳統(tǒng)水提取法Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

采用Design-Expert V8. 0. 6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1桑葉GABA提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1最適溫度 在20～70℃不同溫度條件下抽提桑葉GABA，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在20～50℃之間抽提2 h， GABA的得率隨著溫度的升高而增加，50℃以后反而略有減少，其原因可能是溫度過(guò)高使GABA發(fā)生降解。因此50℃為最佳提取溫度。

圖1 溫度對(duì)GABA提取效果的影響

2.1.2料液比 在確立50℃為最佳提取溫度后，進(jìn)一步優(yōu)選最佳的料液比關(guān)系，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，料液比在小于1（g）∶30 （mL）之前GABA的提取率逐步遞增，之后變化不大，說(shuō)明在料液比為1（g）∶30（mL）時(shí)，桑葉中的GABA提取已較完全，繼續(xù)增大料液比，對(duì)提取率的影響不大，反而會(huì)增加后續(xù)濃縮工作量，因此最佳料液比為1（g）∶30 （mL）。

圖2 料液比對(duì)GABA提取效果的影響

2.1.3提取時(shí)間 不同提取時(shí)間對(duì)桑葉GABA提取率的影響見圖3。由圖3可知，提取1～3 h內(nèi)，隨時(shí)間的增加，GABA的提取率增加，超過(guò)3 h，產(chǎn)量不但不再增加，反而稍有下降，這可能因長(zhǎng)時(shí)間在50℃條件下處理對(duì)GABA造成破壞，使其降解。因此，選擇提取桑葉GABA的最佳時(shí)間為3 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)GABA提取效果的影響

2.1.4提取次數(shù) 對(duì)3次抽提的桑葉GABA總量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，第1次抽提的得率占88%，第2次占9%，第3次占3%，說(shuō)明提取1次即可得到大部分的GABA。從節(jié)省提取成本、提高提取工效的角度考慮，抽提1次即可。

2.2響應(yīng)面曲線優(yōu)化提取工藝

采用BBD法優(yōu)化桑葉GABA的提取條件。對(duì)表2 結(jié)果作統(tǒng)計(jì)分析，建立三元二次回歸方程：

分析提取量與料液比（X1）、溫度（X2）和提取時(shí)間（X3）3個(gè)因子對(duì)桑葉GABA提取得率的影響，方差分析結(jié)果（表3）表明，該模型項(xiàng)回歸極顯著，R2=0.9678，表明該模型與試驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可以用于桑葉GABA水提取試驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。在P=0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化方程為：

2.2.1提取條件因子間的互作效應(yīng)分析 從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，料液比（X1）與提取時(shí)間（X3）的互作效應(yīng)對(duì)桑葉GABA提取的影響明顯，對(duì)其作響應(yīng)面圖如圖4所示。從圖4可知，在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，料液比和提取時(shí)間都可增加桑葉GABA提取率，二者交互作用表現(xiàn)為桑葉GABA提取量的增大。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)桑葉GABA水提法的提取結(jié)果

表3 水提法Box-Behnken組合試驗(yàn)回歸分析

圖4 料液比（X1）和提取時(shí)間（X3）對(duì)桑葉 GABA提取的交互作用

2.2.2各因素的重要性分析 采用貢獻(xiàn)率法對(duì)各因素的重要性進(jìn)行分析：設(shè)各回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)的均方比為F （j）、F（ij）、F（jj）。各因素對(duì)指標(biāo)的貢獻(xiàn)率可表示為：據(jù)表3均方比（F），通過(guò)上述公式計(jì)算可知，料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)提取率的貢獻(xiàn)率分別為Δ1= 2.2936、Δ2= 1.6249、Δ3= 2.2987，可見對(duì)桑葉GABA提取率的貢獻(xiàn)大小依次為提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。

2.2.3傳統(tǒng)水提取桑葉GABA條件參數(shù)的優(yōu)化

組合及表證檢驗(yàn) 通過(guò)SAS響應(yīng)面分析，并結(jié)合數(shù)學(xué)模型水提取桑葉GABA的條件參數(shù)，最優(yōu)組合為：料液比1∶30、提取溫度50℃、提取時(shí)間為2.13 h。在此工藝條件下桑葉GABA提取的理論值為0.464%。為進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行GABA提取，實(shí)際測(cè)得桑葉GABA提取量為0.458%，與理論值相近。因此，優(yōu)化出的浸提條件參數(shù)可行。

3　結(jié)語(yǔ)

我國(guó)桑樹資源豐富，開發(fā)桑葉GABA產(chǎn)品，提取是關(guān)鍵。為了獲得最高的提取率，進(jìn)行了桑葉GABA提取的單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究。從單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，以蒸餾水為溶液、料液比1（g）∶30（ mL）、50℃、提取3 h、提取1次時(shí)，可較好提取桑葉GABA。為進(jìn)一步優(yōu)化工藝，選擇萃取溫度（X1）、萃取時(shí)間（X2）和料液比（X3）進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)并借助 Design-Expert軟件對(duì)模型進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，得到響應(yīng)值與自變量的響應(yīng)優(yōu)化方程為：Y1=4.641667+0.178375X1+0.189375X3-0.788958X12-0.46275X1X3-0.522208X22-0.604458X32。

通過(guò)方程推算，得到試驗(yàn)水平實(shí)際因子為料液比1（g）∶30（ mL）、提取溫度50℃、提取時(shí)間2.13 h，此工藝條件下提取率為0.464%，其中影響因素貢獻(xiàn)率：提取時(shí)間＞料液比＞提取溫度。

本方法提取溫度低，提取過(guò)程活性物質(zhì)不會(huì)受高溫影響而破壞，提取過(guò)程中無(wú)需專門的提取設(shè)備，方法簡(jiǎn)便，易操作。

［1］ Streeter J G，Thompson J F.In vivo and in vitro studies on γ-aminobutyric acid metabolism with the radish plant（Raphanus sativus L.）［J］. Plant Physiol，1972（49）：579-584.

［2］ Grunwald C，Rundfeldt C，Lankau H J，et al. Synthesis，phar- macology，and structureactivlty relationships of novel imidazolones and pyrrolones as modulators of GABA A receptors ［J］.Journal of Medic-inal Chemistry，2006 （49）：1855-1866.

［3］ Rosen A，Bali M，Horenstein J，et al.Channel opening by anestheticsand GABA induces similar changes in the GABAA receptor M2 seg-ment ［J］.Biophys J，2007，92（9）：3130-3139.

［4］ 劉臣海.抑制性神經(jīng)遞質(zhì)—γ-氨基丁酸（GABA）對(duì)膽管癌細(xì)胞株QBC939增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機(jī)制的研究［D］.合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2008：1-6.

［5］ 沈鼎烈，謝代鑫.抗癲癇藥物與γ-氨基丁酸［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，1991（3）：118-121.

［6］ Crawford L A，Bown A W，Breitkreuz K E，et al.The synthesis of γ-aminobutyric acid in response to treatments reducing cytosolic pH［J］. Plant Physiol，1994（104）：865-871.

［7］ Satyanarayan V，Nair P M.Metabolism，enzymology and possible roles of 4-aminobutyrate in higher plants［J］.Phytochem，1990，（29）：367-375.

［8］ Kathiresan A，Miranda J，Chinnappa C C，et al. γ-aminobutyric acid promotes stem elongation in Stellaria longipes：the role of ethylene［J］.Plant Growth Regul，1998，（26）：131-137.

［9］ 冀憲領(lǐng)，蓋英萍，陳恒文，等. 桑葉中γ-氨基丁酸含量的測(cè)定及其影響因素的研究［J］. 蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（2）：176-180.

［10］ 劉金波，陳芳艷，林碧敏，等. 桑葉γ-氨基丁酸含量的分析［J］. 廣東蠶業(yè)，2014，48（4）：30-33.

［11］ 陳恒文，林碧敏，鐘楊生，等.桑樹 γ- 氨基丁酸含量的檢測(cè)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012 （13）：137-142.

［12］ Zhu C P， Liu X L. Optimization of extraction process of crude polysaccharides from Pomegranate peel by response surface methodology［J］. Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1197e1202.

［13］ Li J R，Li M，Xia B，et al. Efficient optimization of ultra-high- performance supercritical fluid chromatographic separation of Rosa sericea by response surface methodology［J］. Journal of Separation Science，2013，36（13）：2114-2120.

［14］ Yue T L，Shao D Y，Yuan Y H，et al. Ultrasoundassisted extraction，HPLC analysis，and antioxidant activity of polyphenols from unripe apple［J］. Journal of Separation Science，2012，35（16）：2138-2145.

（責(zé)任編輯 崔建勛）

Optimization of γ-aminobutyric acid extraction from mulberry leaf by response surface methodology

ZHONG Yang-sheng1，CHEN Heng-wen1，LIN Bi-min2，LIN Jian-rong1，CHEN Fang-yan1
（1.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Public Basic Courses Experimental Teaching Center，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

By seriatim-factorial experiment and Box-Behnken test，the extraction conditions of γ-aminobutyric acid（GABA） from mulberry leaf with water were optimized. The results showed that the extraction rate was 0.464% under the following modification conditions： the ratio of mulberry leaf powder to water was 1（g）∶30（mL） and treated at 50℃ for 2.13 h. The order of the factors influencing the result was extraction time＞ratio of mulberry leaf powder to water＞temperature.

mulberry leaf；γ-aminobutyric acid（GABA）；extraction；Box-Behnken test

S888.2

A

1004-874X（2016）07-0120-06

2016-03-04

國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201403064）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-22）； 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B060400014， 2014A020208120）

鐘楊生（1973-），男，博士，講師，E-mail：zhongyangsh@scau.edu.cn

陳芳艷（1971-），女，博士，副教授，E-mail：chenfangyan@scau.edu.cn