鐘楊生,陳恒文,林碧敏,林健榮,陳芳艷(.華南農業(yè)大學動物科學學院,廣東 廣州 5064;.華南農業(yè)大學公共基礎課實驗教學中心,廣東 廣州 5064)
桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應面優(yōu)化
鐘楊生1,陳恒文1,林碧敏2,林健榮1,陳芳艷1
(1.華南農業(yè)大學動物科學學院,廣東 廣州 510642;
2.華南農業(yè)大學公共基礎課實驗教學中心,廣東 廣州 510642)
利用逐因子試驗和 Box-Behnken試驗,以水為溶劑對桑葉γ-氨基丁酸(GABA)的萃取工藝進行了條件優(yōu)化研究。結果表明,最佳提取條件為,桑葉粉∶水=1(g)∶30(mL),提取溫度50℃,提取時間2.13 h,此工藝條件下提取率為0.464%,其中影響因素貢獻率為提取時間>料液比>提取溫度。
桑葉;γ-氨基丁酸;提?。籅ox-Behnken試驗
鐘楊生,陳恒文,林碧敏,等. 桑葉γ-氨基丁酸提取工藝的響應面優(yōu)化[J].廣東農業(yè)科學,2016,43(7):120-125.
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,簡稱GABA)是一種具有重要生理功能的活性物質,在動物中有降血壓、抗驚厥、促使精神安定、促進腦部血流、增進腦活力、營養(yǎng)神經細胞、促進生長激素分泌、健肝利腎的作用,是哺乳動物神經中樞的一種抑制性遞質[1-5]。GABA在植物的抗逆中也發(fā)揮著積極的生理活性作用[6-8]。由于具有多種特殊的功能,GABA越來越引起醫(yī)藥、食品、化工、農業(yè)等行業(yè)的關注,成為開發(fā)研究的熱點。
經研究,發(fā)現(xiàn)作為藥食同源的桑葉富含GABA,尤其在桑嫩芽中含量高[9-11]。桑樹在我國種植廣泛,而且具有易種植、生產成本低、全年生長時間長、產量高的資源優(yōu)勢,利用桑葉挖掘、發(fā)展新的GABA生物新材料,開發(fā)GABA功能食品和保健品,對拓展我國桑葉在非絹絲產業(yè)上的新用途是一種創(chuàng)新性的研究。響應面分析(Response Surface Methodology,RSM)廣泛應用于提取方法的優(yōu)化。作為響應面分析方法之一,Box-Behnken Design (BBD)是一種不包含嵌入因子或部分因子的獨立二次設計[12]。由于可以建立二次響應面,BBD方法比其他響應面設計容易安排和解釋實驗,并且效率更高[13],已成功應用于從天然材料中提取多酚類物質的條件優(yōu)化[14]。本試驗應用響應面優(yōu)化法研究桑葉GABA的提取工藝條件,為后續(xù)功能食品和保健品的開發(fā)提供技術和工藝參數(shù)。
1.1試驗材料
抗青10號桑葉,由華南農業(yè)大學動物科學學院提供,60℃干燥粉碎后置于4℃條件下冷藏備用。
γ-氨基丁酸,美國Sigma公司;無水甲醇、次氯酸鈉、重蒸酚、氫氧化鉀、無水乙醇、三氯化鑭、三氯化鋁、醋酸鉛、鹽酸、NaOH、正丁醇、醋酸、丙酮、鹽酸、氨水等均為國產分析純試劑。
1.2試驗方法
1.2.1GABA含量的測定 參照冀憲領改進的Berthelot法[9]測定GABA含量。稱取0.1000 g GABA標準品用蒸餾水定容至100 mL,標樣濃度為1 mg/mL。分別取待用標樣0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL于2 mL離心管中,加蒸餾水至1 mL,然后加入120 μL的1 mol/L LaCl3溶液,震蕩混勻15 min,12 000 r/min離心5 min;取上清500 μL于1.5 mL離心管中,加入300 μL 的1 mol/L KOH溶液,震蕩混勻5 min,12 000 r/min離心5 min;取上清600 μL置于15 mL具塞試管中,分別依次加入400 μL碳酸鹽緩沖液(pH值為10)、200 μL 60%重蒸酚溶液、1 mL 7.5%NaClO溶液,充分混勻,旋緊管塞,置于100℃水浴中恒溫反應10 min后置冰浴中10 min;分別向各試管中加入4 mL 60%乙醇溶液,在645 nm波長下測定吸光值。根據(jù)標準曲線得到回歸方程y=0.6827x+0.0249(R2=0.9923),表明GABA濃度與吸光度具有良好的線性。取適量樣品溶液測定吸光度,通過標準曲線計算樣品每克干桑葉中GABA的含量。
1.2.2桑葉GABA水提取法的單因素試驗 桑葉粉的預處理:取桑葉粉,用甲醇脫色、50℃干燥后備用。
(1)提取溫度對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份,按料液比1(g)∶20( mL)加水,在溫度為20、30、40、50、60、70℃的條件下提取2 h,提取1次,然后測定提取液中GABA的含量。
(2)不同料液比對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份,按料液比(g∶ mL):1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸餾水,在50℃的條件下提取2 h,提取1次,然后過濾,測定提取液中GABA的含量。
(3)提取時間對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉6份,按料液比1(g)∶20( mL)加水,在50℃條件下分別提取1 、2 、3 、4 、5 、6 h,提取1次,然后測定提取液中GABA的含量。
(4)提取次數(shù)對桑葉GABA提取率的影響。分別取2 g經預處理的桑葉粉3份,按料液比1(g)∶20( mL)加水,在50℃條件下分別提取1、2、3次,每次2 h,然后測定提取液中GABA的含量。
1.2.3BBD法組合優(yōu)化提取條件 在以上單因素試驗的基礎上,選取適當?shù)囊蛩厮?,根?jù)表1進行BBD法組合優(yōu)化,優(yōu)選出提取桑葉GABA的最適條件和方法。
表1 傳統(tǒng)水提取法Box-Behnken試驗因素水平
采用Design-Expert V8. 0. 6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。
2.1桑葉GABA提取的單因素試驗
2.1.1最適溫度 在20~70℃不同溫度條件下抽提桑葉GABA,結果見圖1。由圖1可知,在20~50℃之間抽提2 h, GABA的得率隨著溫度的升高而增加,50℃以后反而略有減少,其原因可能是溫度過高使GABA發(fā)生降解。因此50℃為最佳提取溫度。
圖1 溫度對GABA提取效果的影響
2.1.2料液比 在確立50℃為最佳提取溫度后,進一步優(yōu)選最佳的料液比關系,結果見圖2。從圖2可以看出,料液比在小于1(g)∶30 (mL)之前GABA的提取率逐步遞增,之后變化不大,說明在料液比為1(g)∶30(mL)時,桑葉中的GABA提取已較完全,繼續(xù)增大料液比,對提取率的影響不大,反而會增加后續(xù)濃縮工作量,因此最佳料液比為1(g)∶30 (mL)。
圖2 料液比對GABA提取效果的影響
2.1.3提取時間 不同提取時間對桑葉GABA提取率的影響見圖3。由圖3可知,提取1~3 h內,隨時間的增加,GABA的提取率增加,超過3 h,產量不但不再增加,反而稍有下降,這可能因長時間在50℃條件下處理對GABA造成破壞,使其降解。因此,選擇提取桑葉GABA的最佳時間為3 h。
圖3 提取時間對GABA提取效果的影響
2.1.4提取次數(shù) 對3次抽提的桑葉GABA總量進行分析發(fā)現(xiàn),第1次抽提的得率占88%,第2次占9%,第3次占3%,說明提取1次即可得到大部分的GABA。從節(jié)省提取成本、提高提取工效的角度考慮,抽提1次即可。
2.2響應面曲線優(yōu)化提取工藝
采用BBD法優(yōu)化桑葉GABA的提取條件。對表2 結果作統(tǒng)計分析,建立三元二次回歸方程:
分析提取量與料液比(X1)、溫度(X2)和提取時間(X3)3個因子對桑葉GABA提取得率的影響,方差分析結果(表3)表明,該模型項回歸極顯著,R2=0.9678,表明該模型與試驗擬合較好,自變量與響應值線性關系顯著,可以用于桑葉GABA水提取試驗的理論預測。在P=0.05顯著水平下剔除不顯著項,得到優(yōu)化方程為:
2.2.1提取條件因子間的互作效應分析 從回歸系數(shù)的顯著性檢驗可以看出,料液比(X1)與提取時間(X3)的互作效應對桑葉GABA提取的影響明顯,對其作響應面圖如圖4所示。從圖4可知,在所設計的試驗條件范圍內,料液比和提取時間都可增加桑葉GABA提取率,二者交互作用表現(xiàn)為桑葉GABA提取量的增大。
表2 Box-Behnken試驗設計桑葉GABA水提法的提取結果
表3 水提法Box-Behnken組合試驗回歸分析
圖4 料液比(X1)和提取時間(X3)對桑葉 GABA提取的交互作用
2.2.2各因素的重要性分析 采用貢獻率法對各因素的重要性進行分析:設各回歸系數(shù)顯著性檢驗的均方比為F (j)、F(ij)、F(jj)。各因素對指標的貢獻率可表示為:據(jù)表3均方比(F),通過上述公式計算可知,料液比、提取溫度和提取時間對提取率的貢獻率分別為Δ1= 2.2936、Δ2= 1.6249、Δ3= 2.2987,可見對桑葉GABA提取率的貢獻大小依次為提取時間>料液比>提取溫度。
2.2.3傳統(tǒng)水提取桑葉GABA條件參數(shù)的優(yōu)化
組合及表證檢驗 通過SAS響應面分析,并結合數(shù)學模型水提取桑葉GABA的條件參數(shù),最優(yōu)組合為:料液比1∶30、提取溫度50℃、提取時間為2.13 h。在此工藝條件下桑葉GABA提取的理論值為0.464%。為進一步檢驗響應面分析法的可靠性,采用上述最優(yōu)條件進行GABA提取,實際測得桑葉GABA提取量為0.458%,與理論值相近。因此,優(yōu)化出的浸提條件參數(shù)可行。
我國桑樹資源豐富,開發(fā)桑葉GABA產品,提取是關鍵。為了獲得最高的提取率,進行了桑葉GABA提取的單因素實驗和響應面試驗研究。從單因素試驗結果表明,以蒸餾水為溶液、料液比1(g)∶30( mL)、50℃、提取3 h、提取1次時,可較好提取桑葉GABA。為進一步優(yōu)化工藝,選擇萃取溫度(X1)、萃取時間(X2)和料液比(X3)進行Box-Behnken響應面試驗并借助 Design-Expert軟件對模型進行多項式擬合,得到響應值與自變量的響應優(yōu)化方程為:Y1=4.641667+0.178375X1+0.189375X3-0.788958X12-0.46275X1X3-0.522208X22-0.604458X32。
通過方程推算,得到試驗水平實際因子為料液比1(g)∶30( mL)、提取溫度50℃、提取時間2.13 h,此工藝條件下提取率為0.464%,其中影響因素貢獻率:提取時間>料液比>提取溫度。
本方法提取溫度低,提取過程活性物質不會受高溫影響而破壞,提取過程中無需專門的提取設備,方法簡便,易操作。
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(責任編輯 崔建勛)
Optimization of γ-aminobutyric acid extraction from mulberry leaf by response surface methodology
ZHONG Yang-sheng1,CHEN Heng-wen1,LIN Bi-min2,LIN Jian-rong1,CHEN Fang-yan1
(1.College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Public Basic Courses Experimental Teaching Center,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)
By seriatim-factorial experiment and Box-Behnken test,the extraction conditions of γ-aminobutyric acid(GABA) from mulberry leaf with water were optimized. The results showed that the extraction rate was 0.464% under the following modification conditions: the ratio of mulberry leaf powder to water was 1(g)∶30(mL) and treated at 50℃ for 2.13 h. The order of the factors influencing the result was extraction time>ratio of mulberry leaf powder to water>temperature.
mulberry leaf;γ-aminobutyric acid(GABA);extraction;Box-Behnken test
S888.2
A
1004-874X(2016)07-0120-06
2016-03-04
國家公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201403064);國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-22); 廣東省科技計劃項目(2012B060400014, 2014A020208120)
鐘楊生(1973-),男,博士,講師,E-mail:zhongyangsh@scau.edu.cn
陳芳艷(1971-),女,博士,副教授,E-mail:chenfangyan@scau.edu.cn