張楠　偰光華

[摘要]目的分析缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對糖酵解的影響。方法分別以不同濃度的氯化鈷溶液誘導(dǎo)的缺氧條件下培養(yǎng)膽管癌QBC939細(xì)胞，測定并比較培養(yǎng)24h后各組細(xì)胞HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平和乳酸分泌量。結(jié)果缺氧組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于常氧組，膽管癌QBC939細(xì)胞24h乳酸分泌量，隨氯化鈷濃度逐漸增加，且均顯著高于常氧培養(yǎng)時分泌的乳酸量，比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析，PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關(guān)（r=0.436，P=0.002）。結(jié)論缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平顯著提高，且均在膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高過程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]缺氧誘導(dǎo)因子-1α；M2型丙酮酸激酶；膽管癌；糖酵解

[中圖分類號]R735.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）05-34-03

膽管癌是十分常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)源于膽管上皮細(xì)胞，在所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤的患者中占到3%，以低分化膽管癌為主，有男性發(fā)病率高于女性，60～65歲人群中高發(fā)的特點[2-41。本文就氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧條件下，人膽管癌QBc939細(xì)胞中HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)變化情況進(jìn)行分析，并探討其對糖酵解的影響情況?，F(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇人類膽管癌細(xì)胞株OBC939（購自上海和元生物技術(shù)有限公司）作為實驗細(xì)胞株，以氯化鈷為缺氧模擬劑誘導(dǎo)缺氧條件。

1.2方法

將購買的在液氮中凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇和傳代處理，其中，細(xì)胞的復(fù)蘇主要包括恒溫水浴融化、DMSO稀釋、離心分離、DMEM培養(yǎng)基（含1%青鏈霉素以及10%FBS的混合液）加入、細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)等步驟；細(xì)胞傳代則是在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%～90%時，用含EDTA的胰蛋白酶消化、細(xì)胞懸浮、離心分離后轉(zhuǎn)移并在含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，按1：3～1：5的比例傳代。再次經(jīng)消化、分離、懸浮、冷凍后保存。

選取已傳3～4代，生長狀態(tài)良好的膽管癌QBC939細(xì)胞接種培養(yǎng)，并行分組處理。常氧培養(yǎng)是在37℃、5%CO₂、飽和濕度的條件下將膽管癌QBC939細(xì)胞放入DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將其作為對照組；觀察組則是將膽管癌QBC939細(xì)胞置于含缺氧模擬劑的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，缺氧模擬劑為氯化鈷，分設(shè)氯化鈷濃度為100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L等四，J、組，培養(yǎng)24h后收獲細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞蛋白提取與濃度測定（BCA法）對不同條件下缺氧誘導(dǎo)因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人膽管癌QBC939細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。

同時，收集常氧狀態(tài)下與缺氧24h后不同小組組內(nèi)人膽管癌QBC939細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用比色法對其乳酸濃度進(jìn)行測定，所有操作均嚴(yán)格遵照乳酸濃度測定試劑盒說明書的要求進(jìn)行，重復(fù)6次，收集數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同組別膽管癌HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)水平比較

比較不同組別膽管癌QBC939細(xì)胞中，HIF-1α、PK-M2的蛋白表達(dá)水平，可見，觀察組的HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中，HIF-1α蛋白表達(dá)量在氯化鈷濃度為150μmol/L最高，而HIF-1α蛋白表達(dá)量受氯化鈷濃度影響較小。經(jīng)Pearson相關(guān)分析法分析，PK-M2與HIF-1α呈顯著正相關(guān)（r=0.436，P=0.002）。見表1。

2.2不同組別膽管癌QBC939N胞24h乳酸分泌量比較

比較不同缺氧環(huán)境下，膽管癌QBC939細(xì)胞24h乳酸分泌量，可見隨氯化鈷濃度增加，乳酸.分泌量逐漸增加，且均顯著高于常氧培養(yǎng)時分泌的乳酸量（8.025±1.234），比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3討論

調(diào)查顯示，近年來，膽管癌的發(fā)病率有不斷升高的趨勢，由于其發(fā)病原因尚不十分明確，治療中多以手術(shù)切除為首選方法，但膽管癌細(xì)胞的發(fā)病相對隱匿，早期診斷困難，患者就診時多以發(fā)展至晚期，腫瘤惡性度高，且有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部浸潤情況的發(fā)生，有手術(shù)切除率低，復(fù)發(fā)率高，術(shù)后生存率低，預(yù)后差的情況。在手術(shù)切除的基礎(chǔ)上輔以化學(xué)藥物進(jìn)行綜合治療是比較理想的方法。如何從分子水平上對膽管癌的發(fā)生、發(fā)展情況進(jìn)行分析，并采取有效的基因靶向治療則是腫瘤化療的新方向。

其中，HIF-1可在腫瘤的缺氧過程中發(fā)揮誘導(dǎo)作用，促進(jìn)VEGF、EPO、PK、HK、LDH等多種關(guān)鍵生長調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，參與影響腫瘤能量代謝、侵襲轉(zhuǎn)移、微血管生成、耐受放化療等過程。而PK則是糖酵解途徑中最后一步反應(yīng)的限速酶，膽管癌組織中血供極差以及供氧不足時呈PK-M2高表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)，在氯化鈷誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境中，HIF-1α、PK-M2蛋白表達(dá)水平均顯著高于常氧組，同時乳酸分泌量顯著增加，提示其均在膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高過程中發(fā)揮重要作用，這對于膽管癌相關(guān)化療藥物的開發(fā)有一定指導(dǎo)意義。呂品等研究了低氧對膽管癌細(xì)胞增殖的影響及與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系，同樣發(fā)現(xiàn)在不同的氯化鈷誘導(dǎo)濃度下，膽管癌的細(xì)胞增殖、膽管癌細(xì)胞周期都受到顯著影響，從相關(guān)分析曲線上看，在低氧條件處理72h后，會有QBC939膽管癌細(xì)胞G1期細(xì)胞下降，而s期、G2期細(xì)胞增加的情況，且有氧化鈷濃度升高，G1期細(xì)胞不斷下降的表現(xiàn)，HIF-1α表達(dá)灰度值變化規(guī)律與本文結(jié)果基本一致，共同說明了膽管癌細(xì)胞糖酵解水平與HIF-1α息息相關(guān)。柴浩等對M2-型丙酮酸激酶在膽管癌組織中的表達(dá)情況研究中，確定膽管癌組織中PKM2表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其也與膽管癌細(xì)胞糖酵解水平的升高息息相關(guān)。