陳德沈，劉立瀅，陳策，張偉，林崇光

（溫州市第七人民醫(yī)院　精神科，浙江　溫州　325000）

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齊墩果酸抑制地佐環(huán)平誘導(dǎo)的小鼠精神分裂癥的實(shí)驗(yàn)研究

陳德沈，劉立瀅，陳策，張偉，林崇光

（溫州市第七人民醫(yī)院精神科，浙江溫州325000）

目的：觀察齊墩果酸在NMDA受體拮抗劑地佐環(huán)平（MK-801）誘導(dǎo)的小鼠精神分裂樣行為中的作用。方法：小鼠口服給予齊墩果酸，觀察MK-801誘導(dǎo)的小鼠精神分裂樣行為反應(yīng)，包括曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、聽覺驚嚇反射（ASR）實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別反應(yīng)。結(jié)果：MK-801處理的小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出過度的興奮性運(yùn)動(dòng)，而單次給予齊墩果酸阻斷了這一作用。齊墩果酸本身對(duì)小鼠ASR或前脈沖抑制（PPI）沒有影響，卻可以減輕MK-801誘導(dǎo)的前脈沖缺陷。在新物體辨識(shí)實(shí)驗(yàn)中，單次給予齊墩果酸同樣可以逆轉(zhuǎn)MK-801誘導(dǎo)的小鼠注意力和識(shí)別記憶損傷。此外，齊墩果酸抑制MK-801對(duì)前額葉Akt、GSK3β信號(hào)通路的激活。結(jié)論：齊墩果酸可以作為治療嚴(yán)重精神分裂癥如陽性癥狀、感覺門控失調(diào)、意識(shí)損傷的候選藥物。

齊墩果酸；精神分裂；地佐環(huán)平；小鼠

精神分裂癥牽涉到多巴胺能、谷氨酸能、氨基丁酸能神經(jīng)傳導(dǎo)異常［1-2］。大多數(shù)阻斷多巴胺D2受體的抗精神類藥物（經(jīng)典的或非經(jīng)典的）被批準(zhǔn)用于治療精神分裂癥，但是這些藥都存在各種不良反應(yīng)，如錐體外癥候群或代謝癥候群［1］。有報(bào)道［3］指出夏枯草的提取物可以調(diào)控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）-糖原合成激酶（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)由地佐環(huán)平（MK-801）誘導(dǎo)的小鼠精神分裂樣行為異常。為了進(jìn)一步鑒別夏枯草提取物中的活性成分，我們成功分離出數(shù)種活性成分，包括齊墩果酸（3β-3-Hydroxyolean-12-en-28-oic acid）。齊墩果酸為五環(huán)三萜類化合物（見圖1），廣泛分布于可食用植物中，具有肝保護(hù)、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥用價(jià)值［4］，它的這些藥理學(xué)作用多與其調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/GSK3β信號(hào)通路相關(guān)［5-6］。蛋白激酶Akt在維持細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、突觸可塑性、形成記憶［7］。通過Thr308或Ser473磷酸化位點(diǎn)的磷酸化來激活A(yù)kt，并逐步激活下游信號(hào)分子，例如GSK3β［8］。GSK3β屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調(diào)控糖代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、軸突可塑性等多種生理過程［9］。有報(bào)道［10］顯示Akt/GSK3β不僅與精神分裂癥的病理生理密切相關(guān)，而且是抗精神病治療的重要靶點(diǎn)。綜合先前研究的發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)齊墩果酸可能是通過調(diào)控Akt/ GSK3β信號(hào)軸起到抗精神病的作用。另有報(bào)道［11］指出單次給予N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體拮抗劑可以引起多種擬精神病癥狀，因此本研究中利用動(dòng)物精神分裂癥模型，從多方位研究了齊墩果酸在治療精神分裂癥中的新藥理學(xué)活性。

圖1　齊墩果酸結(jié)構(gòu)式

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所用ICR小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，25～30 g，6周齡，清潔級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2010-001。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州市第七人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州市第七人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，溫度保持在（23± 2）℃，濕度保持在（55±5）%，光照時(shí)間為早上7點(diǎn)至晚上7點(diǎn)。

1.2材料 齊墩果酸、MK-801、氯氮平購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Akt抗體、GSK3β抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；AktpSer473抗體（pAkt）、GSK3β pSer9（pGSK3β）抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；其他分析純化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)設(shè)備均購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司；動(dòng)物聽覺驚嚇反射（auditory startle reflex，ASR）系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Coulbourn公司。

1.3給藥方式 MK-801溶解于0.9%氯化鈉溶液；齊墩果酸懸浮于含10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液；陽性藥氯氮平溶解于含有0.1 N HCl的0.9%氯化鈉溶液中。實(shí)驗(yàn)中每組小鼠數(shù)量為10只。行為學(xué)測(cè)試前30 min腹腔注射0.2 mg/kg MK-801，以誘導(dǎo)小鼠精神分裂癥模型。進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和處死前1 h，分別灌胃給予齊墩果酸（3、10、30 mg/kg），對(duì)照組給予等體積含10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前30 min給予氯氮平（1 mg/kg）。

1.4曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)在41.5 cm×41.5 cm ×41.5 cm的反應(yīng)箱中進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)前均用70%乙醇擦拭箱體。將小鼠放置于反應(yīng)箱中央，攝像機(jī)監(jiān)測(cè)30 min內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為，以總移動(dòng)距離來評(píng)判水平自主活動(dòng)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實(shí)驗(yàn)前30 min給予以誘發(fā)小鼠過度活動(dòng)。氯氮平在實(shí)驗(yàn)前30 min給予。

1.5ASR實(shí)驗(yàn) ASR和前脈沖抑制（prepulse inhibition，PPI）測(cè)試在動(dòng)物ASR系統(tǒng)中完成。將小鼠放入隔音室中，刺激開始后每1 ms記錄65次，以平均振幅作為ASR的評(píng)判指標(biāo)。ASR測(cè)試由聲音驚嚇實(shí)驗(yàn)和非刺激實(shí)驗(yàn)組成。ASR測(cè)試結(jié)束后，PPI測(cè)試開始，分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)類型，分別為單獨(dú)的聽覺反射刺激，即在40 ms內(nèi)120分貝的強(qiáng)噪音刺激；前脈沖實(shí)驗(yàn)聯(lián)合單獨(dú)聽覺反射刺激，即先給予20 ms 73、76、82、86分貝的前脈沖刺激，間隔80 s，再給予40 ms 120分貝強(qiáng)刺激；非刺激實(shí)驗(yàn)，即僅接受背景音刺激，PPI測(cè)試首尾給予5次120分貝的強(qiáng)刺激，中間隨機(jī)給予10次前脈沖刺激或非刺激對(duì)照，平均刺激間隔為21 s（12～30 s）。實(shí)驗(yàn)開始前先讓動(dòng)物接受一段5 min 70分貝的適應(yīng)性刺激。評(píng)價(jià)指標(biāo)：PPI=（1-前脈沖聯(lián)合驚反射刺激的反應(yīng)幅度/單獨(dú)驚反射刺激的反應(yīng)幅度）×100，數(shù)值為0時(shí)表示無PPI，數(shù)值越大代表抑制程度越深。提前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實(shí)驗(yàn)前30 min給予以引起小鼠感覺門控缺陷。氯氮平在實(shí)驗(yàn)前30 min給予。

1.6新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 先對(duì)小鼠進(jìn)行2 d每天10 min自由探索以熟悉環(huán)境，熟悉環(huán)境結(jié)束24 h后開始正式訓(xùn)練，有2個(gè)完全相同的物體（金屬圓桶）于距盒壁8 cm處沿一方墻直線排開。小鼠自另外2個(gè)拐角之一放入盒內(nèi)，在自由探索5 min后再被送回飼養(yǎng)籠內(nèi)。待2 h間歇后，小鼠被再引入實(shí)驗(yàn)盒內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)期的自由探索。此時(shí)，將其中1個(gè)金屬圓桶置換為塑料長(zhǎng)方體（二者高度一致）并位于原位，而另一已熟悉過的金屬圓桶被移至新物體相對(duì)的拐角以防止小鼠空間的偏倚。如果小鼠用它的鼻子在1 cm之內(nèi)指向物體或觸及鼻子則被視為探索行為。對(duì)熟悉物品的探索時(shí)間記為Tfamiliar；新物品記為Tnovel，同時(shí)計(jì)算分辨指數(shù)來評(píng)價(jià)小鼠對(duì)新物體的優(yōu)先探索能力：（Tnovel-Tfamiliar）/（Tnovel+Tfamiliar）× 100。提前1 h給予小鼠齊墩果酸（3、10、30 mg/kg）或10% Tween 80的0.9%氯化鈉溶液。MK-801在實(shí)驗(yàn)前30 min給予以引起小鼠記憶能力損傷。氯氮平在實(shí)驗(yàn)前30 min給予。

1.7蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn) 給予齊墩果酸（30 mg/ kg）后1 h處死正常小鼠和MK-801處理的實(shí)驗(yàn)組小鼠，分離大腦前皮層。在冰浴的Tris-HCl（20 mmol/L，pH=7.4）溶液中將組織研磨破碎成均質(zhì)溶液。取15 mg總蛋白進(jìn)行8% SDS-PAGE凝膠電泳，100 V 4 ℃轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，漂洗后用辣根過氧化物標(biāo)記的二抗進(jìn)行在37 ℃孵育1 h，以化學(xué)發(fā)光方式顯色。使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，先計(jì)算各樣本磷酸化蛋白pAkt、pGSK3β占各自總蛋白的比重，再將各組平均值與對(duì)照組平均值進(jìn)行歸一化計(jì)算。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析。蛋白免疫印跡數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1齊墩果酸逆轉(zhuǎn)MK-801誘導(dǎo)的活躍過度 我們首先用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了齊墩果酸是否會(huì)影響小鼠的基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)能力。與對(duì)照組相比，3種濃度齊墩果酸組小鼠在每5 min間隔內(nèi)的移動(dòng)距離和30 min內(nèi)的總移動(dòng)距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2AB。氯氮平組與對(duì)照組相比差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。說明齊墩果酸和氯氮平對(duì)小鼠的基礎(chǔ)活動(dòng)能力沒有影響。給予MK-801后，小鼠在每5 min間隔內(nèi)的移動(dòng)距離顯著增加（P＜0.001），見圖2C。而聯(lián)合使用齊墩果酸或氯氮平可以阻斷MK-801的刺激作用（P＜0.05），見圖2C-D。

2.2齊墩果酸減弱由MK-801導(dǎo)致的PPI缺陷 齊墩果酸組的聽覺反射幅度和前脈沖強(qiáng)度未見明顯變化，氯氮平組也未引起聽覺反射幅度的明顯變化，見表1和圖3A。因此，齊墩果酸和氯氮平對(duì)小鼠的震驚反應(yīng)幅度和PPI并沒有作用。當(dāng)齊墩果酸和MK-801聯(lián)用時(shí)，小鼠的聽覺驚嚇幅度顯著降低（P＜0.05）；當(dāng)氯氮平和MK-801聯(lián)用時(shí)，小鼠的聽覺驚嚇幅度顯著降低（P＜0.05）。給予MK-801顯著加強(qiáng)了小鼠對(duì)120分貝的ASR強(qiáng)度，并且降低所有前脈沖刺激的PPI程度（P＜0.05），見表2和圖3B。

圖2　齊墩果酸對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)活力的影響

表1　各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

表1　各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

噪音量（分貝）　對(duì)照組　齊墩果酸組　氯氮平組3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　10.19± 4.55　8.28± 0.94　14.90± 3.06　10.58± 1.68 90　18.50± 3.37　13.94± 1.83　23.38± 6.63　15.67± 2.09　14.06± 2.77 100　47.86± 8.45　35.19± 8.40　53.56±12.21　25.61± 3.94　56.97±10.44 110　105.40±21.77　73.92±16.17　103.50±13.87　90.25±18.71　86.78±13.34 120　150.70±24.30　145.10±33.57　171.30±22.96　149.10±23.75　163.00±17.37

表2　MK-801處理后各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

表2　MK-801處理后各組小鼠的聽覺驚反射幅度（n=10，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01，cP＜0.001

噪音量MK-801+氯氮平組3 mg/kg　10 mg/kg　30 mg/kg 80　15.06± 2.28　17.53± 2.87a10.19± 4.55c　8.28± 0.94c14.90± 3.06c10.58± 1.68c90　18.50± 3.37　50.50±11.25a13.94± 1.83c23.38± 6.63c15.67± 2.09c14.06± 2.77c100　47.86± 8.45　87.75±14.49a35.19± 8.40c53.56±12.21c25.61± 3.94c56.97±10.44c110　105.40±21.77　145.50±23.15a73.92±16.17c103.50±13.87c90.25±18.71c86.78±13.34c120　150.70±24.30　243.60±38.27a145.10±33.57c171.30±22.96b149.10±23.75a163.00±17.37c（分貝）　對(duì)照組　MK-801組　MK-801+齊墩果酸組

圖3　齊墩果酸對(duì)小鼠PPI的影響

2.3齊墩果酸對(duì)MK-801誘導(dǎo)的記憶損傷的修復(fù)作用 我們首先驗(yàn)證了齊墩果酸是否會(huì)影響正常小鼠的預(yù)判能力。在5 min內(nèi)讓各組小鼠分別對(duì)2個(gè)相同的物體進(jìn)行探索，記錄下小鼠對(duì)每個(gè)物體的嗅探時(shí)間，見圖4A。2 h后，再將小鼠放置入識(shí)別箱，此時(shí)已經(jīng)將其中1個(gè)舊物體替換為新物體，記錄5 min內(nèi)小鼠對(duì)2個(gè)物體的嗅探時(shí)間，見圖4A。與對(duì)照組相比，齊墩果酸組小鼠在嗅探新舊物體的時(shí)間長(zhǎng)度比例、分辨比及總探索時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與齊墩果酸一樣，給予藥氯氮平對(duì)正常小鼠的預(yù)判能力也沒有產(chǎn)生影響，見圖4B-D。

給予MK-801后，小鼠嗅探新舊物體的時(shí)長(zhǎng)比例和分辨比都產(chǎn)生了顯著性影響。與對(duì)照組相比，給予MK-801后的實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)新物體的嗅探時(shí)間比例和對(duì)新舊物體的分辨比顯著下降，說明記憶有損傷。而給予齊墩果酸可以明顯改善MK-801造成的各組小鼠記憶損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4E-F。

2.4齊墩果酸抑制MK-801誘導(dǎo)的Akt、GSK3β磷酸化水平升高 齊墩果酸（30 mg/kg）不引起正常小鼠前皮層Akt、GSK3β的磷酸化水平，見圖5A。根據(jù)前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，MK-801明顯上調(diào)了小鼠皮層Akt、GSK3β的磷酸化水平，這與MK-801能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性擬精神病樣的作用相關(guān)。本研究中，MK-801也顯著增加了小鼠前皮層Akt Ser473磷酸化位點(diǎn)、GSK-3β Ser9磷酸化位點(diǎn)的磷酸化程度（P＜0.05），見圖5B。而齊墩果酸（30 mg/kg）抑制了MK-801所引起的Akt、GSK3β磷酸化水平升高，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，MK-801和齊墩果酸對(duì)前皮層總Akt和GSK3β水平均不產(chǎn)生影響。

圖4　齊墩果酸對(duì)小鼠識(shí)別記憶能力的影響

3　討論

陽性癥狀與精神分裂癥患者的多巴胺能系統(tǒng)和谷氨酸能系統(tǒng)間的平衡有密切關(guān)系［12］。單次給予MK-801可誘導(dǎo)小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中過度運(yùn)動(dòng)行為，其作用可被齊墩果酸（30 mg/kg）或D2/5-HT2A受體拮抗劑氯氮平所阻斷［13］。此外，齊墩果酸不影響正常小鼠在曠場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，但是對(duì)MK-801所導(dǎo)致的過度運(yùn)動(dòng)有抑制作用，而且并不是因?yàn)辇R墩果酸有鎮(zhèn)靜或催眠作用。

驚嚇反射的PPI是目前在各哺乳動(dòng)物種系中所公認(rèn)的一種SG模型［14］。大量研究表明在精神分裂癥患者和動(dòng)物模型中驚嚇反射的PPI受到破環(huán)。在本研究中，齊墩果酸或氯氮平對(duì)正常小鼠的ASR和PPI幅度均沒有作用，說明齊墩果酸或氯氮平不影響感覺門控功能。而單次給予MK-801即導(dǎo)致小鼠PPI缺陷，說明感覺運(yùn)動(dòng)門控受到破壞，而齊墩果酸可能具有改善精神分裂癥患者感覺運(yùn)動(dòng)門控功能損傷的作用。

嚙齒動(dòng)物對(duì)新物體的識(shí)別記憶被認(rèn)為與人類的陳述性（情景）記憶類似，而精神分裂癥患者的此功能異常。本研究發(fā)現(xiàn)，MK-801誘導(dǎo)的識(shí)別記憶損傷可被齊墩果酸和氯氮平所逆轉(zhuǎn)，并且單獨(dú)給予齊墩果酸不影響正常動(dòng)物的注意力和識(shí)別記憶功能，暗示齊墩果酸可能有助于提高精神分裂癥患者的認(rèn)知功能。

有報(bào)道［15］指出亞慢性給予齊墩果酸展示出抗抑郁樣作用，可能影響了兒茶酚胺代謝。有文獻(xiàn)［16］報(bào)道給予大鼠精神興奮劑，如多巴胺受體激動(dòng)劑、5-HT受體激動(dòng)劑和NMDA受體拮抗劑，都會(huì)引起Akt 或GSK3β的磷酸化升高。我們發(fā)現(xiàn)MK-801引起的前皮層Akt和GSK3β磷酸化程度升高可以被單次給予齊墩果酸所抑制。也有報(bào)道［17］表明其他抗精神病藥物也有同樣的作用。此外，由于齊墩果酸處理的正常小鼠前皮層Akt和GSK3β磷酸化水平不變，因而我們推測(cè)齊墩果酸干預(yù)MK-801介導(dǎo)的的生化改變可能是針對(duì)于NMDA受體信號(hào)通路異常變化。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)齊墩果酸對(duì)MK-801誘導(dǎo)的小鼠精神病樣行為有改善作用，例如自發(fā)活動(dòng)過度活躍、PPI缺陷和新物體識(shí)別記憶損傷等，其機(jī)制與抑制MK-801誘導(dǎo)的前皮層Akt和GSK3β信號(hào)通路異常磷酸化有關(guān)。這些研究發(fā)現(xiàn)齊墩果酸是治療精神分裂癥陽性癥狀和認(rèn)知癥狀的新型候選藥物。

圖5　齊墩果酸對(duì)小鼠前皮層Akt和GSK3β磷酸化水平的影響

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（本文編輯：吳昔昔）

Oleanolic acid attenuates MK-801-induced schizophrenia-like behaviors in mice

CHEN DeshenLIU Liying，CHEN CeZHANG WeiLIN Chongguang.Department of PsychiatryWenzhou Seventh People's Hospital，Wenzhou325000

ObjectiveTo observe the effects of oleanolic acid on schizophrenia-like behaviors in mice elicited by MK-801an N-methyl-D-aspartate （NMDA） receptor antagonist.MethodsEffects of oleanolic acid via oral gavage in MK-801-induced schizophrenia-like response in micesuch as open field testacoustic startle response test and novel object recognition test were all observed.ResultsSinglely administration of oleanolic acid blocked MK-801-induced hyperlocomotion in the open field test.In acoustic startle response testoleanolic acid did not affect the acoustic startle response or prepulse inhibition （PPI） level.And MK-801-induced PPI deficit was ameliorated by oleanolic acid.In novel object recognition testattention and recognition memory impairments induced by MK-801 were reversed by oleanolic acid.Additionallyoleanolic acid normalized the MK-801-induced alterations of signaling moleculesincluding phosphorylation levels of Akt and GSK-3β in frontal cortex.ConclusionThese results suggest that oleanolic acid can be a candidate for the treatment of several symptoms of schizophreniaincluding positive symptomssensorimotor gating disruptionand cognitive impairments.

oleanolic acid； schizophrenia； dizocilpine； mice

R749.3

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.008

2016-01-27

陳德沈（1974-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師。