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        CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥增生期內(nèi)膜中的表達

        2016-10-07 01:09:34鄒阮敏林刻智余霞余劍琴阮靜瑤陳冠閣張文淼
        溫州醫(yī)科大學學報 2016年6期
        關鍵詞:差異

        鄒阮敏,林刻智,余霞,余劍琴,阮靜瑤,陳冠閣,張文淼

        (1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學實驗中心,浙江 溫州 325035;3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科,浙江 溫州 325015)

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        CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥增生期內(nèi)膜中的表達

        鄒阮敏1,林刻智2,余霞3,余劍琴1,阮靜瑤3,陳冠閣1,張文淼1

        (1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江溫州325015;2.溫州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學實驗中心,浙江溫州325035;3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科,浙江溫州325015)

        目的:分析CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達情況。方法:采取Real-time PCR和免疫組織化學染色法對手術和病理確診增生期子宮內(nèi)膜異位癥的18例在位內(nèi)膜、24例異位內(nèi)膜及20例因行卵巢囊腫、子宮肌瘤手術的增生期正常子宮內(nèi)膜(術后病理除外子宮內(nèi)膜異位癥)進行CXCL14表達的檢測。結果:①與正常內(nèi)膜比較,I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);②與正常內(nèi)膜比較,I-I I期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達水平有下調(diào),但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);③與I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜比較,I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);與I-I I期在位內(nèi)膜比較,I-I I期異位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達水平有下調(diào),但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論:CXCL14可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展,可能與子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠率低有關。

        CXCL14;子宮內(nèi)膜異位癥;正常內(nèi)膜;在位內(nèi)膜;異位內(nèi)膜

        子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見病,多見于育齡婦女,近年來發(fā)病率呈上升趨勢。子宮內(nèi)膜異位癥在組織學上呈良性表現(xiàn),但在臨床行為學上具有類似惡性腫瘤的特點[1]。子宮內(nèi)膜異位癥更是不孕的主要原因,相關研究發(fā)現(xiàn)其直接降低了體外受精/卵細胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI)臨床助孕的成功率。子宮內(nèi)膜異位癥患者的不孕、低妊娠率和內(nèi)膜基因的異常表達緊密相關[2-5]。重度子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜基因轉(zhuǎn)錄和信號通路發(fā)生極大的改變,異常的分子及功能可能導致內(nèi)膜貧瘠,不宜于受精卵著床而降低受孕率,利用基因芯片比較重度與輕度子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基因表達的差異發(fā)現(xiàn),CXCL14在分泌期呈顯著改變[6],而關于CXCL14在增殖期的表達未作描述。目前國際上極少關于CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥患者中的表達變化的研究,且意見不一致,為探討CXCL14是否可能與子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)展及下降的妊娠率有關,本研究選擇CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥相關的不孕癥患者增生期在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達情況進行分析。

        1 材料和方法

        1.1材料 Trizol試劑(美國Invitrogen公司);Re-verTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix(日本Toyobo公司);DNase I、DEPC水(大連寶生物工程有限公司);CXCL14特異性抗體I抗(英國Abcam公司);羊血清封閉液、DAB顯色液、辣根過氧化物酶標記羊抗兔II抗(北京中杉金橋生物公司);引物(上海英駿生物技術有限公司)。

        1.2方法

        1.2.1組織標本采集和處理:選取2014年6月-2015年12月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術和病理確診增生期子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究組,在位內(nèi)膜標本18例,其中I-I I期8例,I I I-IV期10例,異位內(nèi)膜標本24例,I-I I期9例,I I I-IV期15例,其中6例異位內(nèi)膜標本沒有同時留取在位內(nèi)膜組織,其他均來自同一患者。同期因卵巢囊腫、子宮肌瘤行腹腔鏡和開腹手術的增生期患者20例為對照組,均術中和病理除外子宮內(nèi)膜異位癥。入組患者均為生育期女性,年齡20~39歲,平均年齡27歲,在術前6個月內(nèi)均未服激素類藥物,月經(jīng)周期的確定是根據(jù)患者的月經(jīng)史,并由病理組織學證實。研究組患者均為不孕癥患者,對照組生育功能正常,至少有1個子女。術中留取的標本(經(jīng)病理確診)均被分為2部分:一部分標本在手術切除后30 min,液氮冷凍保存,備RNA提??;另一部分由4%甲醛固定,經(jīng)石蠟包埋、切片,行免疫組織化學檢測。

        1.2.2RNA的分離、純化:總RNA的提取按Trizol試劑說明書進行。為增加小RNA得率,抽提的RNA,經(jīng)DNase I處理,酚-氯仿抽提,最后DEPC水溶解純化的RNA,檢測RNA的濃度后,保存于-80 ℃冰箱。

        1.2.3 CXCL14 mRNA檢測:參照ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,1 μL提取的RNA,以Oligo dT進行反轉(zhuǎn)錄。條件:42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min,75 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,結束后-2O ℃保存。Rea1-time PCR檢測15 μL反應體系,包括:1×SYBR Green I Master-Mix,1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,0.5 μmol/L特異反向引物,0.5 μmol/L特異前向引物。條件:95 ℃反應2 min,95 ℃反應15 s,60 ℃反應1 min,40個循環(huán)。使用儀器為Bio-Rad CFX96。所有標本均設3復孔。GAPDH為內(nèi)參照,依照待測標本Ct值,轉(zhuǎn)化為2-△Ct表示標本的CXCL14相對表達量,再2組間進行統(tǒng)計,其中△Ct=(CtCXCL14-CtGAPDH)。引物序列見表1。

        表1 引物序列

        1.2.4免疫組織化學檢測及結果判定:甲醛固定、石蠟包埋子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織,將組織蠟塊切片,厚4 μm,多聚賴氨酸處理、二甲苯脫蠟、蒸餾水水化。過氧化氫室溫孵育10 min,PBS沖洗3次;枸櫞酸鹽緩沖液高壓1.5 min。冷卻降溫后,PBS沖洗3次;羊血清處理2 h;加入一抗,4 ℃過夜。加辣根過氧化物酶標記二抗,37 ℃孵育30 min,DAB顯色。蘇木素復染脫水封片。雙盲法對結果進行判定:染色陽性的細胞比率分4個等級,陰性(-)、陽性細胞率<10%(+)、陽性細胞率10%~50%(++)、陽性細胞率>50%(+++)。用圖像處理軟件計算處理并進行統(tǒng)計分析。

        1.3統(tǒng)計學處理方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS21.0進行分析。CXCL14表達比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組織CXCL14 mRNA的表達 如圖1A所示,CXCL14 和GAPDH的熔解曲線為單峰,提示我們建立的定量PCR方法能特異擴增目的基因。采用Real-time PCR的方法,檢測輕度、重度增生期子宮內(nèi)膜異位癥組織和正常子宮內(nèi)膜組織CXCL14 mRNA的表達(見圖1B-C):與正常內(nèi)膜比較,I I I-IV期在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA表達明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05);I-I I期在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA表達略有下調(diào),但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與I I I-IV期在位內(nèi)膜比較,I I I-IV期異位內(nèi)膜CXCL14 mRNA表達明顯下調(diào),且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);I-I I期在位內(nèi)膜和I-I I期異位內(nèi)膜比較,CXCL14 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        圖1 CXCL14 mRNA相對表達量比較

        2.2子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜CXCL14蛋白表達的免疫組織化學分析 CXCL14蛋白在增生期子宮內(nèi)膜異位癥中,不同級別在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織和正常增殖期子宮內(nèi)膜的表達見圖2。陽性信號主要位于組織的腺體上皮細胞的胞漿中,而細胞核及細胞膜上無表達,在間質(zhì)細胞弱表達。正常子宮內(nèi)膜組織CXCL14表達呈強陽性、棕色染色,而I-I I期和I I I-IV期在位內(nèi)膜組織表達逐步減弱;I-I I期和I I I-IV期異位內(nèi)膜組織表達亦表現(xiàn)出明顯的梯度下降,重度異位內(nèi)膜幾乎無表達,基本不染色。半定量分析結果顯示,I I I-IV期在位內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達低于正常內(nèi)膜組織,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),I-I I期在位內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達也低于正常內(nèi)膜,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);I I I-IV期異位內(nèi)膜的CXCL14蛋白的表達水平明顯較I I I-IV期在位內(nèi)膜低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而I-I I期異內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達與I-I I期在位內(nèi)膜比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

        3 討論

        “異位種植學說”、“在位內(nèi)膜學說”認為,逆流的經(jīng)血中有活性的內(nèi)膜細胞,通過黏附、侵襲、血管形成,種植于異位盆腔[7],其發(fā)生是由在位內(nèi)膜的特質(zhì)性決定[8]。異位內(nèi)膜細胞有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移及復發(fā)等行為,侵襲周圍組織,并在局部種植、生長和新生血管形成,疾病難以根治,復發(fā)率高[1]。生長因子和誘導細胞增殖、血管形成的細胞因子參與異位內(nèi)膜的種植和生長過程,而且在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[9]。研究表明,趨化因子與子宮內(nèi)膜異位癥有著密切的關聯(lián)[10],趨化因子在子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞黏附、侵襲、血管形成、發(fā)展為子宮內(nèi)膜異位癥過程中起了重要的作用[11],但是趨化因子變化是否直接導致異位癥發(fā)生,目前無確切依據(jù)。

        CXCLl4作為一種新的基因普遍表達于人體腦、小腸、腎臟等處,能作為機體維持穩(wěn)態(tài)的重要因素[12-13]。CXCLl4位于5p31.1染色體,前體有99個氨基酸殘基,斷裂除去一個由22個氨基酸組成的信號肽后,產(chǎn)生一個由77個氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì)[12]。CXCL14與其他趨化因子一樣,參與調(diào)控免疫、炎癥、血管形成、腫瘤、胚胎發(fā)育等許多病理生理過程[12,14-20],可趨化單核細胞、巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞、自然殺傷細胞和B細胞等多種免疫細胞[13,21-22],也可通過減少血管平滑肌細胞趨化性及降低腫瘤微脈管系統(tǒng)形成從而抑制血管形成[19-20,23]。在多數(shù)腫瘤組織中CXCL14低表達,其沉默可能是癌癥發(fā)生的關鍵,上調(diào)其表達成為抗腫瘤的研究重點[24]。在正常子宮內(nèi)膜中,CXCL14在分泌中、晚期表達顯著升高,其表達受孕激素調(diào)節(jié),對自然殺傷細胞可能具有顯著趨化作用[25]。另有文獻報道,剔除老鼠中的CXCL14基因能顯著下調(diào)妊娠密切相關的子宮內(nèi)膜自然殺傷細胞增殖[26]。在妊娠早期,CXCL14表達于著床部位,與內(nèi)膜的容受性和妊娠的建立有關[3]。

        為研究CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達情況,本實驗采用Real-time PCR和免疫組織化學的方法檢測分析增生期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組織。實驗結果表明,在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中CXCL14在I I I-IV期重度患者中表達明顯下調(diào),雖然在I-I I期輕度患者中亦有下調(diào),但差異無統(tǒng)計學意義,CXCL14似乎能夠反映子宮內(nèi)膜異位癥病情的嚴重程度。在先前研究[27]中,增殖期重度子宮內(nèi)膜異位癥患者CXCL14表達顯著下調(diào),研究者認為其表達降低與重度子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜細胞的黏附和增殖能力增強有關,同樣提示CXCL14可能與子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)展有關。但該項研究局限于在位內(nèi)膜進行對比分析,沒有同時檢測異位內(nèi)膜中CXCL14 mRNA和蛋白的表達情況,本研究對其作了適當?shù)难a充,且實驗結果完全吻合。

        圖2 子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜CXCL14蛋白染色結果(×200)

        圖3 CXCL14蛋白相對表達量比較

        一項對22個體外受精(in vitro fertilization,IVF)統(tǒng)計文獻進行meta分析發(fā)現(xiàn):重度子宮內(nèi)膜異位癥較輕度患者IVF成功率顯著降低(13.84% vs 21.12%);與輕度患者比較,患有重度子宮內(nèi)膜異位癥的婦女無論是自然還是人工周期,其妊娠率(22.6% vs 40.0%)、種植成功率(13.7% vs 28.3%)均顯著降低[28]。有學者圍繞重度子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠率下降的臨床問題,采用基因芯片的方法在異位癥相關的不孕癥患者增殖期在位內(nèi)膜中篩選出12種基因,再使用qRT-PCR進行定量分析,結果僅發(fā)現(xiàn)CXCL14下調(diào)表達,提示CXCL14表達下調(diào)可能與妊娠率下降有關[27]。本試驗選擇子宮內(nèi)膜異位癥相關的不孕癥患者,CXCL14在增殖期重度異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織中均為低表達,表明CXCL14與異位癥不孕癥之間有著極其密切的聯(lián)系,CXCL14的異常表達很可能導致不孕,但仍需對其在分泌期的表達進行后續(xù)的研究,進一步深入了解兩者之間的關聯(lián),其表達下調(diào)是否僅造成兩者妊娠率之間的差異,是否與子宮內(nèi)膜異位癥其他生物學行為如:疼痛、盆腔粘連等相關目前尚不得而知。

        本研究I-II期和III-IV期子宮內(nèi)膜異位癥中CXCL14表達顯著不同,CXCL14下調(diào),可能促進細胞黏附和增殖,活化在位內(nèi)膜,促使細胞血管形成、侵襲,參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展過程;可能改變宮腔內(nèi)微環(huán)境,不利于囊胚著床,導致妊娠率下降。綜上所述,子宮內(nèi)膜異位癥相關的不孕癥,也許可以通過調(diào)節(jié)CXCL14的表達而改變預后。CXCL14可能可以作為一項檢測指標,從分子生物學角度判斷異位癥的嚴重程度和不孕的概率。

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        (本文編輯:丁敏嬌)

        Expression of chemokine CXCL14 in the proliferative-phase endometriosis

        ZOU Ruanmin1LIN Kezhi2,YU Xia3YU Jianqin1RUAN Jingyao3CHEN Guan'ge1ZHANG Wenmiao1.1.Department of Obstetrics and Gynecologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015; 2.Medical Experimental Teaching CenterWenzhou Medical UniversityWenzhou325035; 3.Department of Pathologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015

        ObjectiveTo analyze the expression of chemokine CXCL14 in the eutopic and ectopic endometrium of the proliferative-phase endometriosis.MethodsReal-time PCR and immunohistochemistry were adopted to measure and compare the CXCL14 expression in 18 cases of eutopic endometrium24 cases of ectopic endometrium and 20 cases of normal endometriumwhich were confirmed by surgery and pathology.Results:①Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels significantly declined in eutopic endometrium with stage III-IVthere were significant differences (P<0.05).②Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels declined slightly in eutopic endometrium with stage I-IIbut there were no significant differences.③The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were significantly down-regulated in ectopic endometrium with stage III-IV compared to eutopic endometrium with stage III-IV (P<0.05).④The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were slightly down-regulated in ectopic endometrium with stage I-II compared to eutopic endometrium with stage I-II.ConclusionOur findings indicated that CXCL14 may participate in the development and progression of endometriosiswhich is likely associated with the low conception rates in women with endometriosis.

        CXCL14; endometriosis; normal endometrium; eutopic endometrium; ectopic endometrium

        R711.71

        ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.007

        2016-01-20

        溫州市科技局科研基金資助項目(Y20140308,Y2014 0216);浙江省自然科學青年基金資助項目(LQ15C010002)。

        鄒阮敏(1981-),女,浙江溫州人,主治醫(yī)師,碩士。

        張文淼,主任醫(yī)師,碩士生導師,Email:zhwm63@126.com。

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