鄒阮敏，林刻智，余霞，余劍琴，阮靜瑤，陳冠閣，張文淼

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　婦產(chǎn)科，浙江　溫州　325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)　基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，浙江　溫州　325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　病理科，浙江　溫州　325015）

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CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥增生期內(nèi)膜中的表達(dá)

鄒阮敏1，林刻智2，余霞3，余劍琴1，阮靜瑤3，陳冠閣1，張文淼1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江溫州325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，浙江溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，浙江溫州325015）

目的：分析CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥增生期在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)情況。方法：采取Real-time PCR和免疫組織化學(xué)染色法對(duì)手術(shù)和病理確診增生期子宮內(nèi)膜異位癥的18例在位內(nèi)膜、24例異位內(nèi)膜及20例因行卵巢囊腫、子宮肌瘤手術(shù)的增生期正常子宮內(nèi)膜（術(shù)后病理除外子宮內(nèi)膜異位癥）進(jìn)行CXCL14表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果：①與正常內(nèi)膜比較，I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②與正常內(nèi)膜比較，I-I I期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達(dá)水平有下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；③與I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜比較，I I I-IV期子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；與I-I I期在位內(nèi)膜比較，I-I I期異位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA和蛋白表達(dá)水平有下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：CXCL14可能參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展，可能與子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠率低有關(guān)。

CXCL14；子宮內(nèi)膜異位癥；正常內(nèi)膜；在位內(nèi)膜；異位內(nèi)膜

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見病，多見于育齡婦女，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。子宮內(nèi)膜異位癥在組織學(xué)上呈良性表現(xiàn)，但在臨床行為學(xué)上具有類似惡性腫瘤的特點(diǎn)［1］。子宮內(nèi)膜異位癥更是不孕的主要原因，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其直接降低了體外受精/卵細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（IVF/ICSI）臨床助孕的成功率。子宮內(nèi)膜異位癥患者的不孕、低妊娠率和內(nèi)膜基因的異常表達(dá)緊密相關(guān)［2-5］。重度子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)通路發(fā)生極大的改變，異常的分子及功能可能導(dǎo)致內(nèi)膜貧瘠，不宜于受精卵著床而降低受孕率，利用基因芯片比較重度與輕度子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜基因表達(dá)的差異發(fā)現(xiàn)，CXCL14在分泌期呈顯著改變［6］，而關(guān)于CXCL14在增殖期的表達(dá)未作描述。目前國際上極少關(guān)于CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥患者中的表達(dá)變化的研究，且意見不一致，為探討CXCL14是否可能與子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)展及下降的妊娠率有關(guān)，本研究選擇CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的不孕癥患者增生期在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；Re-verTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Master Mix（日本Toyobo公司）；DNase I、DEPC水（大連寶生物工程有限公司）；CXCL14特異性抗體I抗（英國Abcam公司）；羊血清封閉液、DAB顯色液、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔II抗（北京中杉金橋生物公司）；引物（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

1.2方法

1.2.1組織標(biāo)本采集和處理：選取2014年6月-2015年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)和病理確診增生期子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究組，在位內(nèi)膜標(biāo)本18例，其中I-I I期8例，I I I-IV期10例，異位內(nèi)膜標(biāo)本24例，I-I I期9例，I I I-IV期15例，其中6例異位內(nèi)膜標(biāo)本沒有同時(shí)留取在位內(nèi)膜組織，其他均來自同一患者。同期因卵巢囊腫、子宮肌瘤行腹腔鏡和開腹手術(shù)的增生期患者20例為對(duì)照組，均術(shù)中和病理除外子宮內(nèi)膜異位癥。入組患者均為生育期女性，年齡20～39歲，平均年齡27歲，在術(shù)前6個(gè)月內(nèi)均未服激素類藥物，月經(jīng)周期的確定是根據(jù)患者的月經(jīng)史，并由病理組織學(xué)證實(shí)。研究組患者均為不孕癥患者，對(duì)照組生育功能正常，至少有1個(gè)子女。術(shù)中留取的標(biāo)本（經(jīng)病理確診）均被分為2部分：一部分標(biāo)本在手術(shù)切除后30 min，液氮冷凍保存，備RNA提??；另一部分由4%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2.2RNA的分離、純化：總RNA的提取按Trizol試劑說明書進(jìn)行。為增加小RNA得率，抽提的RNA，經(jīng)DNase I處理，酚-氯仿抽提，最后DEPC水溶解純化的RNA，檢測(cè)RNA的濃度后，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 CXCL14 mRNA檢測(cè)：參照ReverTra Ace反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，1 μL提取的RNA，以O(shè)ligo dT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。條件：42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，75 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，結(jié)束后-2O ℃保存。Rea1-time PCR檢測(cè)15 μL反應(yīng)體系，包括：1×SYBR Green I Master-Mix，1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，0.5 μmol/L特異反向引物，0.5 μmol/L特異前向引物。條件：95 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃反應(yīng)15 s，60 ℃反應(yīng)1 min，40個(gè)循環(huán)。使用儀器為Bio-Rad CFX96。所有標(biāo)本均設(shè)3復(fù)孔。GAPDH為內(nèi)參照，依照待測(cè)標(biāo)本Ct值，轉(zhuǎn)化為2-△Ct表示標(biāo)本的CXCL14相對(duì)表達(dá)量，再2組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中△Ct=（CtCXCL14-CtGAPDH）。引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判定：甲醛固定、石蠟包埋子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織，將組織蠟塊切片，厚4 μm，多聚賴氨酸處理、二甲苯脫蠟、蒸餾水水化。過氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次；枸櫞酸鹽緩沖液高壓1.5 min。冷卻降溫后，PBS沖洗3次；羊血清處理2 h；加入一抗，4 ℃過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染脫水封片。雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定：染色陽性的細(xì)胞比率分4個(gè)等級(jí)，陰性（-）、陽性細(xì)胞率＜10%（+）、陽性細(xì)胞率10%～50%（++）、陽性細(xì)胞率＞50%（+++）。用圖像處理軟件計(jì)算處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS21.0進(jìn)行分析。CXCL14表達(dá)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組織CXCL14 mRNA的表達(dá) 如圖1A所示，CXCL14 和GAPDH的熔解曲線為單峰，提示我們建立的定量PCR方法能特異擴(kuò)增目的基因。采用Real-time PCR的方法，檢測(cè)輕度、重度增生期子宮內(nèi)膜異位癥組織和正常子宮內(nèi)膜組織CXCL14 mRNA的表達(dá)（見圖1B-C）：與正常內(nèi)膜比較，I I I-IV期在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；I-I I期在位內(nèi)膜的CXCL14 mRNA表達(dá)略有下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與I I I-IV期在位內(nèi)膜比較，I I I-IV期異位內(nèi)膜CXCL14 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；I-I I期在位內(nèi)膜和I-I I期異位內(nèi)膜比較，CXCL14 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1　CXCL14 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜CXCL14蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)分析 CXCL14蛋白在增生期子宮內(nèi)膜異位癥中，不同級(jí)別在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織和正常增殖期子宮內(nèi)膜的表達(dá)見圖2。陽性信號(hào)主要位于組織的腺體上皮細(xì)胞的胞漿中，而細(xì)胞核及細(xì)胞膜上無表達(dá)，在間質(zhì)細(xì)胞弱表達(dá)。正常子宮內(nèi)膜組織CXCL14表達(dá)呈強(qiáng)陽性、棕色染色，而I-I I期和I I I-IV期在位內(nèi)膜組織表達(dá)逐步減弱；I-I I期和I I I-IV期異位內(nèi)膜組織表達(dá)亦表現(xiàn)出明顯的梯度下降，重度異位內(nèi)膜幾乎無表達(dá)，基本不染色。半定量分析結(jié)果顯示，I I I-IV期在位內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達(dá)低于正常內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），I-I I期在位內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達(dá)也低于正常內(nèi)膜，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；I I I-IV期異位內(nèi)膜的CXCL14蛋白的表達(dá)水平明顯較I I I-IV期在位內(nèi)膜低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而I-I I期異內(nèi)膜的CXCL14蛋白表達(dá)與I-I I期在位內(nèi)膜比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

3　討論

“異位種植學(xué)說”、“在位內(nèi)膜學(xué)說”認(rèn)為，逆流的經(jīng)血中有活性的內(nèi)膜細(xì)胞，通過黏附、侵襲、血管形成，種植于異位盆腔［7］，其發(fā)生是由在位內(nèi)膜的特質(zhì)性決定［8］。異位內(nèi)膜細(xì)胞有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等行為，侵襲周圍組織，并在局部種植、生長和新生血管形成，疾病難以根治，復(fù)發(fā)率高［1］。生長因子和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、血管形成的細(xì)胞因子參與異位內(nèi)膜的種植和生長過程，而且在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用［9］。研究表明，趨化因子與子宮內(nèi)膜異位癥有著密切的關(guān)聯(lián)［10］，趨化因子在子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞黏附、侵襲、血管形成、發(fā)展為子宮內(nèi)膜異位癥過程中起了重要的作用［11］，但是趨化因子變化是否直接導(dǎo)致異位癥發(fā)生，目前無確切依據(jù)。

CXCLl4作為一種新的基因普遍表達(dá)于人體腦、小腸、腎臟等處，能作為機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的重要因素［12-13］。CXCLl4位于5p31.1染色體，前體有99個(gè)氨基酸殘基，斷裂除去一個(gè)由22個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽后，產(chǎn)生一個(gè)由77個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白質(zhì)［12］。CXCL14與其他趨化因子一樣，參與調(diào)控免疫、炎癥、血管形成、腫瘤、胚胎發(fā)育等許多病理生理過程［12，14-20］，可趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞［13，21-22］，也可通過減少血管平滑肌細(xì)胞趨化性及降低腫瘤微脈管系統(tǒng)形成從而抑制血管形成［19-20，23］。在多數(shù)腫瘤組織中CXCL14低表達(dá)，其沉默可能是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵，上調(diào)其表達(dá)成為抗腫瘤的研究重點(diǎn)［24］。在正常子宮內(nèi)膜中，CXCL14在分泌中、晚期表達(dá)顯著升高，其表達(dá)受孕激素調(diào)節(jié)，對(duì)自然殺傷細(xì)胞可能具有顯著趨化作用［25］。另有文獻(xiàn)報(bào)道，剔除老鼠中的CXCL14基因能顯著下調(diào)妊娠密切相關(guān)的子宮內(nèi)膜自然殺傷細(xì)胞增殖［26］。在妊娠早期，CXCL14表達(dá)于著床部位，與內(nèi)膜的容受性和妊娠的建立有關(guān)［3］。

為研究CXCL14在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)分析增生期子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜、正常內(nèi)膜組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜中CXCL14在I I I-IV期重度患者中表達(dá)明顯下調(diào)，雖然在I-I I期輕度患者中亦有下調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CXCL14似乎能夠反映子宮內(nèi)膜異位癥病情的嚴(yán)重程度。在先前研究［27］中，增殖期重度子宮內(nèi)膜異位癥患者CXCL14表達(dá)顯著下調(diào)，研究者認(rèn)為其表達(dá)降低與重度子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附和增殖能力增強(qiáng)有關(guān)，同樣提示CXCL14可能與子宮內(nèi)膜異位癥病情發(fā)展有關(guān)。但該項(xiàng)研究局限于在位內(nèi)膜進(jìn)行對(duì)比分析，沒有同時(shí)檢測(cè)異位內(nèi)膜中CXCL14 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，本研究對(duì)其作了適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合。

圖2　子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜CXCL14蛋白染色結(jié)果（×200）

圖3　CXCL14蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

一項(xiàng)對(duì)22個(gè)體外受精（in vitro fertilization，IVF）統(tǒng)計(jì)文獻(xiàn)進(jìn)行meta分析發(fā)現(xiàn)：重度子宮內(nèi)膜異位癥較輕度患者IVF成功率顯著降低（13.84% vs 21.12%）；與輕度患者比較，患有重度子宮內(nèi)膜異位癥的婦女無論是自然還是人工周期，其妊娠率（22.6% vs 40.0%）、種植成功率（13.7% vs 28.3%）均顯著降低［28］。有學(xué)者圍繞重度子宮內(nèi)膜異位癥患者妊娠率下降的臨床問題，采用基因芯片的方法在異位癥相關(guān)的不孕癥患者增殖期在位內(nèi)膜中篩選出12種基因，再使用qRT-PCR進(jìn)行定量分析，結(jié)果僅發(fā)現(xiàn)CXCL14下調(diào)表達(dá)，提示CXCL14表達(dá)下調(diào)可能與妊娠率下降有關(guān)［27］。本試驗(yàn)選擇子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的不孕癥患者，CXCL14在增殖期重度異位癥在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織中均為低表達(dá)，表明CXCL14與異位癥不孕癥之間有著極其密切的聯(lián)系，CXCL14的異常表達(dá)很可能導(dǎo)致不孕，但仍需對(duì)其在分泌期的表達(dá)進(jìn)行后續(xù)的研究，進(jìn)一步深入了解兩者之間的關(guān)聯(lián)，其表達(dá)下調(diào)是否僅造成兩者妊娠率之間的差異，是否與子宮內(nèi)膜異位癥其他生物學(xué)行為如：疼痛、盆腔粘連等相關(guān)目前尚不得而知。

本研究I-II期和III-IV期子宮內(nèi)膜異位癥中CXCL14表達(dá)顯著不同，CXCL14下調(diào)，可能促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖，活化在位內(nèi)膜，促使細(xì)胞血管形成、侵襲，參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展過程；可能改變宮腔內(nèi)微環(huán)境，不利于囊胚著床，導(dǎo)致妊娠率下降。綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的不孕癥，也許可以通過調(diào)節(jié)CXCL14的表達(dá)而改變預(yù)后。CXCL14可能可以作為一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，從分子生物學(xué)角度判斷異位癥的嚴(yán)重程度和不孕的概率。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Expression of chemokine CXCL14 in the proliferative-phase endometriosis

ZOU Ruanmin1LIN Kezhi2，YU Xia3YU Jianqin1RUAN Jingyao3CHEN Guan'ge1ZHANG Wenmiao1.1.Department of Obstetrics and Gynecologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015； 2.Medical Experimental Teaching CenterWenzhou Medical UniversityWenzhou325035； 3.Department of Pathologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015

ObjectiveTo analyze the expression of chemokine CXCL14 in the eutopic and ectopic endometrium of the proliferative-phase endometriosis.MethodsReal-time PCR and immunohistochemistry were adopted to measure and compare the CXCL14 expression in 18 cases of eutopic endometrium24 cases of ectopic endometrium and 20 cases of normal endometriumwhich were confirmed by surgery and pathology.Results：①Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels significantly declined in eutopic endometrium with stage III-IVthere were significant differences （P＜0.05）.②Compared to normal endometriumthe expression of chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels declined slightly in eutopic endometrium with stage I-IIbut there were no significant differences.③The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were significantly down-regulated in ectopic endometrium with stage III-IV compared to eutopic endometrium with stage III-IV （P＜0.05）.④The chemokine CXCL14 at mRNA and protein levels were slightly down-regulated in ectopic endometrium with stage I-II compared to eutopic endometrium with stage I-II.ConclusionOur findings indicated that CXCL14 may participate in the development and progression of endometriosiswhich is likely associated with the low conception rates in women with endometriosis.

CXCL14； endometriosis； normal endometrium； eutopic endometrium； ectopic endometrium

R711.71

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.007

2016-01-20

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20140308，Y2014 0216）；浙江省自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（LQ15C010002）。

鄒阮敏（1981-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

張文淼，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zhwm63@126.com。