黃婷婷，谷雪梅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　內(nèi)分泌科，浙江　溫州　325015）

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GLP-1受體激動劑Exendin4對胰島β細胞胰島素和IAPP分泌模式的影響

黃婷婷，谷雪梅

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江溫州325015）

目的：探討GLP-1受體激動劑（GLP-1RA）Exendin4作用下胰島β細胞的胰島素及胰淀粉樣多肽（IAPP）的分泌模式。方法：觀察小鼠胰島瘤細胞系MIN6細胞在不同濃度Exendin4作用不同時間后的細胞形態(tài)的變化；利用MTT實驗檢測MIN6細胞在不同干預(yù)后的細胞活性的變化；采用葡萄糖刺激胰島素分泌實驗，檢測MIN6細胞在不同干預(yù)后培養(yǎng)液上清中的胰島素和IAPP分泌量的變化；采用熒光定量PCR（RT-PCR）檢測各組MIN6細胞的胰島素和IAPP mRNA表達水平的變化。結(jié)果：與正常對照組比較，Exendin4組的細胞數(shù)量增加，貼壁牢固，形態(tài)正常；細胞活性隨Exendin4作用濃度以及作用時間的增加而顯著增加，具有一定的濃度及時間依賴性；胰島素和IAPP的分泌水平隨Exendin4作用濃度以及作用時間的增加而顯著增加，具有一定的濃度及時間依賴性，而IAPP/胰島素的比值隨作用濃度以及作用時間的增加而減??；胰島素和IAPP mRNA水平均隨Exendin4作用濃度以及作用時間的增加而上調(diào)，具有一定的濃度及時間依賴性，IAPP/胰島素mRNA比值隨作用濃度以及作用時間的增加而減小。結(jié)論：Exendin4作用于MIN6細胞可增加細胞數(shù)量和細胞活性，改善細胞狀態(tài)，保護胰島細胞功能；并且可引起胰島素以及IAPP分泌水平增加，胰島素和IAPP mRNA表達水平增加，而IAPP/胰島素比值下降。

胰高糖素樣多肽1；胰淀粉樣多肽；Exendin4；胰島β細胞

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的主要特征是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）以及胰島β細胞功能進行性衰竭，伴隨著胰島β細胞數(shù)量的減少，從而導(dǎo)致胰島素效應(yīng)相對或絕對不足，引起血糖的升高［1-3］。T2DM患者的胰島病理特征也表現(xiàn)為胰淀粉樣多肽（islet amyloid polypeptide，IAPP）的細胞外淀粉樣積聚。盡管IAPP是相對惰性的，但T2DM的胰島β細胞內(nèi)IAPP形成的低聚物具有膜穿透毒性［4-6］，它被視為可誘導(dǎo)β細胞功能紊亂和凋亡。Cadavez等［7］、Gao等［8］和Akter等［9］研究發(fā)現(xiàn)過表達的人IAPP可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志更強的響應(yīng)。因此，細胞中激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的續(xù)連被稱為未折疊蛋白應(yīng)答（unfolded protein response，UPR），其可引發(fā)炎癥，并最終導(dǎo)致細胞死亡［5，10-11］。由此，IAPP成為我們關(guān)注的重要對象。

IAPP是與胰島素由同一胰島β細胞共同產(chǎn)生和分泌，因此那些促進內(nèi)源性胰島素分泌的治療藥物很可能會引起IAPP分泌的增加，而這樣的變化是否會與胰島素相互作用，是否足以影響其降糖的效應(yīng)，或者影響糖尿病病程，并不是非常清楚。

胰高血糖素樣肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是一種重要的腸促胰島素，它可以刺激胰島素分泌，促進胰島β細胞增殖以及提高胰島β細胞生存率［12-14］。GLP-1受體激動劑（GLP-1 receptor agonists，GLP-1RA）具有類似GLP-1的作用，同時又因其與天然GLP-1的結(jié)構(gòu)差異可增強它的作用時間。

目前鮮有研究報道GLP-1與IAPP分泌模式之間的關(guān)系。故本研究通過探討GLP-1RA作用下胰島細胞的胰島素及IAPP的分泌模式，來研究GLP-1RA促胰島素分泌的同時是否影響IAPP以及GLP-1RA的保護作用是否與IAPP分泌模式相關(guān)。

1　材料和方法

1.1細胞培養(yǎng) 小鼠胰島瘤細胞系MIN6細胞購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。MIN6細胞用含10% FBS、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d換1次液。當(dāng)顯微鏡下觀察細胞生長至約80%～90%融合度時，用胰蛋白酶溶液消化傳代。將MIN6細胞接種于6孔板，待培養(yǎng)至70%融合狀態(tài)時，換用含或不含Exendin4的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察MIN6細胞形態(tài)。

1.2MTT實驗 MIN6細胞在含不同濃度Exendin4的培養(yǎng)基中孵育不同時間后，加入MTT（5 mg/mL）繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔內(nèi)加入DMSO終止反應(yīng)，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，各孔用酶標儀測

量波長490 nm處的OD值，重復(fù)實驗3次。細胞存活率計算：細胞存活率=（測定組OD值-空白組OD值）/（正常對照組OD值-空白組OD值）。正常對照組存活率為100%。

1.3葡萄糖刺激胰島素釋放（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）實驗 MIN6細胞接種培養(yǎng)板，貼壁24 h后，經(jīng)不同濃度Exendin4處理不同時間后，用Krebs-Ringer HEPES（KRHB）緩沖液（含有5 mmol/L碳酸氫鈉，1 mmol/L氯化鈣，2.8 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L HEPES和10% FBS）清洗后，并在KRHB緩沖液里37 ℃孵育30 min；隨后更換成含有25 mmol/L葡萄糖的KRHB緩沖液里37 ℃孵育1 h。分別收集培養(yǎng)后的緩沖液，采用ELISA法檢測緩沖液中的胰島素、IAPP含量。

1.4熒光定量PCR（RT-PCR） MIN6細胞在含不同濃度Exendin4培養(yǎng)基中孵育不同時間后，用Trizol法提取細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用RT-PCR試劑盒檢測MIN6細胞胰島素和IAPP及內(nèi)參β-actin的mRNA的表達水平。見表1。

表1　PCR引物

2　結(jié)果

2.1Exendin4對MIN6細胞形態(tài)的影響 正常對照組MIN6細胞貼壁比較牢，生長良好，形態(tài)正常；Exendin4作用于MIN6細胞后，細胞數(shù)量增加，貼壁更為牢固，形態(tài)正常。見圖1。

2.2Exendin4對MIN6細胞活性的影響 不同濃度Exendin4作用于MIN6細胞24 h或48 h后，隨Exendin4濃度增加細胞活性明顯上升，并且呈現(xiàn)出一定的量效相關(guān)性及時間相關(guān)性。見圖2。

圖1　Exendin4對MIN6細胞形態(tài)的影響

圖2　Exendin4干預(yù)MIN6細胞24 h或48 h后對細胞活性的影響

2.3GSIS實驗 不同濃度Exendin4（25、50、100 nmol/L）干預(yù)MIN6細胞24 h或48 h后，胰島素和IAPP的分泌水平隨Exendin4藥物濃度的增加而增加，隨作用時間增加而增加，具有一定濃度及時間依賴性。而且，胰島素分泌水平增加幅度大于IAPP。因此IAPP/胰島素比值隨Exendin4藥物濃度的增加而減小，隨作用時間增加而減小。見圖3。

2.4Exendin4對MIN6細胞胰島素和IAPP mRNA表達水平的影響 不同濃度Exendin4（0、25、50、100 nmol/L）干預(yù)24 h、48 h，MIN6細胞胰島素和IAPP mRNA的表達水平隨Exendin4藥物濃度的增加而增加，隨作用時間增加而增加，具有一定濃度及時間依賴性。IAPP/胰島素mRNA比值隨Exendin4藥物濃度的增加而減小，隨作用時間增加而減小。見圖4。

圖3　Exendin4對MIN6細胞胰島素和IAPP分泌模式的影響

3　討論

IAPP聚集物即淀粉樣纖維沉積已被認定為T2DM的一個典型病理特征。許多研究結(jié)果支持了胰島淀粉樣的形成在胰島β細胞功能衰竭的發(fā)展并最終導(dǎo)致高血糖的T2DM中具有重要作用。作為纖維沉淀物的主要成分，IAPP成為我們關(guān)注的重要對象。大多數(shù)關(guān)于糖尿病與IAPP的研究都著重于增強胰島素敏感性和降低高血糖以利于減少內(nèi)源性IAPP的表達和淀粉樣蛋白的形成［6，15-16］。而我們這項研究新穎地著重于GLP-1對于IAPP分泌模式的影響。

GLP-1是有名的腸促胰島素，它可以刺激胰島素分泌［17-18］，然而，關(guān)于其是否具有影響IAPP分泌模式的功能尚不可知，同時也沒有研究報道目前臨床上用的胰島素促泌劑是否影響IAPP的分泌模式。在我們這項研究中，我們發(fā)現(xiàn)IAPP的分泌水平以及mRNA的表達水平依賴于Exendin4的作用濃度與作用時間，IAPP/胰島素的比值隨Exendin4的作用濃度與作用時間增加而減小，此種分泌模式可能有助于減少IAPP形成淀粉樣沉積并有效地降低血糖，改善IR，其遠期效應(yīng)可能延緩胰島功能衰竭等進程。已知IAPP是與胰島素一起從胰島細胞分泌泡以一定比例相伴分泌的，所以IAPP/胰島素比值的改變可能是由于胰島素與IAPP分泌的分離。已知循環(huán)中GLP-1的水平可以直接刺激胰島β細胞分泌胰島素，此作用是通過PKC依賴的TRPM4和TRPM5的激活［19-20］。所以本實驗結(jié)果反應(yīng)的GLP-1對IAPP分泌及表達水平的影響可能也是GLP-1直接刺激IAPP的結(jié)果。有一項研究［20］發(fā)現(xiàn)短時間暴露于高濃度的IAPP會抑制格列本脲誘導(dǎo)的依賴ATP的K+（KATP）通道的閉合和減少鈣離子的內(nèi)流，這最終可能會導(dǎo)致INS-1細胞胰島素分泌的減少。GLP-1與IAPP之間可能是一種相互調(diào)節(jié)的關(guān)系，具體的作用途徑和位點有待于進一步的研究。

T2DM的發(fā)病機制主要有2個環(huán)節(jié)，即IR和胰島β細胞功能受損，而后者是T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。胰島β細胞功能損傷包括胰島素分泌異常和細胞數(shù)量減少。綜上所述，我們的研究結(jié)果認為，Exendin4很可能是通過減小IAPP/胰島素的比值從而保護胰島細胞存活和其功能。Exendin4有助于延緩T2DM的進程。

本研究的不足之處在于我們的實驗課題僅在細胞實驗水平，沒有進行體內(nèi)實驗研究。此外，我們僅研究Exendin4作用下胰島細胞的胰島素及IAPP的分泌模式，沒有與其他胰島素促泌劑相對比，后續(xù)我們將進一步開展相關(guān)研究。

圖4　Exendin4對MIN6細胞胰島素和IAPP mRNA表達水平的影響

［1］BUTLER A EJANSON JBONNER-WEIR Set al.Betacell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes［J］.Diabetes200352（1）102-110.

［2］SAISHO Y.β-cell dysfunctionIts critical role in prevention and management of type 2 diabetes［J］.World J Diabetes，20156（1）109-124.

［3］KANETO H.Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus［J］.Nihon Rinsho201573（12）2003-2007.

［4］GURLO TRYAZANTSEV SHUANG C Jet al.Evidence for proteotoxicity in beta cells in type 2 diabetestoxic islet amyloid polypeptide oligomers form intracellularly in the secretory pathway［J］.J Pathol2010176（2）861-869.

［5］FERNANDEZ M S.Human IAPP amyloidogenic properties and pancreatic beta-cell death［J］.Cell Calcium201456（5）：416-427.

［6］JEONG H RAN S S.Causative factors for formation of toxic islet amyloid polypeptide oligomer in type 2 diabetes mellitus［J］.Clin Interv Aging2015101873-1879.

［7］CADAVEZ LMONTANE JALCARRAZ-VIZAN Get al.Chaperones ameliorate beta cell dysfunction associated with human islet amyloid polypeptide overexpression［J］.PloS one20149（7）e101797.

［8］GAO MWINTER R.The effects of lipid membranes，cowding and osmolytes on the aggregationand fibrillation propensity of human IAPP［J］.J Diabetes Res20152015：849017.

［9］AKTER RCAO PNOOR Het al.Islet amyloid polypeptidestructurefunctionand pathophysiology［J］.J Diabetes Res201620162798269.

［10］EIZIRIK D LMIANI MCARDOZO A K.Signalling dangerendoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response in pancreatic islet inflammation［J］.Diabetologia，201356（2）234-241.

［11］MONTANE JCADAVEZ LNOVIALS A.Stress and the inflammatory processa major cause of pancreatic cell death in type 2 diabetes［J］.Diabetes Metab Syndr Obes20147：25-34.

［12］KRIEGER J PARNOLD MPETTERSEN K Get al.Knockdown of GLP-1 receptors in vagal afferents affects normal food intake and glycemia［J］.Diabetes201665（1）：34-43.

［13］WANG X FLIU J JXIA Jet al.Endogenous glucagonlike peptide-1 suppresses high-fat food intake by reducing synaptic drive onto mesolimbic dopamine neurons［J］.Cell reports201512（5）726-733.

［14］RONVEAUX C CTOME DRAYBOULD H E.Glucagonlike peptide 1 interacts with ghrelin and leptin to regulate glucose metabolism and food intake through vagal afferent neuron signaling［J］.J Nutr2015145（4）672-680.

［15］HULL R LSHEN Z PWATTS M Ret al.Long-term treatment with rosiglitazone and metformin reduces the extent ofbut does not preventislet amyloid deposition in mice expressing the gene for human islet amyloid polypeptide［J］.Diabetes200554（7）2235-2244.

［16］MUKHERJEE AMORALES-SCHEIHING DBUTLER P Cet al.Type 2 diabetes as a protein misfolding disease［J］.Trends Mol Med201521（7）439-449.

［17］BROICHHAGEN JPODEWIN TMEYER-BERG Het al.Optical control of insulin secretion using an incretin switch ［J］.Angew Chem Int Ed Engl201554（51）15565-15569.

［18］SHIGETO MRAMRACHEYA RTARASOV A Iet al.GLP-1 stimulates insulin secretion by PKC-dependent TRPM4 and TRPM5 activation［J］.J Clin Invest2015，125（12）4714-4728.

［19］KOLIC JMACDONALD P E.cAMP-independent effects of GLP-1 on beta cellsJ］.J Clin Invest2015125（12）4327-4330.

［20］XIAO JLI XZHAO Xet al.The effects and mechanism of islet amyloid polypeptide on insulin secretion in INS-1 cells stimulated by glibenclamide［J］.Zhonghua nei ke za zhi201554（3）214-218.

（本文編輯：吳昔昔）

Effect of GLP-1 receptor agonist Exendin4 on secretion pattern of insulin and islet amyloid polypeptide in islet beta cells

HUANG TingtingGU Xuemei.Department of Endocrinologythe First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical UniversityWenzhou325015

ObjectiveTo explore the effect of GLP-1 receptor agonist （GLP-1RA） Exendin4 on insulin and islet amyloid polypeptide （IAPP） secretion pattern.MethodsCell morphology of MIN6 cells was observed after treated with different concentrations of GLP-1 receptor agonist Exendin4 for different time periods.Cell viability of MIN6 cells was detected after different interventions respectively by MTT assay.Glucose-stimulated secretion levels of insulin and islet amyloid polypeptide were examined in culture supernatant of MIN6 cells and RTPCR was used for detecting the expression levels of insulin mRNA and IAPP mRNA after different interventions respectively.ResultsCompared with the control groupExendin4 group exhibited much stronger adherence to the culture dishwith normal morphology and increasing cell numbers.There was a significant increase of cell viability in MIN6 cells treated with Exendin4which displayed dose- and time-dependent pattern.Insulin and islet amyloid peptide secretion levels increased accordinglywhile the ratio of IAPP/insulin decreased.The mRNA expression levels of insulin and IAPP of MIN6 cells were increased with treatment of Exendin4which also displayed dose- and time-dependent patternwhile the ratio of IAPP/insulin mRNA correspondingly.Conclusion：Exendin4 increases the number and cell viability of MIN6 cells.Exposure to Exendin4 can increase insulin and IAPP secretion levelsand mRNA expression levels of insulin and IAPP as wellwhile the ratio of IAPP/insulin is deceased accordingly.

glucagon-like peptide-1； islet amyloid polypeptide； Exendin4； islet beta cell

R587

ADOI10.3969/j.issn.2095-9400.2016.06.003

2016-02-17

中華醫(yī)學(xué)會項目（13020110396）；國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81000356）。

黃婷婷（1990-），女，浙江溫州人，碩士生。

谷雪梅，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，Email：snowgxm@126.com。