楊　柳, 楊　華, 劉　云, 陳　佳, 龔明福, 舒通勝（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院放射科, 重慶400037）

球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性探討

楊柳, 楊華, 劉云, 陳佳, 龔明福, 舒通勝
（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院放射科, 重慶400037）

目的探討球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性。方法成年裸小鼠8只，隨機分成2組，每組4只，分別通過尾靜脈及球后靜脈注射超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide, SPIO）納米粒, 行裸小鼠肝臟磁共振（magnetic resonance, MR）快速自旋回波（fast spin echo, FSE） T2WI掃描, 測量同一層面、同一區(qū)域肝實質(zhì)及鄰近肌肉在增強前后的信號強度，計算信號強度變化率。結果8只裸小鼠全部穿刺成功。尾靜脈穿刺平均耗時8 min 30 s，平均穿刺次數(shù)為3.7次； 球后靜脈竇穿刺平均耗時約3 min 50 s，平均穿刺次數(shù)為2.3次。球后靜脈及尾靜脈兩種方法注射納米粒后肝臟的信號強度變化規(guī)律一致，納米粒注射后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h的信號強度變化率分別為：尾靜脈注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08% ±7.68%，74.06%±7.44%，74.61%±6.28%，73.66%±4.52%； 球后靜脈注射： 69.29%±7.53%，74.86%±5.84%，77.54%±6.47%，78.85%±8.23%，79.05%±4.65%，77.99%±7.73%，兩者差異無顯著性（P＞0.05）。結論裸小鼠球后靜脈穿刺簡單、可靠，可以作為尾靜脈穿刺以外納米粒注射的途徑。

裸小鼠； 靜脈給藥； 納米粒； 球后靜脈

由于體型小、生長繁殖快、飼養(yǎng)管理方便，小鼠成為了哺乳實驗動物中應用最廣泛的實驗動物之一。在既往的藥物干預實驗中，研究者采用的給藥方式包括灌胃給藥、皮下注射、腹膜腔注射和靜脈注射等。其中靜脈注射有起效快，血藥濃度高等優(yōu)點，成為最有效的藥物注射方式［1］。尾靜脈穿刺是靜脈給藥中最常見的方式，然而許多研究者認為，尾靜脈穿刺技術難度大，耗時長，在需要連續(xù)、多次注藥時不太方便。尤其是對于體型較小的裸小鼠而言，難度更大。球后靜脈竇以前往往作為靜脈取血的重要路徑，球后靜脈竇穿刺用于靜脈給藥目前報道較少，特別是在靜脈推注納米粒的可行性，目前還未見報道［2］。本部分研究擬通過裸小鼠尾靜脈及球后靜脈兩種方式靜脈給注超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米粒，觀察動物肝臟的增強效果，評價球后靜脈注射在裸小鼠納米粒靜脈給藥中的可行性，以期總結出合適的裸小鼠納米粒給藥途徑。

1　材料與方法

1.1常規(guī)平掃

成年雌性BALB/C裸小鼠8只，購于北京華阜康生物科技股份有限公司［SCXK（京）2014-0004］，隨機分成兩組，每組4只，質(zhì)量分數(shù)2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，采用自制的裸小鼠固定器固定。將裸小鼠俯臥位置于掃描床上（頭部先進入），在裸小鼠于固定架之間的間隙內(nèi)輕輕放入棉球，在保暖的同時固定裸小鼠, 降低裸小鼠的呼吸運動。采用正交小動物專用線圈于3.0 T磁共振（MR）掃描儀掃描行常規(guī)橫斷位平掃, 掃描序列及參數(shù)為： 軸位快速自旋回波（FSE） T2WI： 重復時間（TR）3 000 ms,回波時間（TE）65 ms, 重復次數(shù)（NEX）： 3, 層厚：2.0mm,間距0.2 mm。

1.2納米粒的靜脈注射

掃描結束后退床至定位，記錄好裸小鼠的大致位置后取出裸小鼠，采用4.5號穿刺針行尾靜脈和球后靜脈竇穿刺。尾靜脈穿刺前先用溫水浸泡鼠尾3 min，用酒精棉球擦拭尾巴，使血管擴張，用左手食指、中指及拇指將鼠尾固定，右手持針，針尖朝下，針孔向上，從食指稍上方進針，進針后，沿著血管讓針頭在血管里前行一段，用回抽或逆向按揉血管可以看到回血后，用拇指固定針頭，連接預先抽有鐵濃度為45 μg/mL的SPIO懸液的1 mL注射器，緩慢注射對比劑。球后靜脈竇穿刺參考Yardeni等［2］的方法。裸小鼠取左側(cè)臥位，頭偏向右側(cè)，操作者左手拇指和食指輕輕擠壓眼圈的背側(cè)和腹側(cè)皮膚使眼球輕輕突出，右手持針，針孔面向下，針尖傾斜30°緩慢的從內(nèi)眥沿著眼球邊上進針，直至眼底，連接1 mL注射器，輕輕回抽確定穿刺成功，然后輕輕的、緩慢的注射對比劑。注射完成，再緩慢地，輕輕地將針退出。兩種方法注射的納米粒總量均為0.15 mL。

1.3增強掃描及數(shù)據(jù)分析

按平掃時的初始位置固定裸小鼠, 進床至掃描位, 行肝臟連續(xù)的FSE T2WI增強掃描，掃描參數(shù)同平掃。掃描時間點分別為注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h。掃描結束后，測量同一層面、同一區(qū)域肝臟實質(zhì)部分及鄰近肌肉在增強前后的信號強度, 設感興趣區(qū)（Region of interest, ROI）為6 mm2, 并計算信號強度強化率（△SI）, △SI= SIen-SIpl）/ SIpl×100%, 其中SIpl和SIen分別為平掃和增強后的信號強度, 比較兩種方法有否差異。采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件, 計量資料以±s表示。采用兩隨機樣本均數(shù)t檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1穿刺情況

8只裸小鼠全部靜脈穿刺成功。從平掃結束取出裸小鼠開始計時, 尾靜脈穿刺平均耗時8 min 30 s,平均穿刺次數(shù)為3.7次，最多一只裸小鼠穿刺6次才成功； 球后靜脈竇穿刺平均耗時約3 min 50 s，平均穿刺次數(shù)為2.3次，最多穿刺4次。尾靜脈穿刺次數(shù)越多，隨著鼠尾的腫脹，穿刺難度越大。尾靜脈穿刺組1只裸小鼠的尾部在反復尾靜脈穿刺后出現(xiàn)水腫, 3 d后壞死, 其余裸小鼠穿刺后連續(xù)觀察1周未出現(xiàn)明顯并發(fā)癥。

2.2注射SIPO后信號強度

兩種方法注射SPIO后信號強度變化見表1，信號強度變化規(guī)律一致, 注射納米粒后即刻肝臟信號急劇降低, 5 min、10 min、30 min信號降低程度逐漸放緩, 30 min、1 h和2h信號改變不明顯（圖1）。在注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h, 各時間點信號強度變化率分別為： 尾靜脈注射66.78%±5.62%，72.92%±8.41%，73.08%± 7.68%, 74.06%±7.44%，74.61%±6.28%, 73.66% ±4.52%； 球后靜脈注射： 69.29%±7.53%, 74.86% ±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05% ±4.65%, 77.99%±7.73%。兩者差異無顯著性（P＞0.05）。肌肉信號在注射對比劑后即刻輕度降低,后緩慢回升, 到30 min后信號恢復到增強前。

表1　球后靜脈注射和尾靜脈注射兩種方法注射SPIO后肝臟信號強度變化

3　討論

裸小鼠自身免疫系統(tǒng)存在缺陷，成為構建人腫瘤動物移植瘤模型的最佳選擇，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展機理，腫瘤藥物研發(fā)等領域中發(fā)揮著重要的作用［3］。在既往的裸小鼠移植瘤的藥物干預實驗中，研究者采用的給藥方式包括灌胃給藥、皮下注射、腹膜腔注射和尾靜脈注射等。其中尾靜脈注射有起效快，血藥濃度高等優(yōu)點，成為被廣泛采用的給藥方式。然而，裸小鼠尾靜脈較細小，對一般實驗人員來說穿刺難度較大，往往導致靜脈穿刺失敗。此外，為了提高尾靜脈穿刺的成功率，操作者往往需要將裸小鼠進行制動，并需要用紅外燈照射或采用熱水浸泡鼠尾的方法使外周鼠尾靜脈擴張，給穿刺操作帶來了不必要的額外操作［3］。球后靜脈竇是由眶上靜脈、下眼瞼靜脈、鼻背靜脈和顳淺靜脈等匯聚成的靜脈池，相對尾靜脈，球后靜脈竇更粗，穿刺注藥操作更簡單，對操作者的技術熟練程度要求較低，近年來受到越來越多普通實驗人員的親睞。目前已有研究證明，球后靜脈竇穿刺注射的方法在進行骨髓移植、白血病誘導、靜脈輸注實驗用混合物、以及基因治療時實用、可靠［4, 5］。然而，關于這個方法用于靜脈給藥目前報道較少，特別是在靜脈推注納米粒對增強效果的影響，目前還未見報道。基于以上因素，本研究探討了通過球后靜脈竇和尾靜脈注射納米粒進行MR增強掃描的可行性和其對增強效果的影響。研究結果表明，相對于尾靜脈，通過球后靜脈竇注射SPIO的方法簡單、高效、成功率高，且具有很高的重復率。球后靜脈竇給藥組未見任何并發(fā)癥，而尾靜脈給藥組出現(xiàn)了腫脹、壞死的情況。測量不同方法給藥后肝臟的信號強度發(fā)現(xiàn)兩者的變化規(guī)律一致，在注藥后即刻、5 min、10 min、30 min、1 h及2 h，各時間點信號強度變化率沒有統(tǒng)計學差異。

圖1　球后靜脈注射SPIO后肝臟MR圖像

在實際操作中，作者體會到球后靜脈注藥時阻力較小，即便如此，注藥速度仍不能太快，據(jù)報道［6］，過高的球后注射壓力可以使藥物滲透到球后周圍間隙。關于注藥總量，有研究者報道［7］在成年小鼠注藥量可達到200～300 μL, 也有學者［2］提出小鼠注藥量不能超過150 μL, 因為對于體質(zhì)量 30 g的小鼠，其體內(nèi)的血液總量大約2.2 mL（占體質(zhì)量的7.2%），即使是緩慢注射總量為200～300 μL對比劑，也會引起短暫血管超負荷。在本實驗中，裸小鼠體質(zhì)量約15 g，通過緩慢推注對比劑150 μL后，部分裸小鼠的確出現(xiàn)呼吸急促的癥狀，但所有裸小鼠最終都能從麻醉中自然蘇醒。鑒于此，作者認為，裸小鼠常規(guī)注藥量應控制在100 μL左右，如實驗確需更大劑量，應緩慢、分節(jié)注射，而不能連續(xù)快速注射，且總量不能超過150 μL。

靜脈注射納米粒以后，納米粒很快被血漿蛋白調(diào)理而被清除，主要被肝臟和脾臟吸收，少量被肺、腎、心臟和腦吸收［8,9］。分子影像是目前評估納米粒的藥代動力學的最直觀、可行方法，通過肝臟磁共振信號改變來判斷納米粒的在體內(nèi)的循環(huán)是觀察磁性納米粒在體內(nèi)血流動力學的重要方法。本實驗結果顯示，肝臟信號的變化規(guī)律與文獻報道的納米粒的藥代動力學一致［10］，表明兩種靜脈途徑給藥均是有效的。球后靜脈注射信號強度變化率較尾靜脈注射更大，這可能與球后靜脈相對尾靜脈更粗, 對比劑通過更順暢有關。說明兩種方法均可用于納米粒的注射，但球后靜脈注射更流暢。

即便球后靜脈竇穿刺注藥操作簡單，注藥可靠，對操作者的技術熟練程度要求較低，但對于新手而言，在正式實驗之前，仍需在終末期麻醉小鼠上進行反復的穿刺試驗。此外，作者體會到球后靜脈給藥的過程中，動物不免會發(fā)生位置的移動，這對于需要注藥前后同一位置準確對比的實驗來說定位要求更高?？傊?，對于尾靜脈穿刺尚不十分熟練的操作員來說，球后靜脈穿刺是一種重要的補充方法，尤其對于納米粒的注射，球后靜脈路徑或可作為首選路徑。

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Feasibility Study on Intravenous Administration of Nanoparticles via Retrobulbar Vein in Nude Mice

YANG Liu, YANG Hua, LIU Yun, CHEN Jia, GONG Ming-fu, SHU Tong-sheng
（Department of Radiology， Xinqiao Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400037， China）

ObjectiveTo explore the feasibility of retrobulbar vein injection of nanoparticles in nude mice. MethodsEight healthy adult nude mice were randomly divided into two groups with four in each group. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles （SPIO） were intravenously injected via tail vein and retrobulbar vein, respectively. Magnetic resonance （MR） FSE T2WI were performed on liver of nude mice. The signal intensity （SI） of the liver and adjacent muscles were measured, and the change rate of SI were calculated. ResultsAll the 8 nude mice were punctured successfully. It took an average of 8 minutes30 seconds and 3.7 times for tail vein puncture, which was larger than that of retrobulbar vein puncture which took an average of 3 minutes 50 seconds and 2.3 times. The liver SI enhancement is consistent between retrobulbar vein injection and tail vein injection. The SI change rate at 0 minute, 5 minute, 10 minute, 30 minute, 1 hour and 2 hour were 66.78%±5.62%, 72.92%±8.41%, 73.08% ±7.68%, 74.06%±7.44%, 74.61%±6.28%, 73.66%±4.52% respectively in tail vein injection and 69.29%±7.53%, 74.86%±5.84%, 77.54%±6.47%, 78.85%±8.23%, 79.05%±4.65%, 77.99%±7.73% respectively in retrobulbar vein injection. The difference was not statistically significant （P＞0.05）. ConclusionThe intravenous administration of nanoparticles via retrobulbar vein is simpler andefficient, it may be used as a method apart from the tail vein injection .

Nude mice； Intravenous administration； Nanoparticles； Retrobulbar vein

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0117-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.007

2015-09-16

國家自然科學基金（ 81501521）； 重慶市前沿與應用基礎研究一般項目（cstc2015jcyjA1338）

楊柳（1981-）, 女, 主治醫(yī)師, 主要從事分子影像學研究。E-mail： 13527547568@163.com

龔明福, 博士。E-mail： yanghua780819@163.com