唐 蕊，張雪輝，殷世群，萬慧潔

（1.邢臺(tái)學(xué)院化學(xué)工程與生物技術(shù)學(xué)院 河北邢臺(tái) 054001； 2.邢臺(tái)市林業(yè)局 河北邢臺(tái) 054000）

黃瓜枯萎病是由半知菌亞門尖孢鐮孢菌黃瓜?；蚚Fusarium oxysporum(Schl.)f.sp.cucumerinumOwen.]引起的一種嚴(yán)重的土傳病害，在黃瓜露地和保護(hù)地栽培中均有發(fā)生，是影響黃瓜生產(chǎn)最主要的病害之一。病菌從幼根或傷口侵入，危害維管束，阻礙水分運(yùn)輸，使植株迅速萎蔫且病勢(shì)發(fā)展迅速，很難控制。發(fā)病率一般為10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%～90%[1-2]。近年來，該病的發(fā)生程度日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益降低，造成巨大損失。目前生產(chǎn)上針對(duì)黃瓜枯萎病的防治除了選用抗病品種、結(jié)合輪作倒茬或嫁接等栽培管理等農(nóng)業(yè)措施外，配合處理種子與土壤及發(fā)病初期施藥等化學(xué)防治方法進(jìn)行綜合防治。化學(xué)藥劑主要有青枯立克、惡霉靈、甲霜惡霉靈等，雖然各種藥劑交替使用能有效緩解病菌抗藥性的產(chǎn)生，但長(zhǎng)期使用導(dǎo)致許多菌株出現(xiàn)抗藥性，防治效果減弱；另一方面，化學(xué)藥劑的大量使用，也造成藥品殘留等食品安全問題。隨著人們經(jīng)濟(jì)能力的提高、環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)，對(duì)食品質(zhì)量提出了更高的要求，加之現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展和《食品安全法》的實(shí)施，農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)顯得尤為重要。利用拮抗菌防治枯萎病屬于生物防治，對(duì)人畜無害、不污染環(huán)境、果實(shí)安全性高，成為專家學(xué)者研究的熱點(diǎn)。近年來主要研究的生防菌類群有真菌類的木霉、叢枝菌根，細(xì)菌類的芽孢桿菌、假單胞桿菌和放線菌類的鏈霉菌屬[3-4]。本研究在對(duì)黃瓜枯萎病拮抗菌篩選的基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)特征觀察、顯微觀察、革蘭氏染色、16S rDNA序列分析等對(duì)拮抗效果較好的拮抗菌HM-7進(jìn)行鑒定，為生防制劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 拮抗菌HM-7（邢臺(tái)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室從黃瓜種植園土樣中分離獲得，對(duì)黃瓜枯萎病拮抗效果顯著的菌株）。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，瓊脂 17g，水 1 000 mL。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水 1 000 mL。馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 17g，水 1 000 mL。高氏 I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20g，KNO31g，NaC1 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂 17g，水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。SK8255 基因組抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌HM-7菌株菌落特征觀察 采用平板劃線分離法。將活化的生防菌HM-7分別接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏I號(hào)培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，觀察不同時(shí)間其在不同培養(yǎng)基中的菌落特征。

1.2.2 顯微觀察和革蘭氏染色 選取生長(zhǎng)24h的生防菌HM-7進(jìn)行顯微觀察，并進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察結(jié)果[5]。

1.2.3 拮抗菌HM-7基因組DNA的提取 將拮抗菌HM-7的單菌落接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37℃中，200 r·min-1下震蕩培養(yǎng)過夜。取1 mL菌體培養(yǎng)液于EP管中，8 000 r·min-1離心1min，棄上清液。加入 20mg·mL-1的溶菌酶 180 μL，置于37℃水浴鍋中保溫1h，期間每10min混勻一次。加入蛋白酶K 20 μL，混勻后置于56℃水浴鍋中保溫30min，過程中每10min搖勻一次。加入20mg·mL-1的 RNA 酶 20 μL，室溫放置 3min。加入Buffer BD 200 μL，放置于70℃水浴鍋中水浴10min。加入200 μL無水乙醇，充分混勻，放置2min。12 000 r·min-1離心 1min，棄去液體。加入含異丙醇的 PW Buffer 500 μL，10 000 r·min-1離心30 s，棄上清液。加入含無水乙醇的Wash Solution，10 000 r·min-1離心 30 s，棄去液體，再離心 2min,棄去殘留液體，置于室溫晾干。加入100 μL的CE Buffer 12 000 r·min-1離心 2min，保存 DNA 溶液。過夜后，采用1.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳檢測(cè)DNA，采集電泳圖像[6-8]。

1.2.4 16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增 將提取的生防菌HM-7基因組DNA進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增[6-8]。 PCR 擴(kuò)增的 引物 27F：5’GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’；1492R：5’CGGCTACCTTGTTACGACTT 3’。PCR擴(kuò)增體系：HM-7基因組DNA（100 ng·μL-1）1 μL，正向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，反向引物（4 nmol·mL-1）0.5 μL，dNTP（10 mmol·mL-1）0.5 μL，10 倍Taq酶緩沖液 2.5 μL，Taq酶（2 U·μL-1）0.2 μL 加水至 25 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃5min,變性94℃30 s，退火55℃35 s，延伸 72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，延伸 8min，擴(kuò)增完成。采用1.0%瓊脂糖凝膠80 V電泳檢測(cè)DNA，采集電泳圖像。

1.2.5 PCR產(chǎn)物收集 將電泳結(jié)果PCR產(chǎn)物依據(jù)購自上海生工的回收盒標(biāo)示的使用說明進(jìn)行回收。

1.2.6 PCR序列測(cè)序分析 回收后的PCR產(chǎn)物寄送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將拮抗菌HM-7的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在Blast（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線分析比對(duì)，利用MEGA 5.0中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來鑒定HM-7分類地位，進(jìn)化性分支模式的穩(wěn)定性用MEGA 5.0中的Bootstrap分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌HM-7培養(yǎng)特征觀察

牛肉膏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期，菌落呈米白色，邊緣光滑，有突起，水潤(rùn)透明，不產(chǎn)色素。生長(zhǎng)后期菌株呈乳白色，邊緣呈小波浪狀，有明顯的突起，褶皺，不產(chǎn)色素，菌株挑起時(shí)有拉絲，呈黏稠狀（圖1）。PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)初期與牛肉膏上相似，后期邊緣光滑，突起不明顯，菌落外緣有透明圈（圖2）。高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上僅有很少量菌落生長(zhǎng)。

圖1 牛肉膏培養(yǎng)基菌落

圖2 PDA培養(yǎng)基菌落

2.2 顯微觀察及革蘭氏染色

顯微鏡下油鏡觀察，生防菌HM-7菌株為短桿狀，具有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色呈陽性（圖3）。

圖3 革蘭氏染色油鏡觀察

2.3 分子鑒定結(jié)果

生防菌HM-7基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采集圖像（圖4），參照分子量標(biāo)準(zhǔn)可知，HM-7的DNA大小在2 500 bp以上；16S rDNA基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采集圖像（圖5），參照分子量標(biāo)準(zhǔn)條可知16S rDNA片段的長(zhǎng)度在1 500 bp左右。16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)，生防菌HM-7與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloquefaciens）、枯草芽孢桿菌（B.subtilissubsp）、萎縮芽孢桿菌（B.subtilissubsp）相似度均達(dá)99%，與地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）相似度達(dá)98%。利用MEGA軟件構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），HM-7與解淀粉芽孢桿菌處于同一分支，親緣關(guān)系更近。結(jié)合細(xì)菌生長(zhǎng)形態(tài)觀察初步鑒定HM-7為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 基因組DNA電泳圖

圖5 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖6 拮抗菌HM-7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

3 討論與結(jié)論

通過對(duì)培養(yǎng)特征觀察、顯微觀察、革蘭氏染色、16S rDNA序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步鑒定拮抗菌HM-7為解淀粉芽孢桿菌。

由于微生物殺菌劑對(duì)環(huán)境污染小、果實(shí)安全性高，其發(fā)展趨勢(shì)與人類生態(tài)環(huán)境、食品安全和生物多樣性具有良好的相容性，加之現(xiàn)代微生物工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的日趨完善，研發(fā)可替代化學(xué)殺菌劑的微生物殺菌劑是植物病害生物防治研究的重要方面。芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強(qiáng)，耐熱、耐酸堿，理化性質(zhì)穩(wěn)定，抑菌譜廣泛，是研究較為廣泛和深入的微生物類群之一，也是應(yīng)用于植物病害生物防治的生防菌的主要來源之一。我國(guó)已研發(fā)成功并投入生產(chǎn)的生防芽孢桿菌商品制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、伊天得、根腐消等[9-11]。本研究中的拮抗菌HM-7被初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌，而解淀粉芽孢桿菌是目前作為生防芽孢桿菌中的主要菌種之一，故其有望開發(fā)為生物制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。但拮抗菌HM-7的抑菌譜、拮抗物質(zhì)穩(wěn)定性、產(chǎn)生條件、分離提取以及拮抗機(jī)制等方面均有待進(jìn)一步試驗(yàn)探索。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)導(dǎo)入拮抗基因研發(fā)工程菌株，或是采用誘變育種、原生質(zhì)體融合育種等技術(shù)進(jìn)一步獲得拮抗效果更加卓越的菌株，將成為生防制劑研發(fā)的新方向。