詹道麗，黃遠飛，繆菊連，陳旭冰*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.四川好醫(yī)生藥業(yè)集團有限公司，四川成都 610031）

云南松松塔中木質(zhì)素超聲提取工藝研究

詹道麗1，2，黃遠飛1，3，繆菊連1，陳旭冰1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000；3.四川好醫(yī)生藥業(yè)集團有限公司，四川成都 610031）

采用正交實驗設(shè)計，以木質(zhì)素的提取率為指標(biāo)，通過對提取時間、超聲功率、料液比和提取溫度4個因素進行探討，優(yōu)選云南松松塔中木質(zhì)素的提取工藝。優(yōu)選出的最佳超聲提取工藝為：提取時間40m in，料液比1∶10（g/m L），超聲功率200W，提取溫度45℃，加入7滴濃硫酸量。驗證試驗表明，云南松松塔中木質(zhì)素的提取率為39.83%（RSD=0.83%，n=5）。該實驗優(yōu)選的云南松松塔中木質(zhì)素的提取工藝穩(wěn)定、可行。

云南松；松塔；木質(zhì)素；超聲；提取工藝

云南松（Pinus yunnanensis）為松科松屬植物，又名長毛松、飛松，主要分布于我國西南地區(qū)。松塔又名松元、松球，是松科植物云南松、馬尾松、油松的球果[1]。松塔具有止咳平喘、利尿、通便的功效，民間將新鮮松塔搗汁或用水煎后外用來治療風(fēng)濕[2]。

超聲提取是利用超聲波的空化效應(yīng)將細胞壁和整個生物體破裂，從而增強組分的溶出，與其他提取方法相比，具有提取效率高、操作簡單、節(jié)能的特點[3-5]。我們課題組通過前期的實驗研究，發(fā)現(xiàn)云南松松塔具有抗HIV的作用，其物質(zhì)基礎(chǔ)可能和木質(zhì)素有關(guān)[6，7]。本研究采用正交實驗探討云南松松塔中木質(zhì)素的超聲提取工藝[8，9]，以期篩選出一種高效、簡單的提取方法，為云南松松塔的進一步研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 實驗儀器

NICOLET 380紅外光譜儀（美國NICOLET公司），BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司），AE240天秤梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，數(shù)碼超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，8-10箱式電阻爐（沈陽市節(jié)能電爐廠），DFY-200搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市大德中藥機械有限公司），101-1型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（滬南實驗儀器廠）。乙醇、丙酮、苯和濃硫酸均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實驗材料

云南松松塔（采自云南大理蒼山），經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室周濃副教授鑒定為松科松屬植物云南松（Pinus yunnanensis）松塔，樣品標(biāo)本保存于大理大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的前處理

松塔自然干燥、粉碎后，過40目篩。

1.2.2 原料的脫脂脫蠟

用體積比為2∶1的苯-乙醇溶液將松塔樣品在索式提取器中抽提6h，剩余物于40℃條件下在烘箱內(nèi)烘干，即得實驗所需的脫脂脫蠟樣品，備用。

1.2.3 樣品中木質(zhì)素含量的測定

采用Klason法測定松塔中木質(zhì)素含量[10]。精密稱取1.000 0g樣品，將樣品轉(zhuǎn)移至100mL具塞錐形瓶中，加入約20℃的72%的硫酸15mL，攪拌4h后將其移入1 000mL的錐形瓶中，用560mL蒸餾水稀釋至硫酸濃度為3%，加熱回流4h。用已恒重的玻璃漏斗抽濾出木質(zhì)素，大量熱水將木質(zhì)素洗滌至中性，將木質(zhì)素轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中在105℃下干燥至恒重，稱量后計算產(chǎn)率，平行測3次，取平均值即為克拉森木質(zhì)素的含量。

圖1 提取時間對提取率的影響

將1.000 0g樣品放在坩堝中，在575℃條件下于箱式電阻爐中灰化至恒重，平行測3次，計算灰分百分含量，再按下式計算：樣品中木質(zhì)素總含量=克拉森木質(zhì)素的含量-樣品總灰分，測得云南松松塔中木質(zhì)素的總含量約為18.14%。

木質(zhì)素的提取率（%）=提取方法提取出來的木質(zhì)素質(zhì)量/松塔中木質(zhì)素質(zhì)量×100%。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 提取時間對木質(zhì)素提取率的影響

稱取云南松松塔粉末1.000 0g，置于具塞錐形瓶中用超聲波提取，因文獻報道丙酮-乙醇法[10]提取木質(zhì)素時提取率較高，因而選取體積比（V丙酮∶V95%乙醇）為2∶3的丙酮與95%乙醇作為提取劑，料液比1∶10（g/mL），加入7滴濃硫酸，提取溫度45℃，超聲功率180W，提取時間分別選用30、40、60、70min和90min。實驗結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，提取率隨提取時間先增加后降低，當(dāng)提取時間為40min時提取效果最好。這可能是因為反應(yīng)時間過長，部分木質(zhì)素降解，吸附在了松塔殘渣上；或者是反應(yīng)時間過長對木質(zhì)素結(jié)構(gòu)有破壞。

2.2 超聲功率對木質(zhì)素提取率的影響

稱取云南松松塔粉末1.000 0g，置于具塞錐形瓶中用超聲波提取，實驗條件為：料液比1∶10（g/mL），加入7滴濃硫酸，提取溫度45℃，提取時間40min。超聲功率分別選用100、120、160、180W和200W。實驗結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出，提取率隨超聲功率的增加而增加，當(dāng)超聲功率為200W時提取效果最好。這是因為增大超聲波功率意味著增大了超聲波的聲能密度，加強了空化效應(yīng)，空氣泡中的溫度和壓力相應(yīng)提高，有利于木質(zhì)素與其他物質(zhì)的解離；而功率過大，則會破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，或者是所得產(chǎn)品易在空氣中潮解而使木質(zhì)素同其他物質(zhì)一起被提取出來。

圖2 超聲功率對提取率的影響

2.3 料液比對木質(zhì)素提取率的影響

稱取云南松松塔粉末1.000 0g，置于具塞錐形瓶中用超聲波提取，實驗條件為：7滴濃硫酸，提取溫度45℃，提取時間40min，超聲功率200W。料液比分別選用1∶8、1∶9、1∶10、1∶11和1∶12 （g/mL）。實驗結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，當(dāng)料液比為1∶10（g/mL）時提取效果最好。原因在于料液比過低，提取劑不能完全浸泡松塔粉末，影響提取率；而料液比過高時，溶劑量濃度過低，反應(yīng)熱容有限，木質(zhì)素裂解、溶解過程獲得的能量有限，使得提取率偏低。

圖3 料液比對提取率的影響

2.4 提取溫度對木質(zhì)素提取率的影響

稱取云南松松塔粉末1.000 0g，置于具塞錐形瓶中用超聲波提取，實驗條件為：料液比1∶10（g/mL），加入7滴濃硫酸，超聲功率200W，提取時間40min。提取溫度分別選用25、30、35、40℃和45℃。實驗結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，木質(zhì)素的提取率隨提取溫度的增加而顯著提高，但由于溫度太高能耗較大，還可能發(fā)生木質(zhì)素的降解、重排等副反應(yīng)，致使其提取率降低。因此，溫度不宜過高，在所選取溫度下，提取溫度為45℃時提取效果最好。

圖4 提取溫度對提取率的影響

2.5 正交實驗設(shè)計

根據(jù)以上單因素實驗對木質(zhì)素提取率的影響，以木質(zhì)素的提取率為指標(biāo)，選取提取時間、超聲功率、料液比和提取溫度4個因素進行正交實驗設(shè)計，以確定在云南松松塔中木質(zhì)素提取的最佳實驗條件。正交實驗設(shè)計和實驗結(jié)果見表1和表2。

表1 水平因素表

由表2可知，4個考查因素對云南松松塔中木質(zhì)素的提取率的影響如下：提取時間A＞料液比B＞提取溫度D＞超聲功率C。最佳工藝組合為A2B2C3D1，即提取時間40min，料液比1∶10（g/mL），超聲功率200W，提取溫度45℃，加入少量（7滴）濃硫酸作為催化劑。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果表

2.6 最佳提取工藝的驗證

按照優(yōu)選工藝進行5次重復(fù)試驗，得到云南松松塔中木質(zhì)素的提取結(jié)果如表3所示。

表3 優(yōu)化提取工藝重現(xiàn)性試驗結(jié)果

從表3可計算得到云南松松塔中木質(zhì)素的平均提取率為39.83%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.83%，說明正交實驗優(yōu)選出的工藝是穩(wěn)定的。

2.7 木質(zhì)素紅外光譜分析

由于木質(zhì)素是一種混合物，很多鑒別方法并不適用，因此采用紅外光譜進行鑒別。將提取到的木質(zhì)素用KBr壓片，采用NICOLET 380紅外光譜儀測定紅外光譜圖，如圖5所示。

圖5 云南松松塔木質(zhì)素的紅外光譜圖

由圖5可知，木質(zhì)素分子的特征吸收峰包括：3 525～3 445/cm為羥基O-H伸縮振動吸收峰；1 710～1 700/cm為非共軛羰基、酯基；1 670～1 630/cm為共軛羰基；1 610～1 600/cm為芳香核振動吸收峰；1 300～1 200/cm為與紫丁香核和愈創(chuàng)木核有關(guān)的振動吸收峰；1 030～1 070/cm為仲醇、醚的C-O彎曲振動吸收峰；840～880/cm為芳香環(huán)C-H彎曲振動吸收峰。該紅外光譜圖與木屑中木質(zhì)素和油茶果殼中木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)圖譜基本一致[10，11]。

3 結(jié)論

本實驗采用超聲提取云南松松塔中的木質(zhì)素，得出最佳提取條件為：提取時間40min，料液比1∶10 （g/mL），超聲功率200W，提取溫度45℃，加入少量濃硫酸作為催化劑，在此條件下，木質(zhì)素的提取率達到39.83%。超聲提取方法具有提取率高、方法簡單、能耗低、溶劑用量少的特點，是提取云南松松塔中木質(zhì)素的一種理想方法。

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Study on the Ultrasonic Extraction Technology of Lignin from Pinecone of Pinus yunnanensis

Zhang Dao-li1, 2, Huang Yuan-fei1, 3, Miu Ju-lian1, Chen Xu-bing1, 2*
(1. College of Pharmacy, Dali University, Yunnan Dali 671000; 2. The Key Laboratory of Medical Insects and Spiders Resources for Development & Utilization Yunnan Province, Yunnan Dali 671000; 3.Gooddoctor Pharmaceutical Group, Sichuan Chengdu 610031)

To optimize extraction technology of Ligin from pinecone of Pinus yunnanensis. Taken the extraction rate of lignin as index, the optimal extraction conditions of lignin (including extraction time, ultrasonic power, and ratio of material-liquid, extraction temperature) were investigated with orthogonal experimental design. The optimal parameters were as follows: extraction time of 40 min, ratio of material-liquid of 1:10（g/mL）, ultrasonic power for 200 W, extraction temperature of 45℃, sulfuric acid as catalyst. Verification test showed the extraction rate of lignin in ponecone of Pinus yunnanensis was 39.83% (RSD = 0.25%，n = 5). The optimal method was stable and feasible.

Pinus yunnanensis; Pinecone; Lignin; Ultrasonic; Extraction technology

TQ461

A

2096-0387（2016）01-0023-04

云南省教育廳基金項目（2014Y398），國家自然科學(xué)基金項目（81260632）。

陳旭冰（1978-），女，碩士，副教授，研究方向：天然藥物化學(xué)研究。