徐國良，李雄輝，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科學(xué)院，江西南昌 330096）

復(fù)合酶法提取芹菜籽油的新技術(shù)研究

徐國良*，李雄輝，袁菊如，胡居吾，涂招秀

（江西省科學(xué)院，江西南昌 330096）

芹菜籽為原料，采用單因素法與正交設(shè)計(jì)法對(duì)復(fù)合酶法提取芹菜籽油的工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，并對(duì)自提的芹菜籽油化學(xué)成分進(jìn)行GC-M S分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復(fù)合使用，酶添加量為1.7%，料液比1∶6，pH為6.2，55℃酶解4h。在此工藝條件下，芹菜籽油的提取率45.6%，芹菜籽油總得率為4.1%；用GC-M S從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物。

芹菜籽；芹菜籽油；復(fù)合酶法；纖維素酶；α-淀粉酶；酶法提取

1 高脂血癥的危害

對(duì)人體來說，高脂血癥的危害很大。大量研究已證實(shí)，血脂過高是加速動(dòng)脈粥樣硬化多個(gè)因素中的最危險(xiǎn)（易患）因素。高脂血癥是腦卒中、冠心病、心肌梗死、心臟猝死等的危險(xiǎn)因素。

芹菜籽所含降壓、降脂成分是芹菜的50倍，芹菜、芹菜籽油對(duì)腦衰老和腦缺血具有防治作用。研究表明，芹菜籽中油脂含量豐富，含有多種藥理活性成分，具有散氣、消腫、利尿、抗腫瘤及抗衰老等功效。現(xiàn)已有研究從多個(gè)方面研究了芹菜籽油的藥理作用[1-3]。

2 研究方法及工藝參數(shù)的選擇

2.1 原料

芹菜籽（旱芹的種子，購于洪城大市場）。

2.2 儀器與試劑

果膠酶（1萬U/g）、纖維素酶（1萬U/g）、堿性蛋白酶（20萬U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、中溫α淀粉酶（1萬U/g）及耐高溫α淀粉酶（1萬U/g）均購于南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；BSA223S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Anke TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 芹菜籽預(yù)處理

將芹菜籽挑選、去除雜物，置于-60℃冰箱中放置2h后，立刻粉碎，備用。

2.3.2 芹菜籽成分的測(cè)定

1）水分的測(cè)定：取適量芹菜籽，快速粉碎，立即用水分測(cè)定儀測(cè)定芹菜籽中的水分含量。平行測(cè)定3次，取平均值。

2）粗脂肪的測(cè)定：參考GB/T 5512-2008，食品中粗脂肪的測(cè)定（索氏抽提法）。

3）分光度法。

2.3.3 芹菜籽油理化性質(zhì)的測(cè)定

1）折光指數(shù)的測(cè)定：參照GB/T 5527-2010動(dòng)植物油脂折光指數(shù)的測(cè)定[4]。

2）過氧化值（POV值）的測(cè)定：參照GB/T5538-2005動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定[5]。

3）酸值的測(cè)定：參照GB/T 5530-2005動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定[6]。

4）皂化值的測(cè)定：參照GB/T 5534-2008動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定[7]。

5）碘值的測(cè)定：參照GB/T 5532-2008動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定[8]。

2.3.4 芹菜籽油提取工藝流程

芹菜籽→干燥粉碎→加水并調(diào)節(jié)pH→微波30s→超聲400W 10min→加酶，適宜溫度酶解→升溫滅酶→ 冷卻→離心分離→ 芹菜籽油。

其中，芹菜籽提取率的計(jì)算公式如下：Y(%)＝W1/W2×100%。式中，Y—提取率；W1—提取芹菜籽油質(zhì)量，g；W2—粉碎的芹菜籽含油質(zhì)量，g。

2.3.5 芹菜籽油脂肪酸組成GC-MS分析

2.3.5.1 甲酯化

采用H2SO4-CH3OH水浴法，稱取約0.2g芹菜籽油于25mL具塞試管中，加入5% H2SO4-CH3OH溶液2mL，震蕩使充分均勻，于60℃水浴甲酯化反應(yīng)20min，冷卻后加入C6H142mL，收集C6H14層（淡黃色），加入少量無水Na2SO4（目的是脫水），密封備用。

2.3.5.2 GC-MS分析

氣相色譜條件：色譜柱為DB-35MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）初始溫度為65℃保持2min，毛細(xì)管柱采用程序升溫，升溫速率5℃/min至250℃，保持20min，進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為氦氣，載氣流速為1.2mL/min，分流比為20∶1，氣化室及檢測(cè)器的溫度均為300℃。

3 結(jié)果與分析

3.1 芹菜籽組成成分分析

采用粉碎過80目篩后的芹菜籽為原料進(jìn)行成分測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 芹菜籽組成

3.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 不同酶對(duì)提取率的影響

以過80目篩的芹菜籽為原料，分別選用果膠酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、中溫α淀粉酶及耐高溫α淀粉酶，酶用量為2%，料液比為1∶5 （g/mL），酶解時(shí)間為4h，pH和溫度均為所用酶的最佳值，酶解完成后于90℃滅酶10min，冷卻后于4 000r/min離心20min，取上層清液再離心20min后得上層液，計(jì)算出芹菜籽油的提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 酶的種類與提取率的關(guān)系

由圖1可知，單獨(dú)使用酶的提取率均不佳，效果最好的為中性蛋白酶，其提取率為16.06%（未達(dá)60.00%），其次為中溫α淀粉酶，其提取率為10.45%，其余酶的提取率均不高。因此，選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復(fù)合使用，以提高酶解速度，減小酶用量。

3.2.2 酶用量對(duì)芹菜籽油提取率的影響

分別使用0.50%、1.00%、1.50%、2.00%和2.50%的中型蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例），不同酶用量下的芹菜籽油提取率結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶用量對(duì)芹菜籽油提取率的影響

從圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，芹菜籽油的提取率也隨之升高。酶添加量在1.50%～2.00%時(shí)，芹菜籽油提取率變化較小。當(dāng)酶添加量超過2.00%后，油脂的提取率增加幅度很小，說明繼續(xù)增加酶添加量已無意義。從經(jīng)濟(jì)性角度考慮，確定1.50%的比例為最佳酶添加量。

3.2.3 料液比對(duì)芹菜籽油提取率的影響

固定酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為4h，酶解pH 為6.0，只改變料液比，測(cè)定芹菜籽油提取率的結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)芹菜籽油提取率的影響

由圖3可知，料液比對(duì)芹菜籽油的提取率油重要影響，料液比在1∶6以下時(shí)，油脂的提取率呈上升趨勢(shì)。這可能是由于料液比較小時(shí)，底物中漿液粘度大，體系流動(dòng)性差，提取率低；隨著料液比的增大，底物濃度和酶濃度達(dá)到最優(yōu)時(shí)，提取率最大，此時(shí)料液比為1∶6；隨著料液比的增大，底物濃度和酶濃度開始慢慢稀釋，提取率下降。

3.2.4 酶解pH對(duì)芹菜籽油提取率的影響

固定酶解溫度為55℃，酶解時(shí)間為4h，料液比為1∶6的條件下，只改變酶解pH，測(cè)定芹菜籽油提取率的結(jié)果如圖4。

圖4 酶解pH對(duì)芹菜籽油提取率的影響

由圖4表明，芹菜籽油提取率隨著酶解pH的升高而迅速增加，在pH 6.2時(shí)達(dá)到最高，芹菜籽油提取率為32.80%。但當(dāng)pH超過6.2時(shí)，提取率隨pH的升高而下降，這可能與中性蛋白酶和中溫α淀粉酶的最適酶解pH有關(guān)，當(dāng)酶解pH偏離其最適pH時(shí)不利于中性蛋白酶和中溫α淀粉酶作用，酶活下降嚴(yán)重，細(xì)胞壁的破壞效果減弱不利于芹菜籽油的萃取。

3.2.5 芹菜籽油提取工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)上述單因素的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，料液比（A）、酶用量（B）和pH值（C）對(duì)芹菜籽油得率影響較大。因此，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)方法對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以芹菜籽油得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)方案見表1。按表1對(duì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各處理做3次平行，測(cè)定芹菜籽油得率，取平均值，并作極差和方差分析，結(jié)果見表2、3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

F0.05（2，2）=19。

從表3比較3個(gè)因素的極差R值，RB＞RC＞RA，即酶用量＞pH值＞液料比，說明因素B對(duì)指標(biāo)的影響最大。根據(jù)K值實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，最佳工藝組合為A2B3C2，即液固比6∶1，pH值6.2，酶用量1.70%。

3.2.6 芹菜籽油收集

實(shí)驗(yàn)以傾倒料液時(shí)料與液的分離難易程度，加水振蕩料層后傾倒時(shí)物料洗出程度，乳化物層厚度及清油層厚度為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，研究離心時(shí)轉(zhuǎn)速及時(shí)間對(duì)提油率的影響。

表4 芹菜籽油的理化性質(zhì)

表5 芹菜籽油化學(xué)成分分析結(jié)果

當(dāng)轉(zhuǎn)速在3 500～4 500rpm時(shí)，選擇離心時(shí)間為45min，料與液的分離效果不明顯，傾倒時(shí)料與液難以分離，且上層油層乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，油層顏色呈蛋黃色，清油層薄之不可見。

圖5 芹菜籽油總離子流圖

當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為7 000～8 500rpm時(shí)，選擇離心時(shí)間為15min，離心即能達(dá)到料與液分離的目的，溶液可輕易的傾倒出離心杯，清油層與乳化物層界限明顯，加水振蕩物料層有少量或極少物料被洗脫，說明離心后物料厚實(shí)沉積在離心杯底部，達(dá)到分離的目的。

離心后將收集到的芹菜籽油過無水硫酸鈉層，即得芹菜籽油，芹菜籽油總得率為4.10%，芹菜籽油提取率為45.60%。

3.3 芹菜籽油的理化性質(zhì)

芹菜籽油呈棕綠色，澄清透明，室溫下流動(dòng)性良好，具有強(qiáng)烈持久辛香、藥草香氣。

相關(guān)理化性質(zhì)以及與大豆原油、花生原油、芝麻原油的比較結(jié)果見表4。由表4可以看出，與其他3種植物原油相比，芹菜籽的折光指數(shù)與芝麻原油接近，高于大豆原油和花生原油；過氧化值與酸值均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)；皂化值均比大豆原油、花生原油和芝麻原油低，因此含有較多的不皂化物；碘值低于大豆原油和芝麻原油，與花生原油接近。綜上分析比較，如果對(duì)芹菜籽油進(jìn)行合理精制達(dá)到國家食用植物油脂相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)后，預(yù)計(jì)可以成為一種植物油脂的新來源。

3.4 芹菜籽油化學(xué)成分GC-MS分析

取適量芹菜籽油，以無分流方式進(jìn)樣，進(jìn)行GC-MS分析，得總離子流圖，共分離出26個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見圖5，經(jīng)GC-MS計(jì)算機(jī)的NIST庫自動(dòng)檢索，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照分析，鑒定了23種化學(xué)成分，用面積歸一法計(jì)算出其相對(duì)含量，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，用GC-MS從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物，檢出率達(dá)99.94%，其中酯類物質(zhì)占86.55%；含量最高的為反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次分別為9,12-十八烷二烯酸甲酯（亞油酸）（17.26%），亞油酸是人體必需脂肪酸，對(duì)人體有多種生理功能，十六烷酸甲酯（9.68%），4-甲基苯酚（6.19%）等，都是該芹菜籽油的主要成分。

4 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳工藝條件為：選擇中性蛋白酶和中溫α淀粉酶（1∶1比例）復(fù)合使用，酶添加量為1.70%，料液比1∶6，pH為6.2，55℃酶解4h，在此工藝條件下，芹菜籽油的提取率45.60%，芹菜籽油總得率為4.10%。由此試驗(yàn)可以看出，可能是由于芹菜籽油揮發(fā)油含量高。用GC-MS從芹菜籽油中共鑒定出23種化合物，檢出率達(dá)98.30%，其中酯類物質(zhì)占86.55%；含量最高的為反式-9-十八烯酸甲酯（52.79%），其次為9,12-十八烷二烯酸甲酯（亞油酸）（17.26%）。纖維素酶與α-淀粉酶復(fù)合使用工藝對(duì)芹菜籽油進(jìn)行富集與分離工藝具有創(chuàng)新性突出的特點(diǎn)。

[1]王文寶,李杰,劉彥麟,等.芹菜籽粉對(duì)高脂膳食大鼠血脂及肝功能的影響[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào),2012,6(33):143-145.

[2]徐成,沈志斌,丁倩,等.芹菜籽油抗腦缺血作用的研究[J].中成藥,2007,29(6):44-45.

[3]劉輝.芹菜籽油的提取純化及降血脂功能研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué),2009:15-19.

[4]國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5527-2010 植物油脂檢驗(yàn)折光指數(shù)測(cè)定法[S].北京:遼寧省糧油檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)所等,2010.

[5]薛雅琳,張穎,劉建濤.GB/T 5538-2005 動(dòng)植物油脂 過氧化值測(cè)定[S].北京:南京經(jīng)濟(jì)學(xué)院,2005.

[6]薛雅琳,張穎,咼琴.GB/T 5530-2005 動(dòng)植物油脂 酸值和酸度測(cè)定[S].北京:國糧局西安油脂科研院,2005.

[7]張世宏,何東平,黃小平.GB/T 5534-2008 動(dòng)植物油脂 皂化值的測(cè)定[S].北京:武漢工業(yè)學(xué)院、國家糧食儲(chǔ)備局武漢科學(xué)研究設(shè)計(jì)院,2008.

[8]劉良忠,何東平,張世宏.GB/T 5532-2008 動(dòng)植物油脂 碘值的測(cè)定[S].北京:武漢工業(yè)學(xué)院,2008.

Study on the Extraction of Celery Seed Oil by Complex Enzyme Method

Xu Guo-liang*, Li Xiong-hui, Yuan Ju-ru, Hu Ju-wu, Tu Zhao-xiu
(Jiangxi Academy of Sciences, Jiangxi Nanchang 330096)

Celery seeds as raw material, composite enzymatic extraction conditions of celery seed oil was optimized by single factor method and orthogonal design method and on the chemical composition of celery seed oil from the GCMS analysis the experimental results show that the selection of neutral protease and medium temperature amylase (1 ∶1) composite, enzyme dosage is 1.7%, the material liquid ratio 1 ∶ 6, pH 6.2, 55 ℃ enzymatic 4h, under this condition, celery seed oil extraction rate was 45.6%, total yield is 4.1% celery seed oil.From celery seed oil were identified 23 kinds of compounds with GC-MS.

Celery seed; Celery seed oil; Compound enzyme; Cellulase; Enzyme extraction

TS264.4

A

2096-0387（2016）01-0015-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)31260400）。

徐國良（1964-），男，本科，副研究員，研究方向：天然產(chǎn)物。