施星臣　耿哲　施鑫鶴

骨肉瘤Saos-2細(xì)胞Set7/9基因沉默及基因治療靶點(diǎn)構(gòu)建

施星臣耿哲施鑫鶴

目的：構(gòu)建沉默的人Set7/9的真核表達(dá)載體，篩選其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的骨肉瘤Saos-2細(xì)胞株，評(píng)價(jià)干擾效果以及對(duì)骨肉瘤相關(guān)基因表達(dá)和細(xì)胞增殖的影響，為臨床骨肉瘤基因治療提供新靶點(diǎn)。方法：依據(jù)靶向序列，構(gòu)建人Set7/9基因的shRNA和對(duì)照載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞Saos-2。應(yīng)用Real-time PCR以及Western-blot方法檢測(cè)其基因和蛋白質(zhì)水平，確定該基因的沉默情況。結(jié)果：構(gòu)建載體Set7/9-shRNA，Real-time PCR和Western-blot結(jié)果顯示，沉默后Set7/9基因和蛋白表達(dá)明顯被抑制，而與其相關(guān)的Sirt1、Suv39h1蛋白表達(dá)水平提高，細(xì)胞增殖率增加。結(jié)論：沉默Set7/9基因后，上調(diào)與其相關(guān)的Sirt1和Suv39h1蛋白表達(dá)水平，Set7/ 9基因在骨肉瘤Saos-2細(xì)胞系中可能調(diào)控其的表達(dá)。此外，細(xì)胞增殖效率增加表明Set7/9具有抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的作用。

Set7/9；Saos-2細(xì)胞；Western-blot

【Abstract】Objective：To silencehuman gene Set7/9 and screen outstable transfection cell line in Saos-2，and investigate the impact ofknockdown ofSet7/9 and influence to theexpression of the related genes.Supplynew target forclinical testand therapy.M ethods：The target oligowasdesigned by thesoftand synthesized，shRNA interferencevectorand the controlvectorwere constructed and transfected into Saos-2 cells.Then Real-time PCR and western-blotwere performed for detection of knockdown of Set7/9.Results：The shRNA interference vector wasconstructed and transfected into Saos-2 cellssuccessfully，comparedwith thenegative controlgroup，theexpression ofSet7/9wasdramatically down-regulated.Meanwhile，expression of related protein Sirt1 up regulated.Conclusion：Down regulation the expression of Set7/9 can upregulate Sirt1and Suv39h1，imply thatSet7/9may regulate theirexpression in Saos-2，and suppress theproliferation.

【Keywords】Set7/9；Saos-2 cells；Western-blot

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）又稱為成骨肉瘤，是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來(lái)的一種最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，在兒童和年輕成人中具有高侵襲性和遠(yuǎn)端高發(fā)轉(zhuǎn)移性［1］。小兒骨惡性腫瘤治療包括新輔助化療和手術(shù)技術(shù)，治療方法雖有巨大進(jìn)步，但仍有大量的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的病例［2，3］。骨肉瘤的治愈率約為25%，治愈水平幾乎停滯在20年前［4，5］。因此，迫切需要研究其發(fā)病機(jī)制，為藥物研究提供新的靶點(diǎn)，從而為臨床給出新的治療方案。

表觀遺傳學(xué)方面的研究逐漸成為熱點(diǎn)，其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用也不斷被揭示，其中越來(lái)越多的報(bào)道探討了SET結(jié)構(gòu)域在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用［6，7］。SET結(jié)構(gòu)域是蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶（protein ysine methyltransferases，PLMTs或PKMTs）家族成員［8，9］。有報(bào)道Set7/9可介導(dǎo)Suv39h1甲基化，致使基因組不穩(wěn)定［10］，對(duì)Sirtuin 1（Sirt1）去乙酰化起作用［11］，而Suv39h1與腫瘤發(fā)病有關(guān)。對(duì)于Set7/9在骨肉瘤細(xì)胞中如何影響Suv39h1以及Sirt1基因和蛋白水平表達(dá)，是否可以調(diào)控其細(xì)胞活性，仍有待研究。

研究報(bào)道指出Set7/9、Suv39h1、Sirt1等基因之間存在一定相互作用，而這些作用與一些疾病的發(fā)生有關(guān)。這三個(gè)基因在骨肉瘤細(xì)胞中的作用，特別是起關(guān)鍵調(diào)控作用的Set7/9基因鮮有報(bào)道。本研究以人骨肉瘤Saos-2細(xì)胞株為研究對(duì)象，構(gòu)建了Set7/9-shRNA質(zhì)粒，沉默骨肉瘤細(xì)胞株中Set7/9基因，以探討其在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2中所發(fā)揮的作用。為臨床治療提供依據(jù)和預(yù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)；并在基礎(chǔ)研究方面為骨肉瘤細(xì)胞活性及細(xì)胞周期等方面的研究提供靶向生物治療的理論支持。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑和設(shè)備E.coli.Top10感受態(tài)細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2均由本實(shí)驗(yàn)室保存，DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNAmarker、瓊脂糖等均購(gòu)自加拿大BBI公司；抽提質(zhì)粒的試劑盒購(gòu)買于上海生工生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM、胎牛血清FBS、雙抗（青鏈霉素）均購(gòu)自GIBCO公司；Polybrene購(gòu)自Sigma公司；PBS購(gòu)自AMEROSCO公司；SIRT1多克隆抗體SIRT1（sc-15404），SUV39H1單克隆抗體SUV39H1（sc-377112）SET7/9的單克隆抗體SET7/9（sc-56774），購(gòu)自SANTA CRUZ公司；熒光顯微鏡生產(chǎn)商為Motic公司，MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)買于Stratagene公司。

1.2構(gòu)建SETD7-shRNA載體質(zhì)粒及其鑒定應(yīng)用在

線軟件http://genomics.jp/sidirect/，合并通過(guò)文獻(xiàn)查閱列出SET7/9基因干擾序列為GGGCACCTGGACGATGACGGA，TTCTCCGAACGTGTCACGT為陰性對(duì)照。為避免終止信號(hào)產(chǎn)生，loop結(jié)構(gòu)為TTCAAGAGA。兩端酶切位點(diǎn)EcoRI與BamHI。按照如下程序在PCR儀上退火:95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火后得濃度為10μM的shRNA模板。酶切載體，電泳后回收。隨后，連接反應(yīng)，挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序。

1.3慢病毒載體的包裝及侵染細(xì)胞將慢病毒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，48h收集上清并濃縮；72h再收集濃縮。滴度1×108TU/m l，重組后病毒侵染Saos-2細(xì)胞，puromycin篩選獲得穩(wěn)篩株細(xì)胞。

1.4SET7/9表達(dá)效果檢測(cè)puromycin選擇后，擴(kuò)增穩(wěn)篩株，收樣，提取總RNA，熒光定量PCR檢測(cè)，SET7/9基因的（目的）F primer：CACAGATGGGAGACTGATCTTCAAG，R primer：TTACTTCTCCTACAAGGCT TCCTCC，PCR條件為：95℃，2分鐘預(yù)變性；95℃，30秒；63℃，40秒；40個(gè)循環(huán)；western-blot檢測(cè)干擾后SET7/9蛋白表達(dá)情況。

1.5Saos-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)采用CCK8試劑檢測(cè)Saos-2細(xì)胞增殖。制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)；接種到96孔板中，3個(gè)重復(fù)；37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入10μl CCK8；培養(yǎng)3小時(shí)，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件；測(cè)定450nm吸光度。

2　結(jié)果

圖1　挑取Set7/9菌落測(cè)序鑒定

2.1Set7/9-shRNA載體質(zhì)粒的鑒定和測(cè)序結(jié)果空載體pGLV3/H1/GFP/puro連接插入子，之后轉(zhuǎn)化菌株Top10，挑取菌落并抽提質(zhì)粒。用EcoRI進(jìn)行單酶切，電泳進(jìn)行初步判斷，并且將符合8000bp的酶切條帶所對(duì)應(yīng)的克隆挑取2個(gè)，進(jìn)行測(cè)序證明SET7/9shRNA載體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。2.2 SET7/9基因沉默情況穩(wěn)篩株細(xì)胞擴(kuò)增，72h收樣，Western-blot、Realtime PCR檢測(cè)。從蛋白和基因水平上對(duì)Saos-2細(xì)胞中SET7/9基因的沉默情況進(jìn)行分析，Western-blot檢測(cè)顯示，其蛋白表達(dá)也顯著下調(diào)，同樣該基因表達(dá)水平明顯被抑制（P＜0.05）。β-actin為內(nèi)參，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染72h SET7/9基因以及蛋白表達(dá)水平。見(jiàn)圖2。

圖2　SET7/9蛋白與基因的沉默效果

2.3SET7/9基因沉默可以上調(diào)SIRT1表達(dá)同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組中，用Western-blot對(duì)SIRT1及SUV39H1的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，SIRT1蛋白表達(dá)水平顯著增加，SUV39H1蛋白的表達(dá)也有上調(diào)，但變化不顯著，見(jiàn)圖3。

圖3　SET7/9沉默后SIRT1與SUV39H 1蛋白表達(dá)變化

2.4SET7/9基因影響Saos-2細(xì)胞增殖對(duì)SET7/9基因進(jìn)行沉默實(shí)驗(yàn)后，相對(duì)于野生型和陰性對(duì)照組Saos-2細(xì)胞的增殖率顯著提高，從轉(zhuǎn)染后72h開(kāi)始出現(xiàn)差異，到達(dá)120h時(shí)沉默組與野生型組差異最顯著，在96h時(shí)，沉默組與陰性對(duì)照組差異最明顯，見(jiàn)圖4。

圖4　SET7/9基因沉默后骨肉瘤細(xì)胞增殖率提高

3　討論

骨肉瘤是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來(lái)，是一種最常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤，其中小兒骨惡性腫瘤中最為常見(jiàn)。目前對(duì)于骨肉瘤成因，特別是重要作用機(jī)制和相關(guān)因子的研究鮮有報(bào)道，因此，從分子生物學(xué)角度入手，深入探討其發(fā)病機(jī)制，有助于提高骨肉瘤治療的針對(duì)性，提高患者生存率。

對(duì)具有修飾功能的蛋白進(jìn)行研究有助于揭示其抑癌等作用的機(jī)制，Set7/9基因具有對(duì)多個(gè)與腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控作用，對(duì)其作用機(jī)制的研究可以為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制提供參考依據(jù)。國(guó)內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)Set7/9可以調(diào)控Sirt1，而Sirt1可以抑制p53乙?；瑢?dǎo)致p53乙?；皆龈撸?2］；p53作為抑癌基因已有較多報(bào)道，在胃癌等疾病中其發(fā)生突變是早期事件［13-15］。在異染色質(zhì)形成及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，Set7/9可以影響Suv39h1蛋白的甲基化水平［10］，研究指出，Suv39h1對(duì)于組蛋白H3K9的甲基化具有較大作用，H3K9甲基化與胃癌等在內(nèi)的一些腫瘤發(fā)生有關(guān)。因此，結(jié)合Set7/9已有的功能報(bào)道，本文對(duì)其在骨肉瘤細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究。選擇一種有效的和長(zhǎng)期的沉默Set7/9的方法是必需的。脂質(zhì)體介導(dǎo)shRNA進(jìn)入細(xì)胞通常轉(zhuǎn)染效率低，而慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得穩(wěn)定株在越來(lái)越多的研究中得到應(yīng)用［16］。通過(guò)改造HIV-1形成的逆轉(zhuǎn)錄病毒［17］，shRNA可以進(jìn)行長(zhǎng)期基因沉默研究的方法［18-20］，能夠?qū)⒛康幕蛘系饺旧w上，得到穩(wěn)定的細(xì)胞株。

本研究成功構(gòu)建了Set7/9-shRNA質(zhì)粒，初步探索了與其相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況及在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2中該基因的功能。研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2中沉默Set7/9基因后，與其相關(guān)作用的Sirt1蛋白表達(dá)水平顯著提高，Suv39h1蛋白表達(dá)也有所升高。這表明在Set7/9沉默后，Sirt1，Suv39h1所具有的去乙?；图谆饔迷谠鰪?qiáng)，使得細(xì)胞更傾向于增殖和分裂。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了在Saos-2中沉默Set7/9基因后，細(xì)胞增殖率明顯高于野生型和陰性對(duì)照組，由此可以看出Set7/9基因?qū)τ诠侨饬鯯aos-2細(xì)胞的增殖具有一定的調(diào)控作用。

本研究通過(guò)沉默Set7/9基因，觀察了與其相關(guān)因子的表達(dá)變化和甲基化作用，發(fā)現(xiàn)這些因子水平的變化可能對(duì)細(xì)胞周期和活性產(chǎn)生影響，對(duì)于骨肉瘤中這些因子的相互作用，有待更深入的研究，以充實(shí)骨肉瘤的形成及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展靶向藥物研究和臨床檢測(cè)治療提供依據(jù)。

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Establishment and effection of Saos-2 Stable cell linesw ith Saos-2 gene knockdown and new thinking for therapy

ShiXingchen1, Geng Zhe2,ShiXinhe3.1.DepartmentofOrthopaedics,the Second People'sHospital ofLanzhou City,Lanzhou 730046,China；2.SchoolofBasic Medicine,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China；3.Department ofCentral Laboratory,Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou 730030,China

A

1004-2725（2016）09-0646-04

甘肅省青年科技基金計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：1506RJYA315）

730046甘肅蘭州，蘭州市第二人民醫(yī)院骨科（施星臣）；730000甘肅蘭州，蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所（耿哲）；730030甘肅蘭州，蘭州大學(xué)第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（施鑫鶴）

施星臣，E-mail：shixh@lzu.edu.cn