張淑紅， 包格日樂， 李治國， 陳紅歌

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002； 2. 商丘師范學院生命科學學院，河南 商丘 476000； 3. 商丘師范學院環(huán)境與規(guī)劃學院，河南 商丘 476000)

喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)冰川細菌多樣性研究

張淑紅1, 2， 包格日樂1， 李治國3， 陳紅歌1

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南 鄭州 450002； 2. 商丘師范學院生命科學學院，河南 商丘 476000； 3. 商丘師范學院環(huán)境與規(guī)劃學院，河南 商丘 476000)

通過純培養(yǎng)和高通量測序，對喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)冰川雪樣和水樣細菌多樣性進行了研究。純培養(yǎng)結果表明，冰川細菌由Bacteroidetes、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Proteobacteria4個門組成,屬水平由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成；高通量測序結果表明，冰川細菌主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes3個門組成，由Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax等屬組成。2種方法綜合起來更能全面地分析細菌群落信息。雪環(huán)境和水環(huán)境的細菌多樣性差異不大。細菌群落組成既有重復的，也有各自環(huán)境所特有的。同時也檢測到了熊彩崗日地區(qū)冰川所特有的細菌類群。

細菌；多樣性；冰川；熊彩崗日地區(qū)

冰川,由于其獨特的地理環(huán)境特征，蘊藏著大量具有獨特遺傳學和適應環(huán)境變化機制的微生物，是一個天然的微生物“儲存庫”，記錄著不同時期大氣環(huán)流向冰川輸送的微生物菌群數(shù)量和結構等信息，是包含生物進化以及地球上生物生存環(huán)境變化信息的優(yōu)良介質[1]。以冰芯和雪樣中微生物為研究對象的工作諸多，而且，隨著近年來冰川退縮的不斷加劇，關于冰川退縮前沿裸露地微生物群落演替特點受到了諸多關注。而對于退縮過程中形成的不同生境之間微生物群落差異的研究較少，僅見到了老虎溝12號冰川的報道[2,3]，而且運用高通量測序技術研究冰川微生物的工作才剛剛開始。本研究通過對尚未開展過冰川微生物研究工作的熊彩崗日地區(qū)的細菌進行純培養(yǎng)及高通量測序分析，采集了不同海拔處的高位點雪、消融區(qū)雪、冰川融水及冰川末端河水樣品。一方面分析不同冰川環(huán)境細菌群落的差異，另一方面將熊彩崗日地區(qū)冰川的菌群結構與其它冰川位點進行比較，分析熊彩崗日地區(qū)冰川細菌群落所獨有的特征。

1 材料與方法

1.1樣品的采集

喀拉昆侖山位于青藏高原西北側，其主體部分在新疆維吾爾自治區(qū)與克什米爾的交界線上。獅泉河氣象站(32°30′N，80°08′E，2 924 m)在1961—2013年的觀測結果是，年均溫度為0.71 ℃，年均沉積物厚度為70.60 mm。本試驗采樣地點為喀喇昆侖南部的熊彩崗日地區(qū)，1968—2013年該地區(qū)冰川總面積減少了2.63 km2，退縮面積占1968年此地區(qū)冰川總面積的1.45%[4]。

2013年7月，在喀拉昆侖南部熊彩崗日地區(qū)共采集4個樣品：高位點雪樣(34°15′11.70″N，80°17′19.40″E，5 881 m)、消融區(qū)雪(34°15′11.36″N，80°17′32.89″E，5 731.21 m)、冰川融水(34°15′11.28″N，80°17′32.89″E，5 730.45 m)、河水(34°15′14.10″N，80°17′33.60″E，5 704.79 m)。每種樣品3個重復。試驗樣品低溫轉運，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2可培養(yǎng)細菌的純培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)基 R2A培養(yǎng)基： 蛋白胨0.5 g·L-1，酵母粉0.5 g·L-1，胰蛋白胨0.5 g·L-1，酸水解酪蛋白0.5 g·L-1，葡萄糖0.5 g·L-1，可溶性淀粉0.5 g·L-1，磷酸氫二鉀0.3 g·L-1，丙酮酸鈉0.3 g·L-1，七水硫酸鎂0.05 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.2～7.4。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.0～7.2。

TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨15 g·L-1，大豆胨5 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，pH值為7.0～7.4。

1.2.2 分離與純化 用R2A、0.25R2A、0.2LB、0.5TSA 4種培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。在無菌條件下，每種樣品分別吸取100 μL，涂布于4種培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基涂6個平板，3個置于4 ℃培養(yǎng)15 d，另外3個置于15 ℃培養(yǎng)7 d。形成肉眼可見的菌落后，依據(jù)細菌形態(tài)特征進行分離與純化，統(tǒng)計同一形態(tài)菌落數(shù)及總菌落數(shù)。純化后的細菌于4 ℃斜面保存及30%甘油-20 ℃保藏備用。

1.2.3 恢復培養(yǎng)的菌株DNA提取 參照ZHOU等[5]方法提取細菌DNA并做了一些改動。具體過程如下：(1)吸取菌液于2 mL離心管中，4 000 r·min-1離心10 min收集菌體。(2)菌體中加入1 mL 磷酸緩沖液PBS(KCl 0.2 g·L-1，KH2PO40.24 g·L-1，NaCl 8 g·L-1，Na2HPO41.44 g·L-1)混勻，12 000 r·min-1離心4 min，此過程為洗菌。(3)棄上清液，加入650 μL 提取液(100 mmol Tris-Cl，100 mmol Na2-EDTA，100 mmol Na2HPO4，1.5 mmol NaCl，1% CTAB)，10 g·L-1蛋白酶K和10 g·L-1溶菌酶各10 μL，氣浴振蕩器37 ℃振蕩30 min。(4)加入60 μL 20% SDS，65 ℃水浴2 h，水浴過程中每20 min輕輕上下顛倒幾次。(5)6 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，上下顛倒幾次，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液。(6)加入10 g·L-1RNA酶10 μL，37 ℃水浴30 min。(7)再次加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)進行抽提，8 000 r·min-1離心10 min。(8)取上清液加入0.6倍體積異丙醇沉淀1 h，離心30 min。(9)棄上清液，加入預冷的70%乙醇，12 000 r·min-1離心10 min，該步驟重復1次。(10)室溫下風干后，加入約20 μL ddH2O，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 16S rDNA擴增 以提取的DNA為模板，使用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1 492R(5’-CGGTTACCTTGTTACGAC TT-3’)擴增16S rDNA[6]，擴增片段長度大約1 500 bp。PCR擴增反應體系(50 μL)：1×PCR緩沖液(Takara)，0.2 mmol dNTP，2.5 mmol MgCl2，正反向引物各0.2 μmol，rTaq DNA聚合酶(Takara)1.25 U，DNA模板1 μL。反應參數(shù)：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 序列提交 將所有序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊號為KP114466-KP114524。

1.3高通量測序分析細菌遺傳多樣性

1.3.1 樣品總DNA的提取 樣品用0.22 μm孔徑濾膜過濾，過濾后把濾膜剪碎，用PBS緩沖液將菌體清洗下來，DNA提取方法同上述1.2.3。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。

表1 5’ 端反向引物標簽Table 1 5’ tagged PCR reversed primers

PCR反應體系為：1×FastPfu Buffer，0.25 mmol dNTP 2 μL，0.1 μmol引物，TransStart FastPfu高保真酶(TransGen AP221-02)2.5 U，DNA 模板10 ng，總體積20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min。保存于10 ℃。PCR儀為ABI GeneAmp?9700型。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將符合目的片段長度的平行擴增產(chǎn)物合并，使用Tiangen Gel Purification Kit試劑盒進行純化回收，利用NanoDrop超微量分光光度計測定純化后產(chǎn)物濃度，將所有位點樣品等濃度混合后上機測序。

1.3.3數(shù)據(jù)的分析方法

1.3.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及數(shù)據(jù)優(yōu)化 根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣品的測序數(shù)據(jù)，按照barcode標簽完全匹配方式提取有效序列。使用Qiime[7]找出barcode標簽序列前引物序列并去掉。再去掉小于200 bp的堿基、模糊堿基及單堿基重復區(qū)，同時檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列并去除。

1.3.3.2 OTU聚類 使用Uparse[8]方法進行OTU聚類，OTU中序列相似性設為97%，得到OTU的代表序列，使用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，得到各樣品OTU豐度統(tǒng)計表。

1.3.3.3 分類學分析 采用RDP classifier貝葉斯[9]算法對OTU代表序列進行分類學分析，并在各個水平統(tǒng)計每個樣品的群落組成。使用Silva[10]數(shù)據(jù)庫進行比對。

1.3.3.4 Alpha豐富程度分析方法 采用非參數(shù)法(Nonparametric estimators Good)估算樣品代表群落的蓋度指數(shù)(Community coverage)，利用mothur軟件計算比較每個樣品的 Shannon、Simpson、Chao1和ACE多樣性指數(shù)。

1.3.3.5 稀釋性曲線 對序列采用隨機抽樣的方法，以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構建稀釋性曲線[11]。利用Mothur[12]做稀疏分析，利用R語言工具制作曲線圖。

1.3.3.6 群落結構組分圖 使用統(tǒng)計學方法，觀測樣品在不同分類水平上的群落結構。通常使用較直觀的餅圖或柱狀圖等形式呈現(xiàn)[13]?；趖axa_summary文件夾中的數(shù)據(jù)表，利用R語言工具作圖或在Excel中編輯作圖。

2 結果與分析

2.1細菌純培養(yǎng)結果

根據(jù)恢復出的菌株菌落特征，篩選出58個菌株，用于16S rDNA基因序列分析。

2.1.1 門水平的群落構成 此冰川細菌由Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes、Deinococcus-Thermus4個門組成，各自在不同樣品中的相對豐度如表2所示。4個門以Proteobacteria所占比例最高，其次為Actinobacteria，Bacteroidetes所占比例次之，Deinococcus-Thermus位居最后。

表2 不同樣品門水平的細菌類群相對豐度Table 2 Relative abundance of bacterial community at phylum level in different samples

2.1.2 屬水平的群落構成 在屬水平上，此冰川細菌由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成(表3)。

表3 不同樣品屬水平上主要細菌類群的相對豐度Table 3 Relative abundance of bacterial community at genus level in different snow and water samples

2.2高通量測序結果

2.2.1 有效序列提取 各樣品有效序列和優(yōu)化序

列統(tǒng)計見表4。2個樣品經(jīng)454高通量測序共得到20 280條有效序列，序列平均長度為449.4 bp。對結果進行去雜，共得到11 444條優(yōu)質序列，序列平均長度為402 bp。表4同時顯示，平均優(yōu)化效率為56.16%。優(yōu)化序列用于樣品間細菌豐富度和多樣性的評估。

表4 各樣品序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 4 Statistics of sample sequence

2.2.2 樣品取樣深度 本研究在0.97的相似度水平上繪制樣品的稀釋曲線，結果如圖1。當序列較少時，隨著樣本中測序數(shù)量的增加，OTU數(shù)目劇增．隨著測序量的不斷增大，OTU數(shù)目增加幅度趨于平緩，說明本次試驗的測序量基本能夠反映樣品中細菌群落的多樣性組成。

圖1 樣品稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction cures of different samples

2.2.3 多樣性指數(shù)分析 消融區(qū)雪和融水樣得到的reads、OTU豐度、ACE、Chao指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson指數(shù)如表5所示。圖1的稀釋性曲線以及表5的多個指標的結果都說明消融區(qū)雪的細菌多樣性大于冰川融水的多樣性。

表5 不同樣品物種多樣性和豐富度估計Table 5 Species diversity and abundance estimation

2.2.4 Venn圖 如圖2所示，消融區(qū)雪所特有的OTU為39，冰川融水所特有的OUT為28。二者共有的OTU為67，占消融區(qū)雪總OTU的62%，冰川融水總OTU的70.5%。共有OTU數(shù)在各自樣品中所占比例較大，說明2種樣品組成較相似。

圖2 消融區(qū)雪和冰川融水OTU分布Venn圖Fig.2 Number of unique and shared OTU between snow of ablation zone and glacial meltwater

2.2.5 門水平的群落構成 經(jīng)454高通量測序分析，2個樣品共檢測到細菌的11個門：Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Candidate division TM7、Chloroflexi、Cyanobacteria、Firmicutes、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Proteobacteria、Verrucomicrobia，主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes這3種組成(表6)。其中Proteobacteria為2種樣品的優(yōu)勢類群，在消融區(qū)雪所占比例為88.13%，而在冰川融水中為93.47%。Bacteroidetes在消融區(qū)雪和冰川融水所占比例分別為8.75%和4.87%，F(xiàn)irmicutetes在消融區(qū)雪和冰川融水所占比例分別為1.19%和1.31%，其他類群在2個樣品中所占比例均小于1%。

表6 各樣品在主要門分類水平上的菌群組成及其相對豐度Table 6 Taxonomy information of dominant bacteria at phylum level and their relative abundance

2.2.6 屬水平的群落構成 在屬的分布上(圖3)，2個樣品中至少1個樣品所占比例為1%以上的有Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax11個屬。

圖3 基于高通量測序的細菌屬水平的群落結構Fig.3 Bacterial community distribution at genus levels based on high-throughput sequencing

3 討論

在本研究中，高通量測序的結果是Massilia在雪樣中的比例比在冰川融水中的低，而在老虎溝12號冰川，通過培養(yǎng)方法得到的結果是Massilia在雪樣中的比例比在土樣中的高[2]。存在這種差異的原因,一方面可能是由于研究方法的差異，另一方面也可能是研究位點的差異。如在天山1號冰川，也用了高通量測序，但未檢測到該屬[14]。而在玉珠峰，Shen等不僅檢測到了該屬，而且還對該屬進行了新種的鑒定[15]。

在門水平上，純培養(yǎng)和高通量測序同時檢測到了大量的Proteobacteria和Bacteroidetes。但每種方法都檢測到了另一種方法所未檢測的細菌群落。如純培養(yǎng)檢測到了大量的Deinococcus-Thermus，而高通量測序則檢測到了大量的Firmicutes。在屬水平上，除了Massilia、Cryobacterium、Devosia、Flavobacterium、Pseudomonas5種屬被2種方法同時檢測到以外，其它的屬僅被1種方法所分析到。HUANG等[16]使用標記編碼FLX擴增子焦磷酸測序(Bacterial Tag Encoded FLX Amplicon Pyrosequencing，bTEFAP)、克隆文庫構建、純培養(yǎng)3種方法對南極Tawani(P)湖的細菌多樣性進行研究，結果表明使用多種方法研究比任何一種單一的方法能獲得更全面的細菌群落信息。這一結果與本研究的結果相一致。因此本研究將2種方法所得到的結果綜合起來，用于分析熊彩崗日冰川的細菌群落多樣性。

2種方法獲得的所有屬水平的細菌與其他多個位點的冰川進行比較，如通過高通量測序分析的天山1號冰川[14]、High Arctic[17]、南極的Tawani湖[16]、老虎溝12號冰川[3]，通過純培養(yǎng)以及克隆文庫構建等方法研究的東絨布冰川[18-19]、馬蘭冰川[20-21]、Palong[18]、 Kafni冰川土樣[22]、老虎溝雪坑樣品[23]、GISP 2[24]、南極Terra Nova海灣的水柱[25]、敦德冰芯及慕士塔格冰芯[1]。仍有上述這些研究中尚未見到的細菌資源，如：高通量測序檢測到的Arcobacter、Arcticibacter、Blastocatella、Blautia、Paraprevotella、Phascolarctobacterium、Pseudofulvimonas、Subdoligranulum，培養(yǎng)方法獲得的Mycetocola、Rugamonas。因此，增加研究位點，對于更好的了解地球上冰川細菌的多樣性很有必要[17]。

通過純培養(yǎng)與高通量測序相結合的方法，對熊彩崗日地區(qū)冰川不同海拔形成的雪樣和水樣中的細菌多樣性進行了分析。純培養(yǎng)結果表明，Massilia只在雪樣中存在，Salinibacterium只在水樣中存在，其他屬在雪樣和水樣中都存在，說明雪樣和水樣組成是比較相似的。圖2中，消融區(qū)雪和冰川融水共有OTU數(shù)占各自樣品的比例較大，Shannon指數(shù)也相近，也說明雪樣和水樣的組成是相似的。LAROSE等[26]對極地雪和融水的細菌的研究表明，雪和融水中群落組成具有很大差異。劉勇勤等[27]對Yala冰川雪、冰磧湖、冰川溪流3種生境細菌多樣性的研究表明，冰川雪和水是高度多樣化的系統(tǒng)。本研究結果與以上結果并不一致。上述2種研究使用克隆文庫的方法，與本研究使用方法不同，同時研究位點也有差異，這些可能都是與本研究結果不一致的原因。

4 結論

本研究利用培養(yǎng)及高通量測序的方法對熊彩崗日地區(qū)冰川細菌多樣性及分布特征進行了研究，培養(yǎng)結果表明，冰川細菌由Bacteroidetes、Actinobacteria、Deinococcus-Thermus、Proteobacteria 4個門組成,屬水平由Pseudomonas、Janthinobacterium、Flavobacterium、Devosia、Duganella、Deinococcus、Cryobacterium、Rugamonas、Arthrobacter、Mycetocola、Massilia、Salinibacterium組成。高通量測序結果表明冰川細菌主要由Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes 3個門組成，由Acidovorax、Bacillus、Bacteroides、Brevundimonas、Herbaspirillum、Massilia、Pedobacter、Phenylobacterium、Polaromonas、Pseudorhodobacter、Variovorax等屬組成。雪樣和水樣組成較相似。2種方法均檢測到了熊彩崗日地區(qū)冰川所特有的細菌類群。

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(責任編輯：朱秀英)

StudyofbacterialdiversityinglaciersofXiongcaigangriregionofsouthKarakoram

ZHANG Shuhong1, 2, BAOGE Rile1, LI Zhiguo3, CHEN Hongge1

(1. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Life Sciences, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China； 3. College of Environment and Planning, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

Using the methods of pure culture and high-throughput sequencing, bacteria diversity was investigated in glacial snow and glacial water from Xiongcaigangri region of south Karakoram. Pure culture results showed that glacial bacteria were composed of Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Deinococcus-Thermus at phylum level. They were composed ofPseudomonas,Janthinobacterium,Flavobacterium,Devosia,Duganella,Deinococcus,Cryobacterium,Rugamonas,Arthrobacter,Mycetocola,Massilia,Salinibacteriumat genus level. High-throughput sequencing results showed that glacial bacteria were mainly composed of Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes at phylum level. They were mainly composed ofAcidovorax,Bacillus,Bacteroides,Brevundimonas,Herbaspirillum,Massilia,Pedobacter,Phenylobacterium,Polaromonas,Pseudorhodobacter,Variovoraxat genus level. The results showed that the combination of culture-dependent method and high-throughput sequencing could obtain more comprehensive investigation of bacterial community. From the two methods, bacterial diversity was similar between glacial snow and glacial water, while with some unique community. In the meantime, some unique bacteria were detected in glacial environments of Xiongcaigangri region.

bacteria; diversity; glacier; Xiongcaigangri region

Q 938

：A

2015-04-06

國家自然科學基金項目(31100369，41101072，41330526)

張淑紅(1977-)，女，甘肅慶城人，副教授，博士，從事環(huán)境微生物研究。

陳紅歌(1967-)，女，河南許昌人，教授，博士。

1000-2340(2016)02-0275-07