王盼喬，周亞峰，許彥賓，胡建斌，楊路明，孫守如

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

基于多序列比對的甜瓜SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

王盼喬，周亞峰，許彥賓，胡建斌，楊路明，孫守如

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

采用多序列比對的方法，從甜瓜EST序列中發(fā)現(xiàn)約1 100個SSR差異位點，并隨機挑選50個位點設(shè)計成SSR引物，對47份遺傳背景不同的甜瓜種質(zhì)進行PCR擴增。結(jié)果表明，41對引物可產(chǎn)生清晰的帶譜，有效擴增率達82.00%，且均具有多態(tài)性。共檢測到130個等位基因，平均3.17個。Na、Ne、Ho、He、PIC等參數(shù)表明，這些標(biāo)記具有一定程度的多態(tài)性。本研究開發(fā)的SSR標(biāo)記可用于甜瓜的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，基于多序列比對的標(biāo)記開發(fā)方法亦可在基因組信息豐富的物種中應(yīng)用。

甜瓜；序列比對；EST-SSR；遺傳多樣性；群體結(jié)構(gòu)

甜瓜(CucumismeloL.)是世界重要的園藝作物，其生產(chǎn)規(guī)模在世界10大水果中居第9位[1]。甜瓜是中國重要的設(shè)施蔬菜種類之一，其生產(chǎn)規(guī)模僅次于西瓜，播種面積和產(chǎn)量歷年穩(wěn)居世界第一[2]。近年來，甜瓜基因組領(lǐng)域的研究進展十分迅速，目前已經(jīng)構(gòu)建了至少20張遺傳圖譜，基因組信息不斷增加[3]。2007年，西班牙、美國、中國等14個實驗室聯(lián)合成立了國際葫蘆科基因組計劃(International Cucurbit Genomics Initiative, ICuGI)，啟動了包括甜瓜在內(nèi)的葫蘆科植物全基因組測序工作。2012年，甜瓜全基因組測序結(jié)果公開發(fā)表[4]，是繼黃瓜、西瓜之后完成全基因組測序的葫蘆科植物。甜瓜基因組學(xué)的快速發(fā)展產(chǎn)生了大量的數(shù)據(jù)信息，目前GenBank中甜瓜的EST序列已經(jīng)超過13萬條，為甜瓜的遺傳研究(如標(biāo)記開發(fā))提供了豐富的數(shù)據(jù)信息。植物EST序列中一般含有SSR位點，其出現(xiàn)頻率一般為1/10～1/5[5]，這些SSR位點可用來開發(fā)SSR標(biāo)記。通過SSR搜尋工具(如SSRHunter軟件)可將含有SSR的EST序列找出，在SSR位點側(cè)翼設(shè)計引物，便可開發(fā)成SSR標(biāo)記。這種方法充分利用了現(xiàn)有的基因組信息，無需構(gòu)建文庫和測序，被認(rèn)為是一種“免費”開發(fā)SSR標(biāo)記的途徑，目前已經(jīng)應(yīng)用于多種植物[6]。然而，許多研究表明，通過這種方法開發(fā)出的SSR標(biāo)記，其多態(tài)性標(biāo)記的比例不高。如白菜中多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的比例為46.7%[7]，蘿卜中多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記的比例為35.0%[8]，黃瓜中多態(tài)性EST-SSR標(biāo)記比例僅為24.3%[9]。本研究采用多序列比對的方法開發(fā)甜瓜SSR標(biāo)記，期望進一步提高多態(tài)性標(biāo)記的比例，并對這些標(biāo)記的可用性進行分析。

1 材料與方法

1.1材料

供試材料選自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院瓜類育種實驗室已構(gòu)建的甜瓜核心種質(zhì)庫[10]，共47份，其中厚皮種質(zhì)(subsp.melo) 28份，薄皮種質(zhì)(subsp.agrestis) 19份。所有材料均已培育成高代自交系，材料名稱及來源見表1。

1.2方法

1.2.1 DNA提取 取各種質(zhì)幼葉約300 mg，采用CTAB法[11]提取基因組DNA，用無菌ddH2O稀釋至250 mg·L-1，備用。

1.2.2 SSR位點發(fā)掘及引物設(shè)計 從國際葫蘆科基因組(ICuGI)網(wǎng)站(http://www.icugi.org)下載含有SSR位點的Unigene(MU43177～MU67602)，摒棄現(xiàn)有報道中已用于開發(fā)SSR標(biāo)記的序列，將剩余的Unigene與GenBank中甜瓜EST序列進行同源性比對，選取適宜的序列進行引物設(shè)計。選擇含有SSR的序列的條件為：1) 序列比對的相似性為85%以上;2) 至少有2條EST序列與該序列存在SSR位點差異。

采用Primer 5在符合條件的目標(biāo)序列(含有SSR差異位點的序列)側(cè)翼設(shè)計引物，引物設(shè)計的標(biāo)準(zhǔn)為：Tm 值為55～60 ℃，引物長度為18～24 bp，PCR產(chǎn)物大小為100～350 bp，GC含量為40%～60%。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 試驗材料和來源Table 1 Experimental materials and their origins

表2 試驗所設(shè)計的50對引物的信息Table 2 Information of 50 primer pairs designed in the present study

續(xù)表Continuing Table

注：‘-’ 不能確定標(biāo)記的位置。

Note: ‘-’indicates that the marker is not located.

1.2.3 PCR擴增及電泳檢測 以47份甜瓜種質(zhì)基因組DNA為模板，采用新合成的50對引物進行PCR擴增。擴增體系為15 μL，其中2 μL 50 mg·L-1模板DNA，1.5 μL 10×PCR buffer (含Mg2+)，0.4 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.2 μL 2 500 U·L-1TaqDNA聚合酶，0.2 μL 10 μmol·L-1引物，8.6 μL ddH2O。PCR擴增在Mastercycler PCR 儀上進行，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，55～60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次；最后72 ℃延伸8 min。采用本實驗室建立的PAGE 凝膠制備方法和銀染的技術(shù)[12]，對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測、記錄。

1.3SSR的多態(tài)性檢測與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)電泳帶譜，在相同遷移位置有帶記作1，無帶記作0，建立基因分型的0/1矩陣。采用PopGene 1.32軟件計算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)。根據(jù)BOTSTEIN等[13]的方法計算多態(tài)性信息量(Polymorphism information content, PIC)，

(1)

式中:Xi為第i種基因型出現(xiàn)的頻率。

采用NTSYSpc 2.10軟件進行數(shù)據(jù)分析，計算Jaccard相似系數(shù)，采用UPGMA法對47份材料的基因型數(shù)據(jù)進行聚類分析，并通過Treeplot程序生成聚類圖。為了估測供試種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)，應(yīng)用STRUCTURE 2.3.1軟件對多態(tài)性位點的分子數(shù)據(jù)進行分析，計算各種質(zhì)的Q值(第i個材料基因組變異源于第K亞群的概率)。先設(shè)定群體數(shù)(K)為1～10，將MCMC(markov chain monte carlo)開始時的不作數(shù)迭代(length of burn-in period)設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，依據(jù)似然值最大的原則選取1個合適的K值，繪制群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1SSR位點識別及擴增效率

在ICuGI網(wǎng)站中發(fā)現(xiàn)有3 263個unigene至少含有1個SSR位點，約 70% 的unigene能在GenBank中找到同源序列。采用Clustalx軟件對unigene及其同源序列進行多序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約1 100個SSR位點在多序列比對中表現(xiàn)出位點差異。其中，unigene MU45323的序列比對結(jié)果見圖1，該序列的重復(fù)基元CTC和TCT與其他EST序列存在差異。本試驗隨機選取了50個符合條件的差異SSR位點，設(shè)計50對EST-SSR引物(表2)，根據(jù)ICuGI網(wǎng)站公布的最新的甜瓜遺傳圖譜信息，將除HNM09和HNM27外的48個標(biāo)記定位在除LG3和LG11之外的所有連鎖群上。采用這些標(biāo)記對47份遺傳背景不同的甜瓜種質(zhì)進行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，41對引物產(chǎn)生清晰可見的帶譜，引物的有效擴增率為82.00%。在這41對引物中，4對引物(HNM01、HNM10、HNM35和HNM50)擴增出非預(yù)期大小的片段，實際片段比期望長度多出50 ～ 200 bp。編號為HNM27的引物同時檢測到2個SSR位點的變異，因而可分為HNM27a (～300 bp)和HNM27b (～ 200 bp) 2個標(biāo)記。剩余36對引物擴增出預(yù)期產(chǎn)物大小的片段，其中引物HNM08的擴增帶譜見圖2。

圖1 MU45323的多序列比對結(jié)果Fig.1 The result of multiple sequence alignment of MU45323

2.2SSR標(biāo)記的多態(tài)性驗證

41對引物共檢測到130個等位基因，每對引物檢測到的等位基因數(shù)為2～9，平均3.167個(表3)。由于每對引物在47份種質(zhì)中均能檢測到等位變異，因而多態(tài)性引物的比例為100%。所有引物的有效等位基因數(shù)為1.403～5.111，HNM7最大，HNM49最小，平均2.410。期望雜合度為0.088～0.250，HNM01最大，HNM15最小，平均0.191。觀測雜合度為0.000～0.095，平均0.023。多態(tài)性信息量為0.246～0.775，HNM07最大，HNM49最小，平均0.470。這些參數(shù)說明，供試種質(zhì)的純合度較高，新開發(fā)的引物均具有一定程度的多態(tài)性。所有引物的擴增產(chǎn)物呈“single-locus”變異，表型出典型的共顯性特征(圖2)，為電泳數(shù)據(jù)記錄提供了便利。

M：分子標(biāo)量marker pUC18 DNA/Msp1；泳道1～ 47為甜瓜種質(zhì)，序號同表1。 M: marker pUC18 DNA/Msp1; Lanes 1～ 47 mean the melon germplasms and their codes are the same to what is in table 1.

標(biāo)記名稱Name等位基因數(shù)/個Allelenumber有效等位基因數(shù)/個Effectiveallelenumber期望雜合度Expectedheterozygosity觀測雜合度Observedheterozygosity多態(tài)性信息量PolymorphisminformationcontentHNM122.0000.2500.0210.375HNM242.9520.1650.0000.593HNM421.5410.1760.0000.290HNM521.9380.2420.0000.367HNM775.1110.1150.0650.775HNM821.6670.2000.0000.320HNM921.9960.2490.0210.375HNM1043.4050.1770.0230.653HNM1132.5960.2050.0430.533HNM1274.4490.1110.0950.742HNM1342.2890.1410.0000.503HNM1432.3180.1900.0000.477HNM1594.7300.0880.0000.761HNM1642.6010.1540.0650.549HNM1721.9130.2390.0210.363HNM1821.9770.2470.0440.372HNM1921.9570.2440.0000.369HNM2021.9570.2440.0000.369HNM2231.9530.1630.0430.388HNM2321.6580.1980.0000.318HNM2432.7360.2120.0430.558HNM2521.9960.2500.0210.375HNM2632.6650.2080.0000.547HNM27a42.4680.1490.0000.543HNM27b32.3490.1910.0210.502HNM2821.5840.1840.0000.301HNM3153.1050.1360.0640.629HNM3221.9410.2420.0000.367HNM3353.3730.1410.0460.646HNM3421.9760.2470.0000.372HNM3521.9860.2480.0210.373HNM3632.0060.1670.0000.412HNM3732.5880.2050.0640.533HNM3832.0620.1720.0210.459HNM3921.9570.2440.0000.369HNM4042.7740.1600.0000.589HNM4132.1460.1780.0480.469HNM4232.2020.1820.0250.484HNM4532.1200.1760.0510.441HNM4632.5580.2030.0430.526HNM4921.4030.1440.0440.246HNM5032.1980.1820.0000.486平均Mean3.1672.4100.1910.0230.470

2.3遺傳多樣性分析

為了進一步評價所開發(fā)的SSR標(biāo)記的可用性，對41對SSR引物在47份甜瓜種質(zhì)中的擴增數(shù)據(jù)進行聚類分析。所有種質(zhì)的Jaccard相似系數(shù)為0.41～0.94，相似系數(shù)變化范圍較廣，說明參試種質(zhì)遺傳背景差異較大。內(nèi)蒙古的‘金巴齒’和河南的‘牛角蜜’的相似系數(shù)最大，兩者在果實性狀上存在明顯的相似性；河北的薄皮種質(zhì)‘小翠瓜’和土耳其厚皮種質(zhì)‘PI-169358’相似系數(shù)最小，兩者在果實性狀和地理分布上差異明顯(表1)。

47份種質(zhì)在相似系數(shù)為0.52的水平上可明顯分為2類(I和II) (圖3)。第I類包括26份厚皮種質(zhì)，第II類包括剩余的19份薄皮種質(zhì)和2份厚皮種質(zhì)。在第I類中，不同地理來源地厚皮種質(zhì)聚在一起，說明它們的遺傳關(guān)系緊密，可能具有相同的起源中心；但是河南的‘Horneseoneen’與其他種質(zhì)遺傳關(guān)系較遠。 所有的薄皮種質(zhì)(中國17份，韓國和日本各1份)均聚在第II類，平均相似系數(shù)高達0.78，其遺傳關(guān)系十分緊密。然而2份厚皮種質(zhì)(中國臺灣的‘PI-321004-S2’和伊朗的‘PI-137852’)也被劃分在第II類，可能由于它們含有薄皮甜瓜的血緣，或因所用標(biāo)記數(shù)量的限制而不能將它們分開；但在0.77的相似系數(shù)水平上，它們可與薄皮種質(zhì)完全區(qū)別開。該研究結(jié)果表明，通過序列比對開發(fā)的SSR標(biāo)記能較準(zhǔn)確地將甜瓜厚皮和薄皮種質(zhì)區(qū)分開，可用于甜瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。

圖3 基于SSR數(shù)據(jù)構(gòu)建的47份甜瓜種質(zhì)的聚類圖Fig.3 Dendrogram of 47 melon germplasms based on the SSR data

2.4群體結(jié)構(gòu)分析

為了進一步分析參試種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，試驗采用STRUCTURE軟件對47份種質(zhì)的基因型數(shù)據(jù)進行基于Bayesian算法的群體結(jié)構(gòu)劃分，以推定的K所對應(yīng)的最大似然值LnP(D)來選擇合適的群體數(shù)目。由于LnP(D)隨K的增大持續(xù)增加，難以確定真實的K值，因此參照EVANNO等[14]的方法通過ΔK來確定K值。當(dāng)K=2時，ΔK出現(xiàn)明顯的峰值(圖4)，即參試種質(zhì)明顯存在2個亞群(圖5)。19份薄皮種質(zhì)和一份厚皮種質(zhì)(‘PI-321004-S2’)被劃分為亞群Pop1，27份厚皮種質(zhì)被劃分為亞群Pop2，基于Bayesian算法基本能將參試種質(zhì)按厚皮和薄皮亞種區(qū)分開。供試種質(zhì)中，39份(95.12%)的種質(zhì)的Q值大于0.90，表明其血緣組成相對單一，2份厚皮種質(zhì)(‘PI-321004-S2’和‘PI-137852’)的Q值為0.30～0.70，具有混合血緣。本研究結(jié)果與UPGMA聚類方法一致。

K,群體數(shù)目。K,The number of population.

圖5 47份甜瓜種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.5 Population structure of 47 melon germplasms

3 結(jié)論與討論

隨著新一代的測序技術(shù)快速發(fā)展，海量的序列信息(主要是EST序列)被釋放到公共數(shù)據(jù)庫中，成為開發(fā)SSR、InDel、SNP等標(biāo)記的寶貴資源。由于SSR標(biāo)記具有共顯性、穩(wěn)定性、多等位變異等特點，是基于EST序列開發(fā)的主要對象。目前，基于EST序列的SSR標(biāo)記開發(fā)在植物[6]、動物[15]、微生物[16]中均有報道，所開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記已廣泛用于遺傳多樣性分析[17]、遺傳圖譜構(gòu)建[18]、比較作圖[19]、基因定位[20]等領(lǐng)域。然而，眾多的研究表明，從EST序列中開發(fā)的SSR標(biāo)記主要存在兩個問題：一是標(biāo)記的有效擴增率不高；二是標(biāo)記的多態(tài)性較低[21]。

從基因組文庫開發(fā)SSR標(biāo)記是傳統(tǒng)方法，由于該方法是在基因組DNA上搜尋SSR位點，因而所開發(fā)的標(biāo)記對基因組的擴增是有效的，有效擴增率可達100%[22]。而EST-SSR標(biāo)記是來自于基因組的編碼區(qū)，如果EST-SSR引物恰好落在2個外顯子上，或者上下游引物之間存在一個較長的內(nèi)含子(超過了DNA聚合酶的擴增長度)，標(biāo)記則不會有擴增產(chǎn)物。因此，EST-SSR標(biāo)記的有效擴增率一般不會達到100%。本試驗中，甜瓜SSR標(biāo)記的有效擴增率為82.00%，略低于黃瓜的89.19%[9]和蘿卜的86.88%[8]，高于辣椒的60.44%[23]。隨著一些植物的全基因組序列的公開釋放，標(biāo)記開發(fā)者可先將目的EST序列與該物種的全基因組序列進行比對，排除內(nèi)含子存在引物結(jié)合處或引物之間的情況，可提高標(biāo)記的擴增效率。

從差異位點的檢測效率來講，EST-SSR的多態(tài)性一般低于基因組SSR。HU等[24]比較分析了黃瓜基因組SSR和EST-SSR的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)基因組SSR檢測到的等位基因數(shù)和PIC值均明顯高于EST-SSR。本試驗開發(fā)的41個SSR標(biāo)記平均檢測到的等位基因3.17個，PIC值0.470，而蘿卜的EST-SSR標(biāo)記僅能檢測2.5個等位基因[7]。與基因組的非編碼區(qū)相比，編碼區(qū)在植物進化過程中承受的選擇壓力較大，其序列變異相對較小，因而EST-SSR標(biāo)記檢測到的等位變異的幾率不會很高[21]。TEMNYKH等[25]認(rèn)為SSR的多態(tài)性與重復(fù)基元的長度有關(guān)，選擇長度大于20 bp的SSR可提高標(biāo)記的多態(tài)性。但在百合[26]、甜瓜[27]、刺梨[28]等植物中，一些長度超過20 bp的EST-SSR位點也不具有多態(tài)性，本研究中一些低重復(fù)的SSR (長度小于20 bp)卻在不同種質(zhì)間表現(xiàn)等位變異。本研究是針對具有SSR差異的序列(簇)開發(fā)標(biāo)記，從源頭上保證了標(biāo)記的多態(tài)性潛能，在以遺傳背景差異明顯的材料作為試材的前提下，表現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記比例可達到100%。而針對單個EST序列開發(fā)的SSR標(biāo)記，如在上述蘿卜、黃瓜、辣椒等植物中，并非全部具有多態(tài)性。因此，在基因組信息豐富的物種中，通過序列比對法開發(fā)SSR標(biāo)記，其優(yōu)勢十分明顯。目前，基因組測序的成本越來越低，一些植物還完成了不同遺傳背景材料的重測序。在這種情況下，電子PCR (Electronic PCR, e-PCR)技術(shù)的優(yōu)勢十分突出。它通過借助相應(yīng)的序列分析軟件，將設(shè)計的PCR引物與所查詢樣品的序列進行比對，以評價引物的擴增效率和多態(tài)性，可用于PCR 引物輔助篩選[29]。

此外，本研究還將新開發(fā)的SSR標(biāo)記用于47份甜瓜種質(zhì)的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于新開發(fā)標(biāo)記的聚類結(jié)果和群體劃分與甜瓜分類基本一致。由于薄皮甜瓜主要分布在東亞地區(qū)(中國中、東部，朝鮮半島和日本)，厚皮種質(zhì)主要分布在中亞、西亞、歐洲和美洲[30]，因此聚類分析和群體劃分的結(jié)果也與甜瓜的地理分布基本相符，說明所開發(fā)的標(biāo)記可用于甜瓜遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)研究。

本研究采用多序列比對的方法從甜瓜EST序列中發(fā)現(xiàn)約1 100個SSR差異位點，并開發(fā)了50對SSR引物，48個標(biāo)記分布在除LG3和LG11之外的其他連鎖群。對47份遺傳背景不同的甜瓜種質(zhì)進行分子標(biāo)記分析，41對引物產(chǎn)生清晰的帶譜，且均具有多態(tài)性，共檢測到130個等位基因。Na、Ne、Ho、He、PIC等遺傳參數(shù)顯示，這些標(biāo)記具有一定程度的多態(tài)性。UPGMA聚類方法和Bayesian群體劃分方法均能按照甜瓜植物學(xué)分類和地理分布將所有種質(zhì)分為2類或亞群。本研究開發(fā)的甜瓜SSR標(biāo)記不僅進一步豐富了甜瓜DNA標(biāo)記資源，而且對于基因組豐富物種的標(biāo)記開發(fā)，也具有十分重要的啟示意義。

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(責(zé)任編輯：李瑩)

DevelopmentofSSRmarkersbasedonmultiplesequencealignmentandtheirapplicationsinmelon

WANG Panqiao, ZHOU Yafeng, XU Yanbin, HU Jianbin, YANG Luming, SUN Shouru

(College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Multiple sequence alignment was used to develop SSR markers in melon, which identified about 1 100 different SSR loci from the melon ESTs. Of these loci, 50 were randomly selected for primer design and the next PCR amplification. The genomic DNA of 47 melon germplasms with different genetic backgrounds was analyzed with these primers. The results showed that 41 primer pairs generated clear band patterns, with the amplification efficiency of 82.00%, and all the products were polymorphic. A total of 130 alleles were detected with a mean of 3.17. The genetic parameters, Na, Ne, Ho, He, and PIC, verified a certain level of polymorphism of these newly-developed markers. Therefore, the SSR markers developed herein can be used to analyze genetic diversity and population structure in melon. Also, the method of SSR development based on multiple sequence alignment can be well applied in the species with abundant genomic information.

melon; sequence alignment; EST-SSR; genetic diversity; population structure

S652

：A

2015-09-07

國家自然科學(xué)基金項目(31101544)；河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A210011)

王盼喬(1990-) ，男，河南郟縣人，碩士研究生，從事甜瓜育種研究。

胡建斌(1976-) ，男，湖北武漢人，副教授，博士。

1000-2340(2016)02-0189-09