羅 丹，全學(xué)軍*，吳 俊，戴 亞，馬擴(kuò)彥

（1.重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶 400062）

烤煙中直鏈-支鏈淀粉含量測(cè)定方法優(yōu)化

羅 丹1，全學(xué)軍1*，吳 俊1，戴 亞2，馬擴(kuò)彥2

（1.重慶理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400054；2.重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，重慶 400062）

為了建立烤煙中直鏈-支鏈淀粉的快速高效測(cè)定方法，以云煙85為原料，考察了高氯酸濃度、超聲時(shí)間、超聲功率和液固比4個(gè)因素對(duì)高氯酸超聲提取-碘顯色-雙波長(zhǎng)法測(cè)定烤煙中淀粉含量的影響。采用響應(yīng)面Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理及響應(yīng)面分析方法優(yōu)化了淀粉提取測(cè)定工藝。結(jié)果表明，烤煙中淀粉提取測(cè)定最佳工藝為：高氯酸質(zhì)量濃度為 49.00%，超聲功率為400 W，超聲時(shí)間為8.50 min，液固比為27 mL/g。在此條件下，加標(biāo)回收率直鏈淀粉為104.45%～107.48%，支鏈淀粉為96.42%～100.51%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=3）＜3.5%。說(shuō)明Box-Behnken 設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得的淀粉測(cè)定方法具有較好的精密度及準(zhǔn)確度，適合于烤煙淀粉含量測(cè)定。

煙草；淀粉；超聲提??；響應(yīng)面法

淀粉是煙草中重要的碳水化合物，廣泛存在于煙草的莖葉中。新鮮煙葉經(jīng)過(guò)調(diào)制，大部分淀粉降解為還原糖，但處理后的煙葉仍殘留一定量的淀粉。一些相關(guān)研究證明，煙葉中含有較高的淀粉將會(huì)影響燃吸速度且產(chǎn)生有害成分，對(duì)煙草的色、香、味產(chǎn)生不良影響［1-2］。目前，我國(guó)烤煙中淀粉含量約為4%～6%，而國(guó)外優(yōu)質(zhì)烤煙淀粉含量?jī)H為1%～2%［3］。因此，進(jìn)一步研究快速準(zhǔn)確測(cè)定煙草淀粉的方法，對(duì)我國(guó)煙草業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

超聲提取在煙草精油、多糖、維生素E以及淀粉等方面得到了應(yīng)用［4-7］。煙草中淀粉含量測(cè)定方法有：碘顯色法、差示掃描量熱儀法（DSC），高效空間排阻色譜法（HPSEC）和近紅外光譜法（NIR）等［8-12］。其中碘顯色法因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單、分析快捷而被廣泛應(yīng)用。因此，本研究將高氯酸超聲提取淀粉工藝與雙波長(zhǎng)法測(cè)定淀粉工藝相結(jié)合，建立高效、快速的淀粉檢測(cè)方法，為進(jìn)一步了解直鏈淀粉與支鏈淀粉理化特性對(duì)煙草品質(zhì)的影響，以及烤煙中淀粉的降解與烤煙品質(zhì)的關(guān)系提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

云煙85烤煙C3F（2012年，四川涼山州西昌市）；直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)樣品（美國(guó)Sigma公司）；無(wú)水乙醇、氯化鈉、高氯酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀（AR，成都市科龍化工試劑廠）。

電子分析天平（感量：0.0001 g，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-400KDE超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；砂芯過(guò)濾裝置（深圳市瑞鑫達(dá)化玻儀器有限公司）；pH-3S精密酸度計(jì)（南京桑力電子廠）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2方法

實(shí)驗(yàn)流程：煙草粉粹→過(guò)篩（40-100目）→除雜（飽和NaCl-乙醇溶液）→過(guò)濾（取濾渣）→提?。ǜ呗人崛芤海^(guò)濾（取濾液）→顯色反應(yīng)（I2/KI溶液）→測(cè)吸光度。最后根據(jù)對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)所測(cè)定吸光度，計(jì)算支鏈淀粉和直鏈淀粉的含量。

1.2.1煙草中淀粉含量的計(jì)算公式

式中：C為測(cè)量液淀粉濃度/（g·mL-1）；V為測(cè)量液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；W為原料重量。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 按照王文超等［13］文獻(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，以從Sigma公司購(gòu)買的直鏈淀粉和支鏈淀粉為標(biāo)準(zhǔn)品，采用碘顯色-雙波長(zhǎng)法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)直鏈淀粉和支鏈淀粉的吸收光譜，實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定波長(zhǎng)為510、550、590、702 nm。以雙波長(zhǎng)吸光度差值為縱坐標(biāo)Y，淀粉溶液質(zhì)量濃度X/（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，得直鏈淀粉回歸方程為：Y1=0.00822X1+0.01029，R2=0.9969，在5～30 mg/L范圍內(nèi)線性良好；支鏈淀粉回歸方程為：Y2=0.00293X2+0.00412，R2=0.9975，在40～90 mg/L范圍內(nèi)線性良好。

1.2.3單因素試驗(yàn) 超聲時(shí)間對(duì)淀粉含量測(cè)定的影響：稱取煙末0.6000 g，高氯酸溶液質(zhì)量比為45%，超聲功率280 W，超聲時(shí)間：1、2、4、6、8、10 min。

超聲功率對(duì)淀粉含量測(cè)定的影響：稱取煙末0.6000 g，高氯酸溶液質(zhì)量比為45%，超聲時(shí)間8 min，超聲功率：160、240、320、360、400 W。

不同液固比對(duì)淀粉含量測(cè)定的影響：高氯酸溶液質(zhì)量比為45%，超聲時(shí)間8 min，超聲功率280 W，分別稱取煙末：0.400、0.500、0.600、0.800、1.000、1.2000 g，對(duì)應(yīng)液固比為：37.5、25、18.75、15.00、12.5 0、10.00 mL/g。

不同高氯酸濃度對(duì)淀粉含量測(cè)定的影響：稱取煙末0.6000 g，超聲時(shí)間8 min，超聲功率280 W，高氯酸質(zhì)量比分別為：30%、35%、40%、45%、50%。

2　結(jié)　果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

超聲時(shí)間、超聲功率、液固比和高氯酸質(zhì)量濃度單因素對(duì)淀粉含量測(cè)定的影響，如圖1所示。淀粉含量的測(cè)定結(jié)果隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加都呈現(xiàn)先增大后不變的趨勢(shì)。在液固比影響因素中，液固比在10～12.5 mL/g范圍內(nèi)時(shí)，直鏈淀粉的含量高于支鏈淀粉的含量，液固比在12.5 mL/g之后，直鏈淀粉含量的測(cè)定結(jié)果增長(zhǎng)趨勢(shì)趨于平緩，而支鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果持續(xù)增長(zhǎng)，液固比大于25 mL/g后支鏈淀粉含量略有下降趨勢(shì)。在不同高氯酸質(zhì)量濃度影響因素中，高氯酸質(zhì)量濃度較低時(shí)，淀粉含量的測(cè)定都較低，其中直鏈淀粉含量高于支鏈淀粉含量，高氯酸質(zhì)量濃度達(dá)40%后淀粉含量測(cè)定基本保持不變。

圖1　超聲時(shí)間、超聲功率、液固比和高氯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)淀粉測(cè)定量的影響Fig.1 Influences of ultrasonic treatment time， ultrasonic power， liquid-solid ratio and perchloric acid mass fraction on starch determination

2.2超聲提取工藝的優(yōu)化

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)以高氯酸濃度、超聲時(shí)間、超聲功率和液固比為影響因子，以直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測(cè)定值為響應(yīng)值，采用4因子2水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳工藝參數(shù)［14-15］。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Levels of factors chosen for the trials

2.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中3、9、16、19和21號(hào)是中心試驗(yàn)，也即是區(qū)域的中心點(diǎn)，試驗(yàn)重復(fù)五次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。其余24個(gè)是析因試驗(yàn)。

應(yīng)用Design Expert進(jìn)行回歸擬合分析，可得到提取條件與直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測(cè)定值之間的二次多項(xiàng)式模型為：

（1）直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果分析

Y1=-9.593+0.247A+0.018B+0.040C+0.333D-2.42×10-5AB+1.33×10-5AC-1.58×10-3AD-8.75×10-6BC-3.83×10-4BD-6.33×10-4CD-2.32×10-3A2-1.79×10-5B2-5.78×10-4C2-6.02×10-3D2。式中A、B、C、D分別為高氯酸質(zhì)量比、超聲功率、液固比和超聲提取時(shí)間編碼值。對(duì)回歸方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)（表3）表明，該回歸模型F=59.52，P＜0.0001，具有高度顯著性。失擬項(xiàng)F=5.03，P=0.0666＞0.05，失擬性不顯著，R2=0.9835，RAdj2=0.9670，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合性較好。因此，上述回歸方程模擬性好，能描述實(shí)驗(yàn)中各因素與影響值之間的關(guān)系。從表3可以得出，各因素對(duì)直鏈淀粉的提取影響都極顯著，其中各因子對(duì)煙草中直鏈淀粉含量測(cè)定的影響依次為高氯酸質(zhì)量比（A）＞超聲提取時(shí)間（D）＞液固比（C）＞超聲功率（B）。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSM

表3　直鏈淀粉回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 3 Significance for regression equation coefficients of amylose

（2）支鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果分析

Y2=-24.849+0.745A+0.045B-0.171C-0.032D-1.11×10-4AB+5.23×10-3AC-2.11×10-4AD+3.31×10-4BC+7.77×10-4BD+9.16×10-5CD-7.68×10-3A2-6.89×10-5B2-2.63×10-3C2-0.012D2。對(duì)回歸方程方差分析和顯著性檢驗(yàn)（表4）表明，該回歸模型F=45.38，P＜0.0001，具有高度顯著性。失擬項(xiàng) F=3.08，P=0.1449＞0.05，失擬性不顯著，R2=0.9784，RAdj2=0.9569，表明支鏈淀粉含量測(cè)定的模擬方程也對(duì)實(shí)驗(yàn)有較好的擬合。從表4可知，高氯酸質(zhì)量比、超聲提取時(shí)間和液固比3個(gè)因子對(duì)支鏈淀粉含量測(cè)定的影響極顯著，超聲功率條件對(duì)支鏈淀粉含量測(cè)定的影響顯著。其中各因子對(duì)煙草中支鏈淀粉含量測(cè)定的影響依次為高氯酸質(zhì)量比（A）＞液固比（C）＞超聲提取時(shí)間（D）＞超聲功率（B）。

2.2.3模型結(jié)果驗(yàn)證 運(yùn)用Design Expert 8.0進(jìn)一步分析看出，云煙 85超聲提取淀粉提取最佳工藝條件為：高氯酸質(zhì)量濃度為 49.35%，超聲功率為392.86 W，液固比為27.30 mL/g，超聲時(shí)間為8.54 min，直鏈淀粉理論測(cè)定含量為1.68%，支鏈淀粉的理論測(cè)定含量為3.47%。為驗(yàn)證模型的可靠性，按照軟件得出的最優(yōu)條件，選高氯酸質(zhì)量濃度為49.00%，超聲功率為400 W，液固比為27.00 mL/g，超聲時(shí)間為8.50 min進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)測(cè)得云煙853次平均值為直鏈淀粉含量為1.55%，支鏈淀粉含量為3.57%，與理論值相比直鏈淀粉相對(duì)誤差為0.12%，支鏈淀粉相對(duì)誤差為0.10%。這表明該模型可靠性較高。

表4　支鏈淀粉回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Significance for regression equation coefficients of amylopectin

2.3方法回收率

對(duì)直鏈和支鏈淀粉測(cè)定方法回收率進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如表5所示，直鏈淀粉回收率為104.45%～107.48%，支鏈淀粉為 96.42%～100.51%。這表明高氯酸超聲提取-雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)法在煙草淀粉提取及直鏈和支鏈淀粉測(cè)定有較高準(zhǔn)確度。

表5　方法回收率實(shí)驗(yàn)Table 5 The recovery experiment

2.4樣品測(cè)定

采用本試驗(yàn)方法優(yōu)化所得條件對(duì)云煙85、中煙100和云煙87等5種不同烤煙樣品淀粉含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表6所示，不同品種煙草中其直鏈和支鏈淀粉含量不同，支鏈淀粉/直鏈淀粉的比值變化范圍為1.4/1～3.1/1。且試驗(yàn)中直鏈和支鏈淀粉相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都小于5%，表明該試驗(yàn)方法具有較好的重復(fù)性和精密度。

表6　不同烤煙中淀粉含量的測(cè)定Table 6 Determination of starch in different types of tobacco

3　討　論

采用高氯酸超聲輔助提取煙葉中存在淀粉，有效提高了淀粉的提取效率［16］。超聲提取過(guò)程中淀粉含量測(cè)定結(jié)果隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加而增加，主要因?yàn)槌暡ǔ掷m(xù)進(jìn)行機(jī)械振動(dòng)，有利于煙末中的淀粉游離出來(lái)，且超聲波的空化效應(yīng)強(qiáng)化了淀粉的提取分離，隨著超聲功率的增加，超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)越強(qiáng)烈，對(duì)細(xì)胞的破壁效果越明顯，從而增加了淀粉的溶出率［17-18］。進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化得出各因子對(duì)煙草中直鏈淀粉含量測(cè)定的影響依次為：高氯酸質(zhì)量比＞超聲提取時(shí)間＞液固比＞超聲功率；對(duì)支鏈淀粉含量測(cè)定的影響依次為：高氯酸質(zhì)量比＞液固比＞超聲提取時(shí)間＞超聲功率。其中高氯酸濃度對(duì)兩者含量測(cè)定影響最大，液固比和超聲功率兩個(gè)因素對(duì)支鏈淀粉和直鏈淀粉含量測(cè)定的影響不同，這主要因?yàn)闊煵葜兄辨満椭ф湹矸鄣暮亢徒Y(jié)構(gòu)存在較大差異。此外，本試驗(yàn)采用碘顯色雙波長(zhǎng)法分別測(cè)定直鏈和支鏈淀粉含量，通過(guò)對(duì)其回收率和重復(fù)性的驗(yàn)證，表明了該方法具有較高的準(zhǔn)確性和可行性，為煙草行業(yè)中淀粉含量的測(cè)定提供了實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4　結(jié)　論

煙草中淀粉提取的最佳工藝為高氯酸質(zhì)量濃度為49.00%，超聲功率為400 W，液固比為27.00 mL/g，超聲時(shí)間為8.50 min，在此條件下測(cè)得云煙85中直鏈淀粉含量為 1.55%，支鏈淀粉含量為3.57%。且該方法直鏈淀粉加標(biāo)回收率 104.45%～107.48%，支鏈淀粉加標(biāo)回收率 96.42%～100.51%，多次實(shí)驗(yàn)RSD為1.023%～3.176%。表明了本研究采用超聲提取-雙波長(zhǎng)法測(cè)定烤煙中淀粉含量有較高的準(zhǔn)確性，為煙草中直鏈淀粉和支鏈淀粉的快速測(cè)定提供了技術(shù)支撐。

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Optimization of the Determination Method of Amylose and Amylopectin in Tobacco

LUO Dan1， QUAN Xuejun1*， WU Jun1， DAI Ya2， MA Kuoyan2
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China； 2. China Tobacco Chongqing Industrial Co.， Ltd.， Chongqing 400062， China）

In order to establish a highly effective determination method of starch in flue-cured tobacco， the determination method of tobacco starch using ultrasonic extraction and iodine colorimetry-dual wavelength spectrophotometry was optimized using Yunyan 85 as the raw material. The effects of ultrasonic time， ultrasonic power， perchloric acid concentration and liquid-solid ratio on the ultrasound-assisted extraction of amylose and amylopectin in tobacco were investigated. The extraction process was optimized using the response surface Box-Benhnken experimental design principles and the response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were that with the perchloric acid mass concentration of 49.0%， the ultrasonic power of 400 W， the ultrasonic time of 8.50 min， and the liquid-solid ratio of 27 mL/g. At the optimized conditions， the recovery of amylose was from 104.45% to 107.48%， recovery of amylopectin was from 96.42% to 100.51%， and the RSD （n=3） was less than 3.5%. This suggested that the optimized determination method of starch used by the Box-behnken design and response surface analysis have good precision and accuracy and are suitable for the detection of starch in flue-cured tobacco.

tobacco； starch； ultrasonic extraction； response surface

TS41+1

1007-5119（2016）04-0074-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.013

重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“煙草中淀粉的存在形態(tài)及其分析方法研究”（hx201314）

羅 丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向：材料化學(xué)工程。E-mail：cqrodin@163.com。*通信作者，E-mail：engjunq@cqut.edu.cn

2015-12-30

2016-06-02