田 蕾，郭妍君，任 麗，王 鈺，孫 菲，齊海坤，馬 楠，戚曉利

(佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

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利用TAIL-PCR技術(shù)分析擬南芥At1g52910突變體插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列

田 蕾，郭妍君，任 麗，王 鈺，孫 菲，齊海坤，馬 楠，戚曉利*

(佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

在篩選與維管發(fā)育相關(guān)的擬南芥突變體過程中，發(fā)現(xiàn)擬南芥基因At1g52910突變體的花器官明顯異常。TAIL-PCR分析結(jié)果表明突變體為Ds單位點(diǎn)插入突變，突變體后代表型出現(xiàn)分離現(xiàn)象，暗示有其它突變位點(diǎn)存在。

擬南芥；At1g52910；TAIL-PCR

目前利用植物基因突變的方法研究植物基因的功能是認(rèn)識生命活動機(jī)理的一種有效途徑。植物基因突變后功能發(fā)生改變或失去功能，有可能使某些代謝途徑部分或完全發(fā)生變化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的可見表型變化，據(jù)此推測出突變基因的功能?；虬l(fā)生突變可以通過Ds或T-DNA插入到植物基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生，插入的DNA序列是已知的，但與之相接的植物基因組DNA的側(cè)翼序列并不清楚。1995年由Liu等首創(chuàng)并發(fā)展了交錯式熱不對稱PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR，TAIL-PCR)技術(shù)，它是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)[1]。該技術(shù)一經(jīng)問世，使分子生物學(xué)研究工作者能夠簡易而有效地從已知序列中分離到其鄰近的未知側(cè)翼序列，解決了有關(guān)基因操作的一系列難題。

本課題組在研究與維管發(fā)育相關(guān)的基因時篩選到一花發(fā)育明顯變異的擬南芥突變體(圖1)，屬于At1g52910基因的Ds 轉(zhuǎn)座突變，突變純合體后代出現(xiàn)表型分離。為了探明這些表型變異是否由Ds插入所造成，通過TAIL-PCR從突變體中擴(kuò)增出Ds插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，為進(jìn)一步探明突變體變異位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，也為其它轉(zhuǎn)基因植物Ds插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列分析提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

擬南芥突變體ET139購自擬南芥突變體資源中心(The Nottingham Arabidopsis Stock Centre，NASC)；野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaLandberg)種子由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實驗室保存。

a. 野生型擬南芥的花；b. 突變體ET139異常的花

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取

采用CTAB法提取葉片基因組DNA，作為擴(kuò)增未知側(cè)翼序列的模板。

1.2.2引物設(shè)計

TAIL-PCR使用一套嵌套的序列特異的引物(special primer，SP)和較短的隨機(jī)簡并引物(Arbitrary degenerate prime，AD)組合，進(jìn)行“半特異性PCR反應(yīng)”。特異性引物是根據(jù)插入的DNA序列設(shè)計的，從Ds開始擴(kuò)增；而隨機(jī)引物是從植物基因組DNA的任意點(diǎn)開始的。實驗分別在Ds的3′ 端和5′ 端各設(shè)計了4個嵌套的長的特異引物，其序列如表1所示，隨機(jī)簡并引物AD序列見表2。

表1　TAIL-PCR反應(yīng)的特異性引物序列

表2　TAIL-PCR反應(yīng)的特異性引物序列

1.2.3TAIL-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

第1輪PCR反應(yīng)體系為20.2 μL ，包含12.8 μL ddH2O，2 μL 10×Buffer，2 μL dNTPs，0.2 μL Ds primer(20μM)，3 μL AD primer(20 μM)，0.2 μL Taq，取19 μL加1 μL Template(50 ng植物基因組DNA)。反應(yīng)完成后將產(chǎn)物稀釋50倍，取2 μL作第2輪反應(yīng)的模板。次級反應(yīng)完成后產(chǎn)物稀釋30倍，取2 μL作第3輪反應(yīng)的模板。第2輪、第3輪反應(yīng)的體系除模板及特異引物外，其余成分與第1輪反應(yīng)相同，循環(huán)參數(shù)見表3。

表3　TAIL-PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

1.2.4產(chǎn)物的回收與測序

TAIL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，特異條帶按試劑盒(Axygen AxyPrey DNA Gel Extraction Kit)方法回收，與pGEM-Teasy vector(Promega)連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用T3引物和T7引物篩選成功連接的陽性菌落。對陽性菌落進(jìn)行測序，將序列在NCBI用Blastn與擬南芥基因組進(jìn)行比對。

2　結(jié)果和分析

2.1Ds側(cè)翼序列的擴(kuò)增

TAIL-PCR工作的原理是以基因組DNA作為模板，利用引物特異性和長短的差異，設(shè)計不對稱的溫度循環(huán)，通過分級反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物，消除非目標(biāo)產(chǎn)物。退火溫度特異性引物要高些，任意引物要低些，退火在不同溫度下進(jìn)行，則二個引物或者其中一個，只有特異性引物能夠很好地起作用。散布高、簡并的嚴(yán)格循環(huán)則使靶序列的擴(kuò)增優(yōu)于非特異性產(chǎn)物。TAIL-PCR理想的電泳結(jié)果應(yīng)該是第3輪產(chǎn)物大于300 bp且比第2輪產(chǎn)物略小[1-3]。產(chǎn)物中可能會出現(xiàn)多條帶，但一般僅有一條最亮。

本實驗采用引物組合從Ds3′ 端和5′ 分別進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)在Ds3-1(Ds5-1)/Ds3-2(Ds5-2)/Ds3-4(Ds5-4)和AD組合條件下可以獲得清晰的條帶，且第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物比第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物偏小(圖2)，符合TAIL-PCR要求。隨機(jī)引物選用了13種AD1～AD13，圖3中顯示Ds3′ 端引物與TAIL-PCR隨機(jī)引物AD1～AD8 PCR電泳結(jié)果。將第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收目的條帶并克隆轉(zhuǎn)化測序。

M：D2000 marker；Ⅰ、Ⅱ代表第2、3輪程序

2.2Ds插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的測序

在陽性克隆測序后獲得了大小不同的側(cè)翼序列，其結(jié)果一致，檢測出的側(cè)翼序列為At1g52910基因序列，正常表型的突變體與異常表型的突變體均插入同樣的位點(diǎn)。將側(cè)翼序列在NCBI用Blastn與擬南芥基因組進(jìn)行比對，沒有發(fā)現(xiàn)其它插入位點(diǎn)。Ds插入其第二外顯子中(圖3)。

(At1g52910由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，Ds插入位點(diǎn)在第2外顯子處)

3　討　論

TAIL-PCR技術(shù)能快速準(zhǔn)確分離到目標(biāo)序列，對基因克隆的研究具有非常重要的意義[4]。

TAIL-PCR技術(shù)操作簡單易行，對DNA純度及濃度要求不高，只要引物設(shè)計好，以DNA為模板即可篩選到目標(biāo)基因；產(chǎn)物的特異性高，采用簡并引物和特異性嵌套引物組合及不對稱的溫度循環(huán)，使目標(biāo)片段占優(yōu)勢；反應(yīng)高效靈敏，本實驗選用的8個Ds引物，有6個引物有效地擴(kuò)增到目標(biāo)片段；重復(fù)性好，快速，實驗在1d內(nèi)完成，可以快速地獲得目標(biāo)片段；若克隆的片段小可以直接用于測序，不涉及連接反應(yīng)，免去了繁鎖的連接克隆等手續(xù)[5]。TAIL-PCR反應(yīng)需要較多的引物組合，但由于AD引物存在有限的結(jié)合位點(diǎn)，隨機(jī)引物數(shù)目較小，對于個別的側(cè)翼序列，即使使用不同的簡并引物也難以擴(kuò)增到陽性結(jié)果。本實驗對擬南芥Ds轉(zhuǎn)座突變選用了8個AD引物，11個隨機(jī)引物，采用不同組合進(jìn)行檢測，為類似檢測提供直接可用的方法。

TAIL-PCR對突變體ET139檢測結(jié)果表明，突變體是Ds轉(zhuǎn)座插入基因At1g52910第2外顯子處，沒有其它插入位點(diǎn)。突變純合體后代出現(xiàn)表型分離，表明花器官的變異并非由Ds的插入而產(chǎn)生的，尚需通過圖位克隆檢測變異位點(diǎn)，為進(jìn)一步發(fā)掘基因功能奠定基礎(chǔ)。

[1]LIU Y G，WHITTIER R F. Thermal Asymmetric Interlaced PCR:Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking[J]. Genomics,1995,25:674-681.

[2]LIU Y G, NORIHIRO M, TERUKO O, et al. Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR[J]. The plant Jouranl,1995,8(3):457-463.

[3]LIU Y G, HUANG N. Efficient amplication of insert end sequence from bacterial artificial chromosome clones by thermal asymmetric interlaced PCR[J]. Plant Molecular Biology Report, 1998, 16:175-181.

[4]羅麗娟，施季森. 一種DNA側(cè)翼序列分離技術(shù)—TAIL-PCR[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2003，27(4)：87-90.

[5]宋達(dá)峰，韓凝，邊紅武，等. 用改良TAIL-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因煙草cbf1基因插入?yún)^(qū)的側(cè)翼序列[J]. 作物學(xué)報，2005，31(10)：1377-1379.

Analysis ofAt1g52910 Mutant Flanking Sequence by TAIL-PCR

Tian Lei, Guo Yanjun, Ren Li, Wang Yu, Sun Fei, Q: Hakun, Ma Nan, Qi Xiaoli*

(College of Life Science，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China)

In a screen of vascular development defective mutants inArabidopsis, mutantAt1g52910 was identified as a Ds transposon mutant with a mutation inAt1g52910. The insertional mutation was not co-segregated with the floral aberrance phenotype. TAIL-PCR analysis did not show additional Ds insertional sites, which suggested that there are other mutations existed.

Arabidopsisthaliana;At1g52910；TAIL-PCR；floral aberrance

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.04.006

2015-12-20

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201410222040)；佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項目(Sjz2012-19)；黑龍江省教育廳科學(xué)研究項目(12513091)；佳木斯大學(xué)校級課題(S2010-53)。

田蕾(1993—)，女，生物技術(shù)專業(yè)本科生。

戚曉利(1971—)，女，副教授，博士，研究方向：分子生物學(xué)教學(xué)及科研。E-mail：qixiaoli3@tom.com

S188

A

1006-9690(2016)04-0023-03