宗勁，吳淼星，胡慶豐

醫(yī)院感染腸桿菌屬中整合子的檢測(cè)及耐藥性分析

宗勁，吳淼星，胡慶豐

目的研究無(wú)菌部位標(biāo)本分離的腸桿菌屬細(xì)菌中Ⅰ、Ⅱ類整合子及相關(guān)基因盒的分布，分析整合子與細(xì)菌耐藥性的關(guān)系。方法用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)第Ⅰ、Ⅱ類整合子，對(duì)整合酶基因可變區(qū)進(jìn)行序列分析；用微量稀釋法檢測(cè)試驗(yàn)菌株對(duì)17種抗生素的耐藥性。結(jié)果在103株試驗(yàn)菌中有30株攜帶I類整合子，檢出率為29.1%，耐藥基因主要為aac（6'）-Ib-Cr、aadA2、aadA1；未檢測(cè)出Ⅱ類整合子。除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁，Ⅰ類整合子陽(yáng)性組耐藥率均高于陰性組（均＜0.05）。結(jié)論整合子與腸桿菌屬耐藥性密切相關(guān)，在腸桿菌屬耐藥機(jī)制中起重要作用。

腸桿菌屬；整合子；基因盒

整合子在細(xì)菌基因組進(jìn)化、傳播、介導(dǎo)細(xì)菌耐藥性方面起重要作用［1-2］，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種類型。腸桿菌屬細(xì)菌是臨床常見革蘭陰性桿菌，常引起呼吸道、尿路、傷口甚至全身感染。本研究腸桿菌屬細(xì)菌的Ⅰ、Ⅱ類整合子及可變區(qū)基因盒分布，并探討整合子與腸桿菌屬細(xì)菌耐藥性的關(guān)系。報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1菌株來(lái)源收集2011年10月至2013年12月浙江省人民醫(yī)院非重復(fù)分離住院患者無(wú)菌部位腸桿菌屬細(xì)菌103株，所有菌株經(jīng)梅里埃公司 VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)；質(zhì)控菌株為ATCC27853（銅 綠 假 單 胞 菌）、ATCC25922（大腸埃希菌），I、II類整合子陽(yáng)性對(duì)照菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2儀器與試劑試劑：Premix Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA標(biāo)志物購(gòu)自大連TaKaRa公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物公司。儀器：VITEK2 compact全自動(dòng)微生物分析鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司），S1OOOThermal Cycler擴(kuò)增儀（美國(guó)BIO-RAD公司），電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3菌株DNA的提取將103株試驗(yàn)菌株和Ⅰ、Ⅱ類整合子陽(yáng)性對(duì)照菌株分別劃線接種于血平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；分離培養(yǎng)得單個(gè)菌落。挑取單個(gè)菌落加入50 l無(wú)菌雙蒸水混勻，100℃沸水浴10 min，裂解細(xì)菌釋放DNA，12000r/min離心5 min取上清液作為擴(kuò)增模板。

1.4菌株Ⅰ、Ⅱ類整合子篩查建20 lPCR反應(yīng)體系：去離子水8.2 l、Premix TaqDNA聚合酶10 l、引物intiF和intiR 各0.4 l、模板1 l。擴(kuò)增條件：94℃裂解5 min，隨后95℃解鏈60 s、55℃退火40s、72℃延伸40s（Ⅰ類整合子）/60s（Ⅱ類整合子），共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。各取5 l上述擴(kuò)增產(chǎn)物加到含溴化乙啶0.4 g/ml的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中進(jìn)電泳，于紫外線下觀察，與陽(yáng)性對(duì)照在同一位置出現(xiàn)明顯條帶者判為陽(yáng)性。

1.5Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序分析建40 l反應(yīng)體系：緩沖液4 l、dNTP 3.8 l、引物各3CS和5CS各2 l、LaTaq DNA聚合酶0.2l、上述Ⅰ類整合子模板2 l、去離子水26 l。擴(kuò)增條件：94℃裂解5 min，隨后95℃解鏈60 s、56℃退火40 s、72℃延伸5 min，共35個(gè)循環(huán)。各取5 l上述擴(kuò)增產(chǎn)物加到含溴化乙啶0.4 g/ml的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中進(jìn)電泳，于紫外線下觀察。用引物5CS 和3CS進(jìn)行測(cè)序分析（委托上海生物工程公司雙向測(cè)序），經(jīng)序列比對(duì)以確定整合子可變區(qū)基因盒的種類。

1.6統(tǒng)計(jì)方法用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Ⅰ、Ⅱ類整合子篩查結(jié)果103株腸桿菌屬細(xì)菌中Ⅰ類整子陽(yáng)性有30株，陽(yáng)性率為29.1%，未篩查到Ⅱ類整合子陽(yáng)性菌株。部分菌株Ⅰ類整子電泳見封四彩圖1。

2.2Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果30株Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌株中20株擴(kuò)增出可變區(qū)。檢出800bp（2株），1 300 bp（16株），3 000 bp（1株），4 000 bp（1株）4種不同片段PCR產(chǎn)物。其中16株攜帶基因盒序列aac（6'）-Ib-Cr，7株同時(shí)攜帶aadA2；2株攜帶aadA1；1株為3kb、1株為4 kb測(cè)序結(jié)果比對(duì)不明確，有待進(jìn)一步研究。Ⅰ類整合子部分菌株可變區(qū)電泳見封四彩圖2。

2.3耐藥率分析Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌株耐藥率均高于Ⅰ類整合子陰性菌株（均＜0.05），除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁。見表1。

表1　整合子陽(yáng)性菌株與陰性菌株耐藥情況比較　　株（%）

3　討論

整合子是根據(jù)整合酶一級(jí)結(jié)構(gòu)不同進(jìn)行分類；第Ⅰ類整合子在臨床相關(guān)菌株中分布最廣，其主要由5CS、3CS及兩者間的可變區(qū)3個(gè)部分組成。其中5CS是整合子的基本結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)啟動(dòng)子（Pant）、整合酶基因intI1及重組位點(diǎn)attI［3］?？勺儏^(qū)在細(xì)菌耐藥中發(fā)揮重要作用，因常帶有不同數(shù)量及種類的基因盒。本研究檢出耐藥基因 aac（6'）-Ib-cr、aadA1、aadA2。喹諾酮類修飾酶基因aac （6'）-Ib-cr是由氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac（6'）-Ib的兩處堿基突變的結(jié)果，從而賦予了作用于氨基糖苷類和喹諾酮類兩類抗菌藥物的特性［4］。Aac（6'）-Ib-cr基因多位于整合子或可移動(dòng)的遺傳元件上，也可與其他耐藥基因共存于同一質(zhì)粒，從而導(dǎo)致細(xì)菌多重耐藥［5］。aadA2編碼氨基糖苷-3″-腺苷?；D(zhuǎn)移酶，賦予細(xì)菌對(duì)鏈霉素和壯觀霉素耐藥，是第1類整合子中最常見的基因之一［6］；aadA1是編碼對(duì)鏈霉素、氟哌酸和甲氧芐啶耐藥最常見基因［7］。

本研究中腸桿菌屬Ⅰ類整合子檢出率為29.1%，低于近年報(bào)道的大腸埃希菌53.89%［8］和肺炎克雷伯菌41.70%［9］的檢出率；這與大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌更高的抗生素選擇性壓力有關(guān)。本研究顯示，除阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑啉、頭孢西丁，Ⅰ類整合子陽(yáng)性組耐藥率均高于陰性組（均＜0.05）。其中兩組細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類的耐藥率差異，與試驗(yàn)結(jié)果中Ⅰ類整合子所攜帶的基因盒相符合。本研究中對(duì)所有試驗(yàn)菌株進(jìn)行 -內(nèi)酰胺酶類耐藥基因篩查發(fā)現(xiàn)：Ⅰ類整合子陽(yáng)性組同時(shí)SHV基因陽(yáng)性有13株，這與三代頭孢、碳青霉烯類、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南的耐藥率明顯高于陰性組相符合。這可能因?yàn)檎献釉谶@些耐藥基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了作用，但 -內(nèi)酰胺酶類耐藥基因并不常存在基因盒中。整合子是細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境進(jìn)化的結(jié)果，抗菌藥物廣泛、大量應(yīng)用是細(xì)菌整合子進(jìn)化和捕獲更多耐藥基因的重要原因；因此合理使用抗生素，降低抗生素所造成的選擇性壓力，從而減少耐藥菌株的產(chǎn)生與播散。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.04.067

R446.12

A

1671-0800（2016）04-0540-03

2015-11-10

（本文編輯：孫海兒）

321017浙江省金華，金華市中醫(yī)醫(yī)院（宗勁、吳淼星）；浙江省人民醫(yī)院（胡慶豐）

宗勁，Email：345437383@qq.com