常亮，陳珍珍，吳毅，丁銀平

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029)

HPLC-ELSD法測(cè)定黃精炮制過(guò)程中四種糖的含量△

常亮，陳珍珍，吳毅*，丁銀平

(江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029)

目的：比較三種黃精炮制過(guò)程中四種糖的含量變化。方法：采用HPLC-ELSD法對(duì)三種黃精不同炮制過(guò)程中果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖含量進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為奧泰PrevailTMCarbohydrate ES柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為35 ℃；漂移管溫度為105 ℃；載氣流速為2.5 L·min-1。結(jié)果：果糖和葡萄糖含量隨炮制時(shí)間增加而增加，蔗糖含量基本不變，水蘇糖含量隨炮制時(shí)間增加而減少。結(jié)論：不同炮制方法炮制過(guò)程中糖類(lèi)成分的變化有差異，為進(jìn)一步揭示黃精的炮制機(jī)理提供參考。

黃精；炮制過(guò)程；糖；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法

黃精(Polygonati Rhizoma)為百合科黃精屬植物的根莖，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功能，是中醫(yī)臨床上常用的補(bǔ)虛藥?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010版一部收載了黃精的三個(gè)來(lái)源，分別為滇黃精PolygonatumkingianumColl et Hemsl.、黃精P.sibiricumRed.或多花黃精P.cyrtonemaHua的干燥根莖，按形狀不同分別習(xí)稱(chēng)為大黃精、雞頭黃精、姜形黃精[1]。黃精所含化學(xué)成分豐富，主要有黃精多糖[2]、甾體皂苷[3]和木脂素類(lèi)[4]等成分。亦有文獻(xiàn)[5]研究了黃精中小分子糖的分離純化的相關(guān)技術(shù)。傳統(tǒng)認(rèn)為，黃精如果不炮制或炮制不合理，很可能就會(huì)引起某些副作用，臨床上不應(yīng)使用生黃精，而應(yīng)用制黃精或酒黃精。通過(guò)炮制，一方面可制其副作用，消除麻味，減輕對(duì)咽喉的刺激；另一方面可提高黃精的臨床療效，增強(qiáng)藥物補(bǔ)脾潤(rùn)肺、益腎的作用。黃精的炮制方法主要有《中華人民共和國(guó)藥典》收載的酒蒸法或酒燉法，而江西建昌藥幫則采用傳統(tǒng)的炆法進(jìn)行黃精的炮制。有文獻(xiàn)[6]認(rèn)為，黃精在炮制過(guò)程中粘液質(zhì)被大量除去，水解生產(chǎn)了葡萄糖和果糖。為了研究黃精炮制過(guò)程中糖類(lèi)成分的變化情況，本文采用HPLC-ELSD法測(cè)定酒蒸法和炆法兩種炮制過(guò)程中果糖、葡萄糖、蔗糖和水蘇糖4種糖的含量，以進(jìn)一步證實(shí)黃精炮制的機(jī)理。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(G1311A四元泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱)；Alltech ELSD 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Allchrom Plus Client/sever 工作站)；Sartorius BT25S型十萬(wàn)分之一電子天平；KQ-500E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，功率250 W，頻率25 kHz)。

1.2 試藥

3個(gè)品種的黃精藥材均購(gòu)自江西省樟樹(shù)市藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院付小梅副教授鑒定，分別為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl et Hemsl.、黃精P.sibiricumRed.或多花黃精P.cyrtonemaHua的干燥根莖。

果糖對(duì)照品、葡萄糖對(duì)照品、蔗糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為100231-200904，110833-201205，111507-201303)；水蘇糖對(duì)照品(天津一方科技有限公司，批號(hào)：BBT0176，含量>98%)；乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)SPS公司)；娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為奧泰PrevailTMCarbohydrate ES柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為水，梯度洗脫程序：0～10 min：75%A，10～35 min：75%～60%A，35～35.01 min：60%～0%A，35.01～45 min：0%A，45～45.01 min：0%～75%A，45.01～55 min：75%A；流速：0.9 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。ELSD條件：漂移管溫度為105 ℃；載氣流速為2.5 L·min-1。

2.2 不同黃精炮制品的制備

炆法黃精：取凈黃精藥材，用清水漂1 d，取出，瀝干，放入炆藥罐內(nèi)炆24 h(此處考察炆法時(shí)間)，至藥熟透汁盡，取出，50 ℃干燥，加20%黃酒噴灑均勻，悶潤(rùn)，待酒吸盡，蒸制4 h，燜一夜，取出，放入烘箱內(nèi)50 ℃干燥，低溫粉碎，過(guò)40目篩，備用[7]。

蒸法黃精：取黃精藥材，凈選后，加20%黃酒噴灑均勻，悶潤(rùn)，待酒吸盡，蒸制24 h(此處考察蒸法時(shí)間)，取出，稍晾，拌回蒸液，再晾至六成干，放入烘箱內(nèi)50 ℃干燥，低溫粉碎，過(guò)40目篩，備用[7]。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖對(duì)照品，加水制成每毫升含果糖2.0 mg，葡萄糖、蔗糖、水蘇糖各0.4 mg的混合溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 分別取上述兩種不同炮制方法炮制一定時(shí)間后的黃精粉末約1 g，精密稱(chēng)定，加水50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)40 min，取出，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液(雞頭黃精，蒸法2 h)各5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。供試品色譜圖中呈現(xiàn)與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致的色譜峰，分離度良好，色譜條件可行。

注：A.對(duì)照品；B.供試品(雞頭黃精，蒸法2 h)；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.水蘇糖。圖1 黃精高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按進(jìn)樣體積2、3、5、7、10 μL，依次進(jìn)樣，測(cè)得色譜峰面積，以進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)(Lg值)為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)(Lg值)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得曲線方程，果糖：Y=1.498 1X+5.688 4，r=0.994 2；葡萄糖：Y=1.538 5X+5.948 4，r=0.998 6；蔗糖：Y=1.758 9X+6.159 1，r=0.996 1；水蘇糖：Y=1.720 6X+6.144 3，r=0.995 7，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.3.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液各5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得峰面積對(duì)數(shù)值的RSD分別為果糖1.5%、葡萄糖1.2%、蔗糖2.3%、水蘇糖2.1%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品(雞頭黃精，蒸法2 h)溶液5 μL，分別在0、3、6、9、12、15 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，測(cè)得峰面積對(duì)數(shù)值的RSD分別為果糖1.1%、葡萄糖1.6%、蔗糖2.0%、水蘇糖2.6%，表明供試品溶液15 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一黃精樣品(雞頭黃精，蒸法2 h)各5份，按照2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果RSD分別為果糖1.8%、葡萄糖2.0%、蔗糖1.3%、水蘇糖3.2%，表明該方法重復(fù)性良好。果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.2、13.8、11.1、8.4 mg·g-1。

2.9 檢測(cè)限

取對(duì)照品溶液，分別按適當(dāng)比例逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)信噪比為3時(shí)，果糖的檢測(cè)限為0.3 μg、葡萄糖為0.4 μg、蔗糖為0.2 μg、水蘇糖為0.2 μg。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的黃精樣品(雞頭黃精，蒸法2 h)各6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度分別為果糖1.10 mg·mL-1、葡萄糖0.25 mg·mL-1、蔗糖0.22 mg·mL-1、水蘇糖0.16 mg·mL-1)各10 mL，加水40 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40 min，取出，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定各糖含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表明此方法準(zhǔn)確度較好。

2.11 樣品測(cè)定結(jié)果

2.11.1 炆法 分別取炮制時(shí)間為0、2、4、8、12、16、24 h的三種黃精樣品，按照2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 4種糖的回收率試驗(yàn)(n=6)

表2 炆法炮制三種黃精中四種糖含量

2.11.2 蒸法 分別取炮制時(shí)間為0、2、4、8、12、16、24 h的三種黃精樣品，按照2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蒸法炮制三種黃精中四種糖含量

2.12 黃精炮制前后色譜圖

三種黃精在炮制前后色譜情況見(jiàn)圖2。

注：A.大黃精；B.姜形黃精；C.雞頭黃精；a.炮制前；b.蒸法24 h；c.炆法24 h；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.水蘇糖。圖2 三種黃精炮制前后色譜圖

3 討論

3.1 色譜條件選擇

3.1.1 色譜柱選擇 以2.1項(xiàng)下色譜條件考察2根糖分析色譜柱，色譜柱1：Waters -NH2柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色譜柱2：奧泰PrevailTMCarbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果色譜柱2基線平穩(wěn)，色譜峰形態(tài)和分離較好。

3.1.2 流速選擇 以2.1項(xiàng)下色譜條件考察流動(dòng)相流速，分別為1.0、0.9、0.8 mL·min-1。結(jié)果當(dāng)流速為1.0 mL·min-1時(shí)，柱壓較大，葡萄糖、果糖、蔗糖色譜峰較靠近,影響積分結(jié)果；當(dāng)流速為0.8 mL·min-1時(shí)，所需分離時(shí)間長(zhǎng)，峰寬增加,綜合分析將流速定為0.9 mL·min-1。

3.2 供試品溶液制備條件選擇

由于小分子糖在水中溶解度高，多以水作為提取溶劑。本文考察了水作為提取溶劑，體積分別為25、50、100 mL時(shí)，按2.3.2項(xiàng)下制備條件制備并測(cè)定，結(jié)果含量基本一致。由于提取溶劑為25 mL時(shí)，制備的溶液較為黏稠，不易濾過(guò)；提取溶劑為100 mL時(shí)，一些峰面積過(guò)小，不易積分或積分誤差大，故選擇50 mL作為提取溶劑體積。

3.3 蒸法炮制和炆法炮制過(guò)程中單糖含量變化

在蒸法炮制過(guò)程中，隨炮制時(shí)間增加，果糖含量往往先上升，在炮制8～12 h左右達(dá)到峰值，隨后出現(xiàn)含量下降；大黃精及雞頭黃精的葡萄糖含量與果糖變化趨勢(shì)類(lèi)似，但姜形黃精中葡萄糖含量則為一個(gè)先上升后下降再上升復(fù)下降的波浪過(guò)程。說(shuō)明黃精在高溫加熱的炮制環(huán)境中，一方面，含有的粘液質(zhì)等多糖類(lèi)成分發(fā)生水解，變成了果糖、葡萄糖等單糖類(lèi)成分；另一方面，含有的單糖類(lèi)成分與氨基酸類(lèi)成分發(fā)生Maillard(美拉德)反應(yīng)。Maillard反應(yīng)又稱(chēng)為非酶褐變反應(yīng)，它是指羰基化合物(主要為還原糖類(lèi))與氨基化合物(如氨基酸、蛋白質(zhì)等)之間發(fā)生的反應(yīng)，造成了單糖含量先增加后減少的變化過(guò)程。而炆法炮制過(guò)程中，果糖和葡萄糖均表現(xiàn)為隨炮制時(shí)間增加含量也相應(yīng)增加，說(shuō)明粘液質(zhì)等多糖成分發(fā)生水解，變成了果糖、葡萄糖等單糖類(lèi)成分。從而說(shuō)明蒸法炮制和炆法炮制過(guò)程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)有差異。

3.4 蒸法炮制和炆法炮制過(guò)程中雙糖及四糖含量變化

三種黃精在兩種炮制方法中，作為二糖的蔗糖含量變化均不大，可能是未參與反應(yīng)；作為四糖的水蘇糖含量呈下降趨勢(shì)，則進(jìn)一步證明了黃精炮制過(guò)程中多糖水解生成單糖，一方面制其副作用，消除麻味，減輕對(duì)咽喉的刺激;另一方面增加黃精的藥物補(bǔ)脾潤(rùn)肺、益腎的作用。通過(guò)上述研究，說(shuō)明了黃精通過(guò)炮制達(dá)到減毒增效目的的物質(zhì)變化過(guò)程，進(jìn)一步揭示了黃精的炮制機(jī)理。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 方圓.黃精多糖和低聚糖的分離與結(jié)構(gòu)解析[M].無(wú)錫：江南大學(xué)：2011.

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DeterminationofFourSaccharidesinPolygonatumProcessingbyHPLC-ELSD

CHANG Liang，CHENZhenzhen，WUYi*，DINGYinping

(JiangxiProvincialInstituteforDrugControl，JiangxiProvincialEngineeringResearchCenterforDrugandMedicinalDeviceQuality，Nanchang330029，China)

Objective：To compare the contents of four saccharides in three speciesPolygonatumin processing.Methods：An analytical method for determination of four saccharides inPolygonatumprocessing by HPLC-ELSD was established.The chromatographic separation was achieved on a PrevailWTCarbohydrate ES column with a mobile phase which was composed of acetonitrile(A)and water(B)for gradient elution.The flow rate was 0.9 mL·min-1.The column temperature was 35 ℃.The ELSD drift tube temperature was set at 105 ℃，and nitrogen flow was maintained at 2.5 L·min-1.Results：The contents of fructose and glucose increased with the increase of processing time，sucrose content remained unchanged，stachyose content decreased with the increase of processing time.Conclusion：The changes of saccharides in three speciesPolygonatumsin two processing methods are different，this can provide scientific basis for the processing mechanism forPolygonatums.

Polygonatum；processing method；saccharide；HPLC-ELSD

2015-09-02)

江西省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20122BAB205075)

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吳毅，博士，副主任中藥師，研究方向：藥品質(zhì)量控制與安全性研究；Tel：(0791)86217386，E-mail：wuyijx@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.027