汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠，馬雙成

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

·基礎(chǔ)研究·

?；悄懰徕c對(duì)照品標(biāo)定方法的建立

汪祺，何軼，鄭笑為，姚令文，劉燕，戴忠*，馬雙成*

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的：采用多種技術(shù)手段建立?；悄懰徕c對(duì)照品標(biāo)定技術(shù)方法。方法：采用紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜(包括1H-和13C-NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)；用薄層色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行純度檢查；用質(zhì)量平衡法進(jìn)行定量分析，并采用定量核磁技術(shù)對(duì)賦值結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。其中首次采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)牛磺膽酸鈉原料中殘留溶劑進(jìn)行快速篩查。結(jié)果：?；悄懰徕c原料經(jīng)薄層色譜法及高效液相色譜法測(cè)定，純度達(dá)到99.16%；質(zhì)量平衡法賦值結(jié)果87.9%，定量核磁共振法的驗(yàn)證結(jié)果為87.9%。結(jié)論：?；悄懰徕c對(duì)照品原料的定性鑒別結(jié)果符合要求，定量賦值結(jié)果準(zhǔn)確、可靠；能夠用于含量測(cè)定用對(duì)照品分發(fā)、使用。

牛磺膽酸鈉；對(duì)照品標(biāo)定；定性鑒別；質(zhì)量平衡法；定量核磁共振技術(shù)

?；悄懰徕c對(duì)照品來(lái)源為?？苿?dòng)物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉進(jìn)行成鹽處理形成牛磺膽酸鈉鹽。目前應(yīng)用涉及標(biāo)準(zhǔn)為2015版《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)牛黃蛇膽川貝液、蛇膽川貝膠囊、蛇膽陳皮片、蛇膽陳皮膠囊等項(xiàng)下的鑒別或含量測(cè)定用，應(yīng)用較為廣泛。由于牛磺膽酸鈉在成鹽處理過(guò)程中進(jìn)行了堿化處理，加入過(guò)量鈉元素以保證成鹽完全，從而滿足定值要求，因此在對(duì)其原料進(jìn)行對(duì)照品標(biāo)定過(guò)程中，需采用多種技術(shù)手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)、純度檢查，最終定量賦值。

1 儀器、試劑與供試品

1.1 儀器

Waters 2695-2996 PDA系統(tǒng)；薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀(卡瑪公司)；庫(kù)倫水分測(cè)定儀(METTLER公司)；Agilent 6410B液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)6410 Triple Quad四級(jí)桿質(zhì)譜儀；Agilent 7890氣相色譜儀；Nicolet iN10MX紅外光譜儀(Thermo公司)；Bruker AV-Ⅲ-500核磁共振波譜儀(500Hz)；X-5顯微熔點(diǎn)儀；NETZSCH STA4493F3 熱重分析儀(天平靈敏度：0.1 μg，溫度范圍：室溫～2000 ℃)。氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)：氣相系統(tǒng)為Agilent Technologies 7890B-GC system；質(zhì)譜系統(tǒng)為Agilent Technologies 7000C GC/MS Triple Quad。

1.2 試劑與供試品

高效液相色譜中采用的乙腈和甲醇均為HPLC級(jí)(fisher公司)，水采用Millipore純化水系統(tǒng)制備，磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純，薄層色譜應(yīng)用中的正丁醇、冰醋酸、異丙醇、甲醇均為分析純。供試品為待標(biāo)化的?；悄懰徕c對(duì)照品原料，來(lái)源為?？苿?dòng)物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛膽粉。對(duì)照品為牛磺膽酸鈉對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110815-201309，純度87.8%；批號(hào)：110815-201308，純度88.9%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 純度檢查

2.1.1 薄層色譜法 采用薄層色譜法將待標(biāo)定樣品與對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)[1]，通過(guò)主斑點(diǎn)比移值(Rf)、主斑點(diǎn)顏色及深淺、雜質(zhì)斑點(diǎn)分布等情況可直觀快速地對(duì)待標(biāo)定原料純度進(jìn)行初步考察，10%硫酸乙醇顯色后，可見(jiàn)光及UV 366 nm下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，兩個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)下，待標(biāo)原料與對(duì)照品Rf值一致，主斑點(diǎn)明確，未見(jiàn)明顯雜質(zhì)斑點(diǎn)。

注：A.展開(kāi)劑：異丙醇-冰醋酸-水(9∶4∶3)；B.展開(kāi)劑：正丁醇-冰醋酸-水(10∶1∶8)上層；S.110815-201308批?；悄懰徕c對(duì)照品(純度88.9%)。圖1 ?；悄懰徕c薄層色譜圖

2.1.2 HPLC純度檢查 色譜柱：Agilent SB-C18

(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸二氫鉀(68∶32)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；結(jié)果見(jiàn)圖2。在上述條件下，進(jìn)樣10 μg，樣品與溯源保留時(shí)間一致；除主峰外，可見(jiàn)雜質(zhì)峰檢出，面積歸一化純度為99.17%；5%自身對(duì)照純度為99.16%。

圖2 ?；悄懰徕c原料HPLC圖譜

2.1.3 溶劑殘留檢查 首先采用熱重/差熱分析(TG/DTA)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)?；悄懰徕c原料中殘留溶劑進(jìn)行篩查，確定含有溶劑種類(lèi)后進(jìn)行定量測(cè)定。?；悄懰徕c對(duì)照品原料熱重曲線可見(jiàn)一明顯降落臺(tái)階，積分結(jié)果顯示熱重?fù)p失為14.9%，結(jié)果見(jiàn)圖3。氣相色譜柱設(shè)置溫度為230 ℃恒溫，熱分析儀加熱揮散出的氣體不經(jīng)色譜柱分離直接進(jìn)入質(zhì)譜測(cè)定。TIC模式一級(jí)掃描結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖3、4比較可知15～30 min時(shí)間段，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)值呈規(guī)律性增大，與熱重曲線質(zhì)量明顯改變時(shí)間段相符合。對(duì)該時(shí)間段質(zhì)譜峰進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5，由一級(jí)質(zhì)譜信息可看到準(zhǔn)分子離子峰46，經(jīng)與NIST08譜庫(kù)比對(duì)，初步推測(cè)?；悄懰徕c原料中可揮發(fā)物質(zhì)為乙醇。為了進(jìn)一步證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)將乙醇對(duì)照品與供試品同時(shí)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定，CID能量設(shè)為20 eV，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，供試品與對(duì)照品乙醇質(zhì)譜信息基本一致，可檢出準(zhǔn)分子離子峰m/z：46.1，碎片離子m/z：31.2[CH3CH2OH-CH3]+，m/z：29.2[CH3CH2OH-OH]+，經(jīng)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息可確定?；悄懰徕c中可揮發(fā)性成分為乙醇。在確定?；悄懰徕c原料含有溶劑種類(lèi)的基礎(chǔ)上，對(duì)溶劑殘留量進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果含乙醇6.33%(RSD=0.68%)。

圖3 ?；悄懰徕c熱重曲線圖

圖4 牛磺膽酸鈉可揮發(fā)物總離子流圖

注：A.?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)一級(jí)質(zhì)譜圖；B.供試品與NIST譜庫(kù)比對(duì)圖。圖5 ?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)譜比對(duì)圖

注：A.供試品；B.乙醇對(duì)照品。圖6 ?；悄懰徕c可揮發(fā)物質(zhì)譜確認(rèn)圖

2.2 結(jié)構(gòu)確認(rèn)

采用紫外光譜(ultraviolet-visible spectrum，UV)、紅外光譜(infrared spectrum，IR)和核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance，NMR)對(duì)?；悄懰徕c原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)，?；悄懰徕c結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖7。

圖7 牛磺膽酸鈉結(jié)構(gòu)示意圖

測(cè)試方法及條件：UV測(cè)定，供試品采用甲醇溶解，濃度約為0.01 mg·mL-1，掃描范圍200～400 nm；IR測(cè)定采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測(cè)定為120 MHz，13C-NMR測(cè)定為500 MHz，供試品采用CD3OD溶解。

2.3 定量賦值

牛磺膽酸鈉原料定值采用國(guó)際上通用的質(zhì)量平衡法確定含量，同時(shí)采用定量NMR技術(shù)對(duì)質(zhì)量平衡法賦值準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3.1 質(zhì)量平衡法賦值結(jié)果 質(zhì)量平衡法的計(jì)算公式為：

A=P×(100%-W-R-I)

(1)

式中：A—供試品中?；悄懰徕c含量(%)P—牛磺膽酸鈉原料的色譜純度(%)W—原料中的水分含量(%)R—原料中殘留溶劑含量(%)I—原料中熾灼殘?jiān)?%)

在?；悄懰徕c原料的賦值中，原料色譜純度P為99.16%(見(jiàn)2.1.2)；水分結(jié)果W為1.15%(采用庫(kù)倫滴定法測(cè)定7份樣品，每份樣品約40 mg，RSD=0.38%)，殘留溶劑結(jié)果R為含乙醇6.33%(RSD=0.68%)，熾灼殘?jiān)?《中國(guó)藥典》2015版一部附錄Ⅸ J法)I為3.82%，故采用質(zhì)量平衡法的賦值結(jié)果為99.16%×(1-1.15%-6.33%-3.82%)=87.9%。

2.3.2 定量NMR法驗(yàn)證結(jié)果 采用富馬酸(日本TCI公司，純度99.9%)為內(nèi)標(biāo)，氘代甲醇溶解待測(cè)樣品，以?；悄懰徕c1H譜中的δH2.99(2H，H26)信號(hào)峰與內(nèi)標(biāo)物1H譜中的δH6.77(2H)信號(hào)峰(見(jiàn)圖8)，按公式(2)計(jì)算供試品的含量，定量NMR法的測(cè)定結(jié)果為87.9%(RSD=0.52%)。

圖8 ?；悄懰徕c定量核磁共振色譜圖

(2)

式中：W1—內(nèi)標(biāo)物稱樣量：C1—內(nèi)標(biāo)物純度(99.9%)MW1—內(nèi)標(biāo)物分子量(116.07)V1—內(nèi)標(biāo)物峰積分面積W2—供試品稱樣量MW2—供試品分子量(537.68)V2—供試品峰積分面積C2—供試品純度f(wàn)—質(zhì)子比系數(shù)

3 結(jié)論

本批?；悄懰徕c原料的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果(UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS)與其結(jié)構(gòu)相符合，純度大于99%(HPLC法和TLC法)，證明該批原料可以用于牛磺膽酸鈉的含量測(cè)定。

采用質(zhì)量平衡法測(cè)得的牛磺膽酸鈉原料含量為87.9%，用定量NMR法測(cè)得的結(jié)果為87.9%，二者差異較小，說(shuō)明本批?；悄懰徕c原料賦值結(jié)果準(zhǔn)確，該批原料可作為對(duì)照品分發(fā)，使用。

4 討論

4.1 TGA/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)

TGA/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)是一項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)，熱重分析法(TGA)可分析樣品在熱作用下質(zhì)量的變化，缺點(diǎn)是無(wú)法確認(rèn)丟失物，通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)來(lái)分析熱重實(shí)驗(yàn)中揮發(fā)出來(lái)的氣體給實(shí)驗(yàn)室提供了一種確認(rèn)方法[2-4]。目前，對(duì)照品原料在標(biāo)定過(guò)程中采用TG/DTA-GC-MS聯(lián)用系統(tǒng)，在測(cè)定熱重?fù)p失的同時(shí)，可對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行快速篩查，再經(jīng)氣相色譜法測(cè)定溶劑含量，庫(kù)倫水分儀測(cè)定含水量等實(shí)驗(yàn)具體給值。

4.2 牛磺膽酸鈉熾灼殘?jiān)挠?jì)算

?；悄懰徕c原料為?；悄懰峤?jīng)成鹽處理為其鈉鹽，?；悄懰徕c分子量537.68，推算鈉含量理論值為4.28%，熾灼殘?jiān)鼘?shí)驗(yàn)過(guò)程中，加入濃硫酸進(jìn)行處理，折算硫酸鈉含量應(yīng)為13.21%，熾灼殘?jiān)鼘?shí)驗(yàn)結(jié)果殘?jiān)繛?7.89%，扣除理論值后殘?jiān)繛?.82%。

4.3 ?；悄懰徕c定量NMR信號(hào)峰的選擇

定量NMR技術(shù)能夠以國(guó)際基準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)直接測(cè)定供試品的純度，具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、計(jì)量溯源性等優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已被嘗試用于對(duì)照品的標(biāo)化中[5-9]。在?；悄懰徕c原料賦值過(guò)程中，采用定量NMR方法對(duì)質(zhì)量平衡法進(jìn)行驗(yàn)證。定量峰選擇上，避免活潑氫干擾，盡量選擇信號(hào)穩(wěn)定，雜質(zhì)峰干擾小的26位的兩個(gè)氫質(zhì)子進(jìn)行定量分析，結(jié)果與質(zhì)量平衡法相互吻合，保證了牛磺膽酸鈉定值準(zhǔn)確。

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EstablishmentofChemicalReferenceSubstanceofSodiumTaurocholate

WANG Qi，HE Yi，ZHENG Xiaowei，YAO Lingwen，LIU Yan，DAI Zhong*，MA Shuangcheng*

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective：To establish chemical reference substance (CRS) of sodium taurocholate.Methods：The structure of the candidate material was characterized by ultraviolet-visible (UV)，infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR，including1H-NMR and13C-NMR).Its chromatographic purity was determined by thin-layer chromatographic (TLC) systems and high performance liquid chromatography (HPLC).In this study a rapid determination of the volatilizable substance in sodium taurocholate was firstly to use with a TGA/DTA-GC-MS combined system.Results：The results of qualitative identification of sodium taurocholate was 99.16%.The assigned value by mass balance method was 87.9%，in accordance with that obtained by quantitative NMR (87.9%).Conclusion：The structure and purity of the sodium taurocholate material met the requirements of CRS for assay.The accuracy of the assigned value obtained by mass balance method was accurate and reliable.Thus the sodium taurocholate material can be used for quality control.

Sodium Taurocholate；substance calibration；structural characterization；standard material analysis；mass balance method

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.009

2015-12-22)

*

戴忠，研究員，研究方向：藥物分析，Tel：(010)67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn；馬雙成，研究員，研究方向：藥物分析及藥物安全性評(píng)價(jià)，Tel：(010)67095282，E-mail：mashuangcheng@nifdc.org.cn