代寶強，李思迪，盛益華，張廣平，馬麗娜，葉祖光

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

金銀花及山銀花提取物體外溶血與凝集試驗比較研究△

代寶強，李思迪，盛益華，張廣平，馬麗娜，葉祖光*

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700)

目的：比較金銀花與山銀花在溶血性方面的安全性，以及比較體外試管法(肉眼觀察法)及改良的體外溶血試驗法(分光光度法)的檢測敏感性。方法：依據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄XIII H溶血與凝聚檢查法，參照國家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)內(nèi)容，采用體外試管法(肉眼觀察法)及改良的體外溶血試驗法(分光光度法)比較分析金銀花與山銀花的溶血反應(yīng)。結(jié)果：金銀花提取物各稀釋濃度在應(yīng)用經(jīng)典方法檢測情況下均未發(fā)生溶血；而山銀花提取物濃度越高、實驗觀察時間越長，發(fā)生溶血情況越多；分光光度法較之肉眼觀察法對溶血程度有了量化認(rèn)識，因而更加準(zhǔn)確，特別是對邊緣樣品更能說明問題。結(jié)論：在中藥注射劑的應(yīng)用中，金銀花提取物在安全性方面較之山銀花具有較大優(yōu)勢，而山銀花存在諸多安全隱患，在選擇忍冬科中藥材(金銀花、山銀花等)進行中藥注射劑的應(yīng)用或生產(chǎn)時，必須避免混用或誤用山銀花；溶血試驗中分光光度法在敏感度方面優(yōu)于肉眼觀察法。

金銀花；山銀花；溶血

近幾十年來，中藥注射劑領(lǐng)域的研究已取得很大的進展，品種增多，并且療效更明確，應(yīng)用范圍更廣[1-3]。在目前已上市的呼吸系統(tǒng)中藥注射劑中，如雙黃連和清開靈注射液中，金銀花藥材的出現(xiàn)頻率最高。金銀花作為一種常用中藥，其形狀特征和藥理作用與山銀花存在較多相似之處?！吨腥A人民共和國藥典》1963年版首次收載了金銀花[4]，2005年以前在《中華人民共和國藥典》(《中國藥典》)中，將山銀花與金銀花混為同一種中藥，均稱為金銀花，《中國藥典》2005年版以后將金銀花與山銀花兩種中藥進行區(qū)分，但其檢驗項目和方法卻并不能將兩種藥材完全區(qū)分開[5]。近年來，特別是在廣泛應(yīng)用于非典型性肺炎之后，金銀花的藥用價值被逐漸認(rèn)識，但其存在產(chǎn)量有限、價格較高的缺點，而山銀花的產(chǎn)量較大，且價格較低，導(dǎo)致目前中藥材市場將山銀花作為正品金銀花銷售的現(xiàn)象很普遍，一些廠商采用山銀花冒充金銀花入藥以獲得高額利潤[6-7]。在中藥材的實際應(yīng)用中，也存在著金銀花與山銀花藥材區(qū)分不清、混用的現(xiàn)象。因此，金銀花與山銀花的安全性考察及評價顯得尤為重要[8]。

中藥注射劑組成藥味多、成分復(fù)雜，存在產(chǎn)生溶血與凝聚作用的可能，從而給人體正常生理帶來嚴(yán)重?fù)p害和影響[9]，《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定：凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應(yīng)的其他藥物制劑均應(yīng)進行溶血性試驗[10]。因此對中藥注射劑進行溶血與凝聚檢查是其生物安全性檢查的一項重要內(nèi)容。另外，我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的溶血與凝聚試驗方法還不能完全滿足中藥注射劑臨床用藥的安全性要求，在實踐中發(fā)現(xiàn)上述規(guī)定有不盡人意之處，主要是規(guī)定的方法較粗略，對結(jié)果的判斷不嚴(yán)密，因而造成了實際操作中的困難，如檢驗員只能通過直觀地目測供試品管上層液顏色相對于陰性管上層液顏色的深淺來作出判斷結(jié)論，其主觀性和隨機性比較大，并最終大大影響了判斷發(fā)生溶血的準(zhǔn)確性。

由此，本文對不同產(chǎn)地金銀花和山銀花體外溶血與凝聚反應(yīng)進行了試驗研究，并對肉眼觀察法與分光光度法兩種溶血檢查法的實驗結(jié)果進行了比較分析，為金銀花與山銀花安全性評價及改良溶血發(fā)生測定實驗方法提供相關(guān)資料和依據(jù)。

1 材料

1.1 供試品

所有金銀花與山銀花供試品溶液均由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，樣品信息見表1。

表1 金銀花與山銀花供試品信息

1.2 動物

普通級家兔2只，體重2.4～2.5 kg，購于北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(京)2010-0001。

1.3 試劑

氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司)，批號：130731405，規(guī)格：500 mL∶4.5 g。

1.4 儀器

SHA-C 水浴恒溫器，sigma 3-18K 高速冷凍離心機(德國)，Varioskan flash多功能酶標(biāo)儀(美國)。

2 方法

2.1 體外試管法(肉眼觀察法)

實驗依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄XIII H溶血與凝聚檢查法。

2.1.1 2%紅細(xì)胞混懸液的制備 取兔血約50 mL，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，除去纖維蛋白原，使其成為脫纖血液。加入約10倍量的0.9%氯化鈉注射液，搖勻，1500 r·min-1離心15 min，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用0.9%氯化鈉注射液按上述方法洗滌2～3次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液配成2%的混懸液，供試驗用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取1～7號供試品原液，加0.9%氯化鈉注射液倍比稀釋，共4個濃度：1/2稀釋、1/4稀釋、1/8稀釋、1/16稀釋。

2.1.3 檢查法 取潔凈玻璃試管，分別為供試品管(平行2管)、陰性管、陽性管、供試品對照管、陰性對照管、陽性對照管。按表2所示依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉注射液、蒸餾水、供試品溶液，混勻后，放入(37±0.5) ℃的水浴恒溫器中進行溫育，3 h后觀察溶血和凝聚反應(yīng)。

表2 溶血試驗加樣表 /mL

2.2 改良的體外溶血試驗法(分光光度法)

實驗中將溫育各管溶液1200 r·min-1離心5 min，吸取上清液，在545 nm波長處測定其吸收度(A)，并按公式(1)計算溶血度，根據(jù)《中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光變態(tài)反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》判斷，溶血度>5%表明有溶血發(fā)生。

溶血度(%)=[(A樣品-A樣本對照)-(A陰性-A陰性對照)]/[(A陽性-A陽性對照)-(A陰性-A陰性對照)]×100%

(1)

3 結(jié)果

3.1 體外試管法(肉眼觀察法)結(jié)果

表3～6為0.5～3.0 h各時間點各供試品體外試管法(肉眼觀察法)溶血與凝聚檢查結(jié)果。

表3中0.5 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果表明1～4號供試品1/2稀釋液、2與3號供試品1/4稀釋液在0.5 h出現(xiàn)溶血反應(yīng)，其他供試品均未出現(xiàn)溶血反應(yīng)。

表3 0.5 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果

注：+表示有溶血/凝聚發(fā)生，-表示無溶血/凝聚發(fā)生，下同。

表4中1.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果表明1～4號供試品1/2稀釋液、1～3號供試品1/4稀釋液、2與3號供試品1/8稀釋液在1.0 h出現(xiàn)溶血反應(yīng)，其他供試品均未出現(xiàn)溶血反應(yīng)。

表4 1.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果

表5中2.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果表明1～4號供試品1/2稀釋液、1～3號供試品1/4稀釋液、2與3號供試品1/8稀釋液在2.0 h出現(xiàn)溶血反應(yīng)，其他供試品均未出現(xiàn)溶血反應(yīng)。

表5 2.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果

表6中3.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果表明1～4號供試品1/2稀釋液、1/4稀釋液、2與3號供試品1/8稀釋液在3.0 h出現(xiàn)溶血反應(yīng)，其他供試品均未出現(xiàn)溶血反應(yīng)。

表6 3.0 h供試品溶血與凝聚檢查結(jié)果

實驗結(jié)果表明山銀花供試品在1/2、1/4、1/8稀釋濃度下的所有時間點均出現(xiàn)了不同程度的溶血；而金銀花提取物各稀釋濃度在應(yīng)用該經(jīng)典方法檢測情況下均未發(fā)生溶血，且山銀花供試品稀釋液濃度越高、實驗觀察時間越長，發(fā)生溶血的樣品越多。

3.2 改良的體外溶血試驗法(分光光度法)結(jié)果

表7中應(yīng)用分光光度法對3.0 h供試品溶血度檢查的結(jié)果表明，1～5、7號供試品1/2、1/4稀釋液，1～3號供試品1/8稀釋液，2與3號供試品1/16稀釋液溶血度>5%；其他供試品溶血度均<5%。

實驗結(jié)果表明3.0 h山銀花供試品稀釋液濃度越高，溶血度>5%的樣品越多，與山銀花比較，金銀花供試品各稀釋液溶血度>5%的樣品數(shù)明顯較少。

表7 分光光度法對3.0 h供試品溶血度檢查結(jié)果

注：-表示供試品溶血度<5%；+表示供試品溶血度>5%。

4 討論

《化學(xué)藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》指出：溶血反應(yīng)發(fā)生機制復(fù)雜，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的臨床前體內(nèi)試驗方法以全面評價藥物制劑的溶血反應(yīng)，因此推薦未有相同給藥途徑上市制劑在長期毒性研究中兼顧考察制劑的溶血性。試驗時應(yīng)注意觀察溶血反應(yīng)的有關(guān)指標(biāo)及體征(如網(wǎng)織紅細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)、膽紅素、尿蛋白、腎炎和脾臟瘀血等)，如出現(xiàn)溶血時，應(yīng)進行進一步研究[10]。另外，早年間國內(nèi)以山銀花為原料制成的銀黃注射液就有溶血現(xiàn)象出現(xiàn)[11]，并且近年來諸多學(xué)者對山銀花的安全性提出質(zhì)疑，提示可能存在發(fā)生溶血的可能，因此，本實驗對金銀花與山銀花提取物在制劑的溶血性方面進行了細(xì)致觀察。本研究分別應(yīng)用肉眼觀察法與分光光度法檢測金銀花與山銀花提取物溶血情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山銀花供試品所有稀釋濃度下的所有時間點均出現(xiàn)了不同程度的溶血；金銀花提取物各稀釋濃度在應(yīng)用經(jīng)典方法檢測情況下均未發(fā)生溶血，提示山銀花濃度越高、實驗觀察時間越長，發(fā)生溶血的可能性越大，金銀花可能在發(fā)生溶血相關(guān)的安全性方面明顯優(yōu)于山銀花，并且山銀花不同產(chǎn)地發(fā)生溶血的幾率差異較大。

另外，本實驗按《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄XIII H溶血與凝聚檢查法[12]，對供試品金銀花和山銀花提取物分別采用常規(guī)的肉眼觀察法以及分光光度法進行溶血檢測，發(fā)現(xiàn)兩種實驗判斷結(jié)果大致相同，但仍存在一些差別，即3.0 h肉眼觀察法檢測時1號供試品1/8稀釋液，2、3號供試品1/16稀釋液，5、7號供試品1/2、1/4稀釋液均為陰性結(jié)果，而分光光度法檢測結(jié)果為陽性，說明分光光度法與肉眼觀察法相比對溶血的大小有了量化認(rèn)識，因而更加準(zhǔn)確，特別是對邊緣樣品更能說明問題，而肉眼觀察法檢測時可能存在假陰性，由此說明，以往對中草藥溶血作用的測定一般所采取的常規(guī)試管觀察法，即用肉眼觀察其溶血情況，此法僅能觀察到溶血的大致情況，并不能具體檢測出紅細(xì)胞破裂的程度，即溶血程度。而分光光度法可相對精確地測定中藥的溶血程度，并且操作簡便、準(zhǔn)確可靠，能消除常規(guī)試管觀察法中存在的主觀性所導(dǎo)致的誤差，對臨床用藥的安全性具有重要的指導(dǎo)意義[13]。

在金銀花和山銀花的安全性比較研究方面，有研究表明山銀花中含有含量較高并且可能引起不良反應(yīng)的灰氈毛忍冬皂苷乙，但并不存在于金銀花中[14]，因此較高含量的灰氈毛忍冬皂苷乙可能是山銀花發(fā)生溶血等毒性的原因之一，另外，不同產(chǎn)地山銀花中有效成分綠原酸及其他成分含量相差懸殊[15]，可能是不同產(chǎn)地山銀花發(fā)生毒性并且程度不同的原因之一。

也有研究者發(fā)現(xiàn)在相同的生產(chǎn)工藝條件下，山銀花制劑的β-氨基己糖苷酶釋放率較金銀花相應(yīng)制劑高，即山銀花比金銀花更容易刺激嗜堿性肥大細(xì)胞脫顆粒，山銀花制劑發(fā)生類過敏與過敏反應(yīng)，金銀花制劑僅發(fā)生過敏反應(yīng)[8]，可能與山銀花含有較多綠原酸有關(guān)(綠原酸可能是過敏原或引起類過敏反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì))[16]，認(rèn)為山銀花相關(guān)制劑與金銀花相比，存在更多的安全隱患。另外，山銀花制劑發(fā)生毒性[11]與其加工方法有關(guān)，雷志鈞等[17]發(fā)現(xiàn)山銀花不恰當(dāng)?shù)募庸し椒ㄒ部赡苁顾幉牡亩拘约哟?，品質(zhì)降低，增加了山銀花使用的不安全性，可能導(dǎo)致過敏及類過敏反應(yīng)的發(fā)生。本實驗提示金銀花相對于山銀花發(fā)生溶血的幾率較小，山銀花與金銀花發(fā)生溶血毒性的不同可能是由于兩者主要化學(xué)成分含量差異較大，金銀花在發(fā)生溶血相關(guān)的安全性方面優(yōu)于山銀花，由此得出結(jié)論，金銀花的安全性可能優(yōu)于山銀花。

中藥注射劑具有作用迅速、生物利用度高等特點，能較好地發(fā)揮中醫(yī)中藥治療急、重癥的特點，在某些方面其作用甚至超過化學(xué)藥，故在臨床的應(yīng)用日趨廣泛，但出現(xiàn)的不良反應(yīng)報告也逐漸增多。中藥注射劑中常含有生物堿、內(nèi)酯、木脂素、萜類、鞣質(zhì)、多肽、蛋白質(zhì)和色素等多種成分，有些成分本身還是致敏物質(zhì)(如鞣質(zhì)和蛋白質(zhì))，并且對那些過敏性體質(zhì)的患者來說，中藥注射劑的成分越多就越易引起不良反應(yīng)[18]。

綜上，在中藥注射劑的應(yīng)用中，金銀花提取物在安全性方面較之山銀花具有較大優(yōu)勢，而山銀花存在諸多安全隱患，本實驗發(fā)現(xiàn)山銀花在發(fā)生溶血相關(guān)的安全性方面存在較大的隱患，并且可能與兩者在主要化學(xué)成分上含量的較大差異有關(guān)，在選擇忍冬科中藥材(金銀花、山銀花等)進行中藥注射劑的應(yīng)用或生產(chǎn)時，必須避免混用或誤用山銀花，建議從多方面深入研究和全面考察，科學(xué)評價金銀花的特色與優(yōu)勢，努力做好物盡其用、合理使用，更好地開發(fā)和保護藥用資源。

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ComparativeStudyonHemolysisandCohesionEffectsofLoniceraeJaponicaeFlosandLoniceraeFlosExtractsinvitroTest

DAIBaoqiang1，LISidi1，SHENGYihua1，ZHANGGuangping1，MALina1，YEZuguang1*

(InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Objective：To compare security of hemolysis between Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos and sensitivity of external test tube method and improved hemolysis test as well.Methods：According to Chinese Pharmacopoeia 2010 Edition Appendix XIII H hemolysis and cohesion test and research technical guidelines of chemical excitant，allergic and hemolytic，compare and analysis hemolytic reaction between Lonicerae Japonicae Flos and Lonicerae Flos by external test tube method and improved hemolysis test.Results：Hemolysis did not occur in all of the concentration dilutions of Lonicerae Japonicae Flos extract by the classical method.However，the more hemolysis occurred by the higher concentration dilution of Lonicerae Flos and the longer observation time.Compared with external test tube method，spectrophotometry is more accurate for observing degree of hemolysis，especially for boundary samples.Conclusion：In application of Chinese traditional medicinal injections，Lonicerae Japonicae Flos extract has more advantages in security，so Lonicerae Flos must be avoid to be used in applying and producing Chinese traditional medicinal injections.Spectrophotometry is more sensitive than external test tube method in hemolysis test.

Lonicerae Japonicae Flos；Lonicerae Flos，hemolysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.015

2016-01-28)

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2014ZX09304-307，2015ZX09501004)

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葉祖光，研究員，研究方向：中藥毒性；E-mail：yezuguang@sina.com