譚曉蕾，易帆，譚芳，彭勇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎(chǔ)研究·

不同產(chǎn)地瑪卡遺傳多樣性的ISSR分析

譚曉蕾，易帆，譚芳，彭勇*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：從DNA 分子水平分析國(guó)內(nèi)外5個(gè)不同產(chǎn)地瑪卡的遺傳多樣性，探索其相互之間的親緣關(guān)系。方法：采用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)11份不同產(chǎn)地瑪卡進(jìn)行聚類分析。從20條ISSR引物中篩選出8條進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，用NTSYS軟件UPGMA 法進(jìn)行親緣關(guān)系聚類分析，構(gòu)建聚類圖。結(jié)果：8條引物共獲得51條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶22條，平均多態(tài)性比率為43.1%。11份瑪卡的相似系數(shù)在：0.627 5～0.960 8。聚類結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)與秘魯原產(chǎn)瑪卡明顯被分為兩大類。在國(guó)產(chǎn)9個(gè)樣品中，云南、西藏、青海聚為一支，新疆產(chǎn)瑪卡單獨(dú)聚成一支。結(jié)論：ISSR標(biāo)記可以區(qū)別秘魯原產(chǎn)與引種的瑪卡樣品，然而國(guó)產(chǎn)瑪卡整體遺傳變異小，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)。

瑪卡；ISSR；遺傳多樣性；親緣關(guān)系

瑪卡LepidiummeyeniiWalp.是原產(chǎn)于秘魯安第斯山脈(海拔3500 m以上)的珍稀高山藥食兩用植物，屬十字花科獨(dú)行菜屬，除含有多種營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有瑪卡生物堿、芥子油苷及其衍生物、甾醇等多種次生代謝活性成分[1-3]。研究表明瑪卡具有抗疲勞[4-5]、改善性功能[6]、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫力、抗氧化[7]的作用，并對(duì)骨質(zhì)疏松[8]、抑郁癥等有很好的治療效果[9-10]，有秘魯人參、秘魯國(guó)寶等美譽(yù)。2001年《國(guó)外醫(yī)藥—植物藥分冊(cè)》首次介紹了來(lái)自南美洲的瑪卡[11]。2002 年瑪卡在云南會(huì)澤首次引種成功，此后短短十幾年間發(fā)展迅速，相繼在我國(guó)云南、新疆、青海等省(區(qū))引種成功，在中國(guó)引起廣泛關(guān)注，并形成一定規(guī)模，成為高海拔山區(qū)發(fā)展經(jīng)濟(jì)新的增長(zhǎng)點(diǎn)。但是隨著栽培地區(qū)增多，藥材質(zhì)量也相應(yīng)成為值得社會(huì)正視的問(wèn)題。

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛運(yùn)用于藥物基因組DNA的分析之中，主要手段有ISSR、RAPD、RFLP、AFLP等。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)(Inter Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單重復(fù)間隔序列)不需要知道基因組序列即可設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、模板需要量少、多態(tài)性豐富、結(jié)果記錄方便、實(shí)驗(yàn)成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化與物種鑒定等多個(gè)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12-13]，在芍藥[14]、金錢草[15]、狼毒[16]、丹參[17]、蘿卜[18]等中藥材上已有成功應(yīng)用和報(bào)道。種質(zhì)資源是影響藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的一個(gè)重要因素，由于用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難將不同產(chǎn)地的瑪卡嚴(yán)格地區(qū)分鑒別開(kāi)，而有關(guān)用分子標(biāo)記分析不同產(chǎn)地瑪卡遺傳關(guān)系的研究也未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者采用ISSR技術(shù)對(duì)國(guó)內(nèi)外不同產(chǎn)地瑪卡的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并對(duì)不同產(chǎn)地的藥材進(jìn)行分子鑒別研究，為該藥材的規(guī)范引種栽培、加強(qiáng)資源保護(hù)和選種育種提供科學(xué)參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

用于本實(shí)驗(yàn)研究的瑪卡樣本共11份，分別采自中國(guó)的云南、新疆、西藏、青海以及秘魯。經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所彭勇研究員鑒定為瑪卡LepidiummeyeniiWalp.的根，憑證標(biāo)本保存于藥用植物親緣中心標(biāo)本室，具體編號(hào)及產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地的瑪卡樣品信息

1.2 試劑與儀器

PCR相關(guān)試劑：提取植物基因組 DNA 用十六烷基三基溴化銨(CTAB)、β-巰基乙醇購(gòu)自SIGMA公司，植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。瓊脂糖(A-garose，Gene公司)。Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs、超純水等(上海生工生物工程有限公司)，引物由北京博友順生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Marker：GeneRuler Express DNA Ladder (MBI Fermentas公司)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司);PTC-200 PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；TGear微型離心機(jī)(北京天根生化科技有限公司)；DK-8D型電熱恒溫水槽(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；DYY-7型電泳槽、DYY-12型電源(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 瑪卡總DNA的提取

取不同產(chǎn)地瑪卡干藥材適量，用滅菌超純水(ddH2O)將表面沖洗干凈，吸去水分，刮掉栓皮部分，切1～2 mm直徑小塊，稱取50 mg。采用北京天根生化科技有限公司植物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性和純度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：1～11.不同產(chǎn)地樣品；M.Marker DL2000；下同。圖1 不同產(chǎn)地瑪卡的總DNA 電泳圖譜

2.2 ISSR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

ISSR引物序列參考University of British Columbia提供的標(biāo)準(zhǔn)序列，同時(shí)參考其他相關(guān)文獻(xiàn)[18-20]，篩選出能產(chǎn)生多態(tài)、清晰且可重復(fù)條帶的引物，用于全部11個(gè)樣本分析。

ISSR反應(yīng)體系(50 μL)為：上下游引物和dNTP各1.0 μL (2.5 mmol·L-1)，總DNA 4 μL，MgCl24 μL(25 mmol·L-1)，PCR buffer 5 μL(10×)，0.6 μL Ex Taq，用ddH2O補(bǔ)足體積。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，55～62 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物置4 ℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后凝膠成像系統(tǒng)照相，記錄結(jié)果。引物S6和S7擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 引物S6和S7對(duì)11個(gè)瑪卡樣品PCR擴(kuò)增電泳圖譜

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

電泳圖譜中遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，根據(jù)ISSR擴(kuò)增條帶的有無(wú)，以1和0表示。具體而言PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0。形成ISSR的表型數(shù)據(jù)矩陣NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)(DICE系數(shù))，并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，建立樣品間的親緣關(guān)系。

3 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)20條引物的多次反復(fù)篩選，選出可有效擴(kuò)增的8個(gè)引物，用于全部11個(gè)種群樣本分析。篩選原則：條帶清晰可見(jiàn)，多態(tài)性高，重復(fù)性好。

對(duì)表1中11個(gè)不同產(chǎn)地瑪卡進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，各引物序列及擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2。Jaccard相似系數(shù)矩陣和聚類系統(tǒng)樹(shù)見(jiàn)表3和圖3。

ISSR擴(kuò)增的DNA片段集中在170～2000 bp，8條引物共獲得51條清晰可辨條帶，其中多態(tài)性條帶22條；平均每對(duì)引物擴(kuò)增出6.4條帶，2.8條具有多態(tài)性，平均多態(tài)性比率為43.1%。其中，多態(tài)性最高的為60%，低的只有16.7%。每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)5～8條不等，平均每個(gè)引物擴(kuò)增6.4條帶和2.8條多態(tài)帶。

表2 ISSR 8對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果

注：Y=(C，T)。

表3 基于ISSR標(biāo)記的瑪卡13個(gè)樣品的遺傳相似系數(shù)矩陣

圖3 基于ISSR標(biāo)記的瑪卡11個(gè)樣品的UPGMA聚類分析

利用8對(duì)引物在11個(gè)瑪卡樣品中獲得51條擴(kuò)增片段，在NTSYS軟件中計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)(GS值)，得到相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。從Jaccard 相似系數(shù)矩陣中可知各產(chǎn)地瑪卡的相似系數(shù)在：0.627 5～0.960 8，變幅為0.333 3。其中4號(hào)和5、7號(hào)樣品(云南和青海)遺傳相似系數(shù)最大(0.960 8)，6號(hào)和9號(hào)(新疆)遺傳相似系數(shù)其次(0.960 8)，表明它們之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異性小。3號(hào)(云南)和13號(hào)(秘魯)樣品之間的遺傳相似系數(shù)最小(0.627 5)，表明這2個(gè)樣品之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異性較大。整體遺傳差異與地理分布有一定關(guān)系，但整體遺傳變異小，遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)。

聚類樹(shù)狀圖上顯示9種不同產(chǎn)地瑪卡共聚為4支，第1支為8號(hào)(西藏)、1號(hào)(云南)。第2支為2號(hào)(云南)、3號(hào)(云南)、4號(hào)(云南)，5號(hào)(青海)、7號(hào)(青海)；其中4號(hào)與5號(hào)先聚為1支，而后與7號(hào)聚為1支，最后這1支與3號(hào)、2號(hào)共聚為1支。第3支為6號(hào)(新疆)、9號(hào)(新疆)。第4支為10號(hào)(秘魯)、11 號(hào)(秘魯)。結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)與秘魯原產(chǎn)的瑪卡整體上聚成兩大支，9個(gè)國(guó)產(chǎn)瑪卡聚在1支，上述前2支即云南、西藏、青?，斂ň蹫?支，新疆產(chǎn)瑪卡單獨(dú)聚成1支,表明瑪卡遺傳變異與地理分布存在一定的聯(lián)系，但9個(gè)國(guó)產(chǎn)的樣本，地理距離相對(duì)比較近的同一產(chǎn)地的藥材并沒(méi)有完全聚在一起，表明瑪卡藥材遺傳變異與地理分布沒(méi)有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，說(shuō)明國(guó)內(nèi)產(chǎn)區(qū)之間的遺傳分化不明顯。

4 討論

利用8條引物對(duì)11 個(gè)不同產(chǎn)地瑪卡總DNA進(jìn)行ISSR 擴(kuò)增，遺傳距離、遺傳相似系數(shù)等數(shù)據(jù)表明國(guó)產(chǎn)引種與秘魯原產(chǎn)的瑪卡之間的基因組DNA存在明顯的差異，產(chǎn)生差異的原因除了不同的明顯的地理因素之外，還可能與栽培樣品的種質(zhì)來(lái)源以及國(guó)內(nèi)外的栽培方法多樣有關(guān)。

同時(shí)，國(guó)產(chǎn)不同產(chǎn)地瑪卡間親緣關(guān)系較近，遺傳差異小，遺傳較為穩(wěn)定，原因可能是：①云南是目前國(guó)產(chǎn)瑪卡種植區(qū)域最廣泛、產(chǎn)量最高的地區(qū)，其他地區(qū)瑪卡可能源于與云南主產(chǎn)區(qū)之間的相互引種，并且引種歷史不長(zhǎng)，尚未發(fā)生變異；②瑪卡為閉花自交植物，基因流動(dòng)有限[21]，農(nóng)民在水肥管理、病蟲(chóng)害管理以及作物輪作等方面的不規(guī)范化嚴(yán)重制約了優(yōu)質(zhì)瑪卡的可持續(xù)生產(chǎn)；③2011年5月18日衛(wèi)生部發(fā)布公告，批準(zhǔn)瑪咖粉為新資源食品，瑪卡行業(yè)進(jìn)入到快速發(fā)展階段，麗江瑪卡漸已成為繼昭通天麻、文山三七之后，云南植物王國(guó)里的又一張名片，應(yīng)市場(chǎng)需求，周邊地區(qū)如西藏、青海、四川等地也開(kāi)始進(jìn)行大量人工種植。目前，國(guó)產(chǎn)瑪卡幾乎全部來(lái)源于人工栽培，這種人工栽培馴化及定向選擇，使遺傳差異越來(lái)越小。另一方面，瑪卡遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)，有利于保留其優(yōu)良基因，降低了選種、留種的難度，對(duì)進(jìn)一步的引種栽培及推廣種植等均具有積極意義。因此，需要通過(guò)加強(qiáng)環(huán)境控制、規(guī)范栽培技術(shù)、完善檢測(cè)方法等措施，保證國(guó)產(chǎn)引種外來(lái)植物藥的質(zhì)量。

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GeneticAnalysisofLepidiummeyeniiWalp.ResourcesfromDifferentHabitatsBasedonISSRMarkers

TANXiaolei，YIFan，TANFang，PENGYong*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Objective：To study the population genetic diversity and relationships ofLepidiummeyeniiWalp.resources from 5 different habitats according to their DNA molecule among them.Methods：Inter-simple sequence repeat (ISSR) molecular marker technique was adopted to analyze genetic diversity ofL.meyeniifrom different habitats.8 ISSR primers with good repeatability screened from 20 ISSR primers were screened out with PCR and the amplification products were examined by 1.5% agarose gel electrophoresis.Genetic parameters were analyzed statistical and population genetic cluster was assessed by using UPGMA method (NTSYS software).Results：A total of 51 bands were amplified from 8 ISSR primers，of which 22 bands were polymorphic loci.The percentage of polymorphic fragment was up to 43.1%.The genetic similarity coefficient of the 11samples was 0.627 5-0.960 8 and samples could be divided into 2 categories differencing between Peru and China.However，9 samples from China could not be distinguished from each other significantly through cluster analysis.Conclusion：The ISSR markers can be used for identification ofL.meyeniifrom Peru or China，but the genetic variation of ChineseL.meyeniiis small with strong genetic stability.

LepidiummeyeniiWalp.；ISSR；genetic diversity；genetic relationship

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.11.011

2015-12-27)

*

彭勇，研究員，研究方向：中藥資源、保健食品研發(fā)及中藥信息學(xué)研究；E-mail: ypeng@implad.ac.cn