薛露，王海麗，肖林焱，陳毅，單鳴秋，張麗，丁安偉

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

·基礎(chǔ)研究·

茜草炭抗雌二醇致大鼠出血傾向的活性部位研究△

薛露，王海麗，肖林焱，陳毅，單鳴秋，張麗，丁安偉*

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023)

目的：考察茜草炭各極性部位對(duì)子宮出血模型大鼠的止血作用。方法：空白組與其余各組分別灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、戊酸雌二醇(2.5 mg·kg-1)，連續(xù)灌胃3周，以宮血寧為陽性藥，對(duì)照組及模型組灌胃(ig) CMC-Na，陽性組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組和萃取剩余部位組分別ig相應(yīng)的治療藥物，觀察茜草炭各極性部位對(duì)子宮出血模型大鼠血液流變學(xué)、組織形態(tài)學(xué)、血小板系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的影響。結(jié)果：與空白組比較，模型組大鼠各切變率下的全血黏度降低(P<0.01)，TT、PT、APTT延長(P<0.05、0.01)，F(xiàn)IB、6-keto-PGF1α含量與ADP%升高(P<0.01)，6-keto-PGF1α/TXB2比值升高(P<0.01)，TXB2含量降低(P<0.01)。與模型組比較，乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組能顯著改善模型大鼠全血黏度(P<0.05，P<0.01)，縮短TT、PT、APTT (P<0.05，P<0.01)，減低FIB、6-keto-PGF1α含量(P<0.05，P<0.01)，乙酸乙酯提取物組顯著升高TXB2含量(P<0.05)；石油醚提取物組和萃取剩余部位組均與ADP%具有改善模型大鼠全血黏度、縮短TT、APTT與PT，降低FIB和ADP%，降低TXB2含量與6-keto-PGF1α含量的趨勢(shì)。結(jié)論：茜草炭乙酸乙酯提取物和石油醚提取物主要通過降低全血黏度、改善凝血功能以及促進(jìn)血小板聚集功能發(fā)揮止血作用，為茜草炭止血有效部位。

茜草炭；止血；子宮出血；有效部位

茜草是茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖，主要用于治療吐血，衄血，外傷出血，跌撲腫痛，關(guān)節(jié)痹痛，崩漏及瘀阻經(jīng)閉等[1]；茜草炒炭后寒性減弱，澀性增加，止血功效增強(qiáng)[2]，臨床主要用于治療由瘀血阻滯而引起的各種出血癥[3]。茜草炭現(xiàn)代研究較少，研究方向集中在炮制前后化學(xué)成分以及藥理作用變化，藥理研究多在正常動(dòng)物身上進(jìn)行，割裂了中醫(yī)“病癥”與中藥及其炮制品之間的關(guān)聯(lián)性，孤立地去評(píng)價(jià)藥物。且現(xiàn)代研究成果無法完全揭示茜草炭止血的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，前期研究發(fā)現(xiàn)茜草對(duì)子宮出血模型大鼠有較好的治療作用[4-5]，且茜草炭的止血功效強(qiáng)于茜草[6-7]，本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)茜草炭進(jìn)行初步分離，在子宮出血大鼠模型上從凝血功能、血小板功能、血液流變學(xué)及組織形態(tài)學(xué)等方面考察茜草炭各極性部位的止血作用，篩選出茜草炭止血活性部位，為研究其止血活性成分及作用機(jī)制提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1儀器

HANGPINGFA1104N型十萬分之一電子分析天平；SA-5000半自動(dòng)血流變測(cè)試儀(北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司 )；LG-PABER半自動(dòng)凝血分析儀 (北京中勤世帝科學(xué)儀器公司)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；352型酶標(biāo)儀(芬蘭LabsystemsMultiskanMS)；Waterse2695超高效液相色譜儀，包括四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD)。

1.2試劑

枸櫞酸鈉 (批號(hào)：F20110506)、羧甲基纖維素鈉(批號(hào)：20140806)、水合氯醛(批號(hào)：20150126)，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。凝血四項(xiàng)試劑盒：凝血酶時(shí)間(TT，批號(hào)：STY20301-52)、凝血酶原時(shí)間(PT，批號(hào)：STY20101-89B)、血漿纖維蛋白原(FIB，批號(hào)：STY20401-63)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT，批號(hào)：STY20201-59)，均購自北京中勤世帝科學(xué)儀器公司。ADP(北京中勤世帝科學(xué)儀器公司，ADP粉劑1瓶，ADP緩沖液10mL/瓶) 。ELISA試劑盒：6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α，批號(hào)：SBJ-R0532)、血栓素(TXB2，批號(hào)：SBJ-R0548)均購自南京建成生物科技有限公司。

1.3藥品

茜草購自安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為茜草科植物茜草RubiacordifoliaL.的干燥根和根莖。茜草炭按2015年版《中華人民共和國藥典》(一部) 有關(guān)要求炒制而成。宮血寧膠囊(批號(hào)：Z20020087，云南白藥集團(tuán)股份有限公司)；戊酸雌二醇片(批號(hào)：ZBA1501，DELPHARM Lille S.A.S)。羥基茜草素(批號(hào)：81549，南京森貝伽科技技術(shù)有限公司)，大葉茜草素(批號(hào)：110884-200604，中國食品藥品檢定研究院)，茜草素(批號(hào)：A0317926，賽默飛世爾科技公司)，異茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、1-羥基-2-甲基蒽醌均為自制，經(jīng)HPLC 檢測(cè)純度>98%。

1.4動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠，4周齡，體重70g左右，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0001。

2 方法

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 精密稱取對(duì)照品茜草素、羥基茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、甲基異茜草素、1-羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素適量，加甲醇溶解，制成異茜草素、羥基茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、甲基異茜草素、1-羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素質(zhì)量濃度分別為50.07、34.40、34.22、32.69、33.16、53.62mg·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2供試品溶液 茜草炭各極性提取物：取茜草炭500g，加10倍量95%乙醇加熱回流提取兩次，每次2h，殘?jiān)?0倍量水加熱回流提取2次，每次2h，合并四次濾液濃縮，將濃縮液依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等倍萃取10次，回收各溶劑，減壓干燥至恒重，這4個(gè)部位的浸膏得率分別為石油醚提取物1.00%、乙酸乙酯提取物1.72%、正丁醇提取物2.09%、萃取剩余部位13.09%。臨用前以0.5%CMC-Na溶液將茜草4種極性部位研勻并稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

2.2色譜條件

色譜柱：AcquityBEHC18色譜柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL；檢測(cè)波長：296nm；流動(dòng)相：A為0.3%甲酸水，B為甲醇，(A∶B)0～4min(90∶10→65∶35)，4～9min(65∶35→40∶60)，9～15min(40∶60→30∶70)，15～20min(30∶70→10∶90)，20～22min(10∶90→90∶10)。

2.3子宮出血鼠模型的復(fù)制

將SD大鼠置于室溫(25±2) ℃、相對(duì)濕度(50±15)%的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，12h明暗交替，正常攝食飲水?？瞻捉M與模型組分別灌胃(ig)給予0.5%CMC-Na、戊酸雌二醇(2.5mg·kg-1)，連續(xù)灌胃3周，并于第三周連續(xù)鏡檢觀察模型組大鼠陰道脫落上皮細(xì)胞涂片，對(duì)角化率呈周期性變化的大鼠進(jìn)行剔除[8]。

2.4動(dòng)物分組及給藥

對(duì)在全周期(3周)持續(xù)外源性雌激素的干預(yù)后沒有性周期的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組和水提取物組[9]，空白組即為造模時(shí)的空白組?？瞻捉M與模型組灌胃給予0.5%CMC-Na，陽性組ig給予宮血寧0.156g·kg-1，石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組和萃取剩余部位組分別ig給予相應(yīng)的供試液(臨床給藥劑量為10g，取臨床劑量的2倍量，按照人體和大鼠等效劑量換算，茜草炭不同提取物給藥劑量均為含生藥量2.5g·kg-1)，根據(jù)文獻(xiàn)研究及前期工作發(fā)現(xiàn)此劑量為止血有效劑量[10]。連續(xù)給藥8d。

2.5指標(biāo)測(cè)定

第8天，各組正常給藥40min后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，1mL全血分裝測(cè)定全血高、中、低切黏度，剩余全血以800r·min-1離心10min，得富血小板血漿(PRP)，測(cè)定ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率；余血再以3000r·min-1離心10min，得貧血小板血獎(jiǎng)(PPP)，測(cè)定內(nèi)/外源性凝血功能指標(biāo)(TT，PT，APTT，F(xiàn)IB)，ELISA法測(cè)定TXB2、6-keto-PGF1 α。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1色譜比較

茜草炭各極性部位主要化學(xué)成分分別為：石油醚提取部位主要含有羥基茜草素和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌；乙酸乙酯提取部位主要含有茜草素、羥基茜草素、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌、甲基異茜草素和大葉茜草素；正丁醇提取部位主要含有羥基茜草素、大葉茜草素和1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌；萃取剩余部位主要含有羥基茜草素，從各成分含量上來看，蒽醌類成分主要集中在乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。茜草各對(duì)照品色譜圖見圖1，茜草各極性部位化學(xué)成分含量見表1。

注：1.茜草素；2.羥基茜草素；3.1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌；4.甲基異茜草素；5.1-羥基-2-甲基蒽醌；6.大葉茜草素。圖1 茜草各對(duì)照品色譜圖

化學(xué)成分含量(%)石油醚提取組乙酸乙酯提取組正丁醇提取組萃取剩余部位組茜草素0.0882±0.000260.2000±0.009200.0692±0.000620.0089±0.00030羥基茜草素0.5455±0.000422.3871±0.000500.3449±0.000400.1285±0.000571,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌0.1113±0.003061.1632±0.004140.2506±0.000210.0334±0.00031甲基異茜草素0.0977±0.000490.2039±0.000470.0135±0.000420.0014±0.000471-羥基-2-甲基蒽醌0.0896±0.000100.0717±0.00050大葉茜草素0.0019±0.000150.1013±0.000510.1836±0.00057

3.2對(duì)子宮臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組顯著降低臟器指數(shù)(P<0.01)。與模型組比較，陽性組、石油醚提取物組、乙酸乙酯提取物組以及正丁醇提取物組均顯著升高模型大鼠的臟器指數(shù)(P<0.05或P<0.01)，萃取剩余部位組具有升高臟器指數(shù)的趨勢(shì)，但作用不顯著。其中乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組影響最顯著，石油醚提取物組作用次之。結(jié)果見表2。

表2 茜草炭不同極性部位對(duì)臟器指數(shù)的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P< 0.05，△△P<0.01；下同。

3.3對(duì)血液流變性的影響

與空白組比較，模型組全血高、中、低切黏度均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性組和乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組均可以升高模型組大鼠高、中、低切黏度(P<0.05，P<0.01)；茜草炭萃取剩余部位組可顯著升高模型大鼠的高、中切黏度(P<0.05)，有升高低切黏度的趨勢(shì)；茜草炭石油醚提取物組有升高模型大鼠高、中、低切黏度趨勢(shì)，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表3。

3.4對(duì)凝血四項(xiàng)的影響

與空白組比較，模型組可顯著延長TT、PT、APTT，增加FIB含量(P<0.01)。與模型組比較，陽性組顯著縮短TT、PT、APTT，降低FIB含量(P<0.05或P<0.01)；茜草炭乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組可顯著縮短TT、PT、APTT，降低FIB含量(P<0.05或P<0.01)，茜草炭石油醚提取物組可顯著縮短APTT(P<0.05)，水提取物組可以顯著降低TT和FIB(P<0.05或P<0.01)，茜草炭石油醚提取物組和萃取剩余部位組有縮短PT、降低FIB含量的趨勢(shì)，但是作用不顯著。結(jié)果見表4。

表3 茜草炭不同極性部位對(duì)子宮出血模型大鼠血液流變性的影響

表4 茜草炭不同極性部位對(duì)子宮出血模型大鼠TT、PT、APTT、FIB 的影響

3.5對(duì)血小板功能的影響

與空白組比較，模型組顯著升高6-keto-PGF1α的含量(P<0.01)，降低TXB2含量和ADP%(P<0.01)，顯著升高6-keto-PGF1α/TXB2的比值(P<0.01)。與模型組比較，陽性組可顯著降低6-keto-PGF1α含量和6-keto-PGF1α/TXB2的比值以及增加ADP%(P<0.01)，顯著升高TXB2含量(P<0.05)；茜草炭乙酸乙酯提取物組、正丁醇提取物組和萃取剩余部位組可顯著降低6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量(P<0.01)；石油醚提取物組有降低6-keto-PGF1α和6-keto-PGF1α/TXB2含量的趨勢(shì)，作用不顯著；茜草炭乙酸乙酯提取物組和正丁醇提取物組顯著升高TXB2含量(P<0.05)，茜草炭石油醚提取物組和萃取剩余部位組有升高TXB2的作用；茜草炭乙酸乙酯組和正丁醇組能顯著增加ADP%(P<0.05)，茜草炭石油醚組和萃取剩余部位組有增加ADP%的趨勢(shì)，但效果不顯著。見表5。

表5 茜草炭不同極性部位對(duì)子宮出血模型大鼠TXB2、6-keto-PGF1α和 ADP%的影響

4 討論

子宮內(nèi)膜是對(duì)雌性激素最敏感的效應(yīng)組織，未成年雌性大鼠在單一雌激素持續(xù)干預(yù)下使子宮蛋白質(zhì)合成增加，子宮內(nèi)膜增生，血管、間質(zhì)、腺體發(fā)育不同步，內(nèi)膜厚而不牢固，且不斷增厚的子宮內(nèi)膜對(duì)雌激素的需求也持續(xù)增加。當(dāng)雌激素極速下降時(shí)發(fā)生雌激素撤退性出血，伴隨纖維結(jié)締組織增生，間質(zhì)血管擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤及子宮臟器系數(shù)下降[11-13]。且雌激素通過雌激素受體(ER)介導(dǎo)cAMP途徑阻止細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，并通過刺激血小板腺苷酸環(huán)化酶對(duì)血小板有解聚作用。天然雌激素戊酸雌二醇比傳統(tǒng)雌激素更具有生物利用度高、治療效果好、毒副作用輕、患者依從性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)將戊酸雌二醇用作造子宮出血模型的藥物。實(shí)驗(yàn)中持續(xù)的戊酸雌二醇刺激而無孕激素對(duì)抗可造成大鼠血液黏稠度降低，血小板聚集率降低，凝血系統(tǒng)障礙，子宮內(nèi)膜增厚，腺體密集，大量炎性細(xì)胞出現(xiàn)，伴有出血傾向，與文獻(xiàn)中雌激素造子宮出血模型癥狀相符。茜草具有涼血止血、活血化瘀之功效，宮血寧膠囊為理血?jiǎng)?，具有涼血止血、清熱除濕、化瘀止痛的功效，宮血寧膠囊主要原料為重樓[14]，重樓皂苷通過促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集作用，縮短出血和凝血時(shí)間而達(dá)到明顯的止血效果[15]，與茜草止血途徑類似。宮血寧膠囊還具有降低子宮出血量及縮短子宮出血時(shí)間等藥理作用[16]，且臨床研究表明[17]，患者口服宮血寧后均未發(fā)現(xiàn)任何毒副作用，故此實(shí)驗(yàn)選擇宮血寧膠囊作為陽性藥。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茜草炭用藥劑量為2.5g·kg-1時(shí)(即臨床兩倍量，按照大鼠和人等效劑量換算的劑量)，對(duì)出血模型大鼠具有良好的止血作用，故本實(shí)驗(yàn)用此劑量[10]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均可不同程度地改善子宮出血模型大鼠全血低黏狀態(tài)、縮短TT、PT、APTT，降低FIB含量，通過影響內(nèi)、外源性凝血途徑達(dá)到止血作用。茜草炭各極性提取物均能提高ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率，其中茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物作用顯著。6-keto-PGF1α由血小板釋放，具有舒張血管和抑制血小板聚集作用，TXB2是6-keto-PGF1α的抑制物，具有收縮血管和促進(jìn)血小板聚集作用。茜草炭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物均可以顯著調(diào)節(jié)TXB2、6-keto-PGF1α使其達(dá)到平衡，增加大鼠血小板聚集率。綜上茜草炭乙酸乙酯部位和正丁醇部位為其止血作用的功效部位，推測(cè)其止血作用的作用機(jī)制一方面通過降低全血黏度改善凝血系統(tǒng)障礙；另一方面減輕子宮內(nèi)膜增厚，減少炎性細(xì)胞產(chǎn)生和間質(zhì)充血現(xiàn)象，從而緩解組織形態(tài)學(xué)的破壞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道羥基茜草素具有抑制血漿透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(PHBP)對(duì)凝血因子Ⅶ的激活作用[18]，是PHBP的特異性抑制劑。大葉茜草素對(duì)膠原誘導(dǎo)的兔血小板與花生四烯酸(AA)聚集有明顯的抑制作用，且對(duì)血小板激活因子誘導(dǎo)的聚集也有一定的抑制作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)異茜草素在茜草生品中含量極微，炮制成茜草炭以后，異茜草素含量增加，并且止血作用增強(qiáng)[20]。異茜草素有明顯縮短小鼠凝血時(shí)間的作用，是茜草炭主要止血成分之一[21]。茜草炭中的蒽醌類成分主要集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位，推測(cè)乙酸乙酯部位和正丁醇部位的止血活性功效可能與羥基茜草素、大葉茜草素及異茜草素等蒽醌類成分有關(guān)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)與茜草炭止血相關(guān)物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯和正丁醇提取物，主要通過影響內(nèi)/外源性凝血系統(tǒng)、血小板系統(tǒng)、血液流變學(xué)等途徑發(fā)揮止血作用，為茜草炭臨床應(yīng)用和進(jìn)一步的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

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StudyonActivePartsfromRubiaeRadixetRhizoma(carbonized)inRatswithEstradiolInducedBleedingTendency

XUELu，WANGHaili，XIAOLinyan，CHENYi，SHANMingqiu，ZHANGLi，DINGAnwei

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To discuss the hemostasis of the different polarities of Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized) on the dysfunctional uterine bleeding rat model.Methods：The SD rats were divided into seven groups.The rats in the control group were fed with CMC-Na for 3 weeks，the other groups were fed with estradiol valerate for 3 weeks.Gong Xue Ning was taken as the positive control drug.The rats in the control group and model group were fed with CMC-Na for 7 days，and the rats in other groups were fed with corresponding drugs simultaneously.The influence of the different polarities of carbonizedRubiacordifoliacompound to dyfunctional uterine bleeding (DUB) rat's hemorheology，coagulation system，fibrinolytic system，tissue morphology and platelet system.Results：Compared with the control group，the model group could reduce the whole b--lood viscosity in each shear rate (P<0.01) and prolong the TT，PT，APTT (P<0.05，P<0.01)，increase the FIB，6-keto-PGF1αcontent and ADP%(P<0.01)，and decrease the TXB2.Compared with the model group，ethyl acetate and butanol extract group could increase the whole b--lood viscosity in each shear rates (P<0.05，P<0.01)，shorten the TT，PT，APTT (P<0.05，P<0.01)，decrease the content of FIB，6-keto-PGF1αand ADP% (P<0.05，P<0.01)，and increase the TXB2，while petroleum ether and water extract groups gave no significant effect.Conclusion：Ethyl acetate extract is the active part of Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized)，showing the effect of hemostasis by reducing the low whole blood viscosity，improving coagulation function mainly and ameliorating the function of platelet aggregation.

Rubiae Radix et Rhizoma (carbonized)，hemostasis，dysfunctional uterine bleeding，active parts

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.007

2016-04-21)

國家自然科學(xué)基金(81473348)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2014)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A070)

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丁安偉，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與創(chuàng)新藥物；Tel：(025)85811523，E-mail：awding105@163.com