劉思婷，單鳴秋，郭舒臣，錢(qián)巖，張麗

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

HPLC法測(cè)定市售天麻飲片中6種活性成分的含量△

劉思婷1，2，單鳴秋1*，郭舒臣1，錢(qián)巖1，張麗1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院，江蘇 南京210008)

目的：采用HPLC法同時(shí)測(cè)定天麻飲片中天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C等6種成分的含量。方法：采用Agilent1220型高效液相色譜儀；HypersilC18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相為0.5%醋酸水溶液(A)-0.5%醋酸甲醇溶液(B)，洗脫梯度：0～10min，98%A，10～60min，98%～60%A，60～75min，60%A；體積流量為0.8mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為270nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：6種成分線性關(guān)系良好(r≥0.9993)；平均加樣回收率在96.99%～101.73%，RSD<2.5%。29批天麻飲片的測(cè)定結(jié)果表明，云南與四川地區(qū)天麻素含量最高。6種成分因地區(qū)不同，含量有所差異，其中巴利森苷A類(lèi)含量最高，對(duì)羥基苯甲醇和香莢蘭醇含量較低。結(jié)論：建立的方法快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠，能更全面、有效地對(duì)天麻飲片進(jìn)行質(zhì)量控制。

天麻；高效液相色譜；含量測(cè)定；質(zhì)量控制

天麻Gastrodiaelata又名赤箭、離母、定風(fēng)草、明天麻等，為蘭科天麻屬植物[1]。立冬后至次年清明前采挖(以冬麻為好)，干燥塊莖入藥，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材。天麻早在二千多年前就已入藥，以云南昭通產(chǎn)者為優(yōu)。其性甘、平，歸肝經(jīng)[2]，有抗癲癇、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、平肝息風(fēng)的功能。臨床應(yīng)用證明，其對(duì)血管性神經(jīng)性頭痛、腦震蕩后遺癥等有顯著療效[3-4]。

天麻中含量較高的成分是天麻苷(gastrodin)，也稱(chēng)天麻素，其化學(xué)名稱(chēng)為對(duì)羥甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-hydroxymethylphenyl-β-D-glucopyranoside)。現(xiàn)代藥理研究證明，其與天麻具有相似的藥理作用，被認(rèn)為是天麻的主要活性成分[5-8]。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》以按干燥品計(jì)算，含天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的總量不得低于0.25%[9]作為質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)。雖然新版中華人民共和國(guó)藥典較2010版增加了對(duì)羥基苯甲醇的測(cè)定，但是仍有較多文獻(xiàn)指出，天麻中所含香莢蘭醇及巴利森苷類(lèi)成分也具有較強(qiáng)的生理活性，尤其是巴利森苷類(lèi)在天麻中含量超過(guò)了天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的含量[10-15]。因此，采用天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的含量測(cè)定作為天麻質(zhì)量控制的方法不能全面、客觀地反映天麻的整體內(nèi)在質(zhì)量。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)于天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量測(cè)定已有不少報(bào)道[13-15]，但大多局限于其中一種或幾種成分的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定這6種成分的報(bào)道較為少見(jiàn)。本研究采用HPLC法測(cè)定搜集于不同產(chǎn)地、不同藥店的市售天麻飲片中這6種成分的含量，以期更全面、更有效地評(píng)價(jià)天麻飲片的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1儀器

ShimadzuLibrorael-40SM型電子分析天平(精確至0.01mg)；Agilent1220型高效液相色譜儀。

對(duì)照品天麻素、香莢蘭醇(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)分別為00256-2013，01083-2013)；對(duì)羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C(南京金益柏科技有限公司，批號(hào)分別為2014-0192，2014-0078，2014-0079，2014-0080)；甲醇為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

1.2材料

共收集29批天麻飲片(編號(hào)為S1～S29)，其產(chǎn)地、批號(hào)見(jiàn)表1，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為蘭科天麻屬植物天麻GastrdiaelataB1.的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：HypersilC18(250mm×4.6mm，5μm)；

表1 天麻樣品編號(hào)

流動(dòng)相：0.5%醋酸水溶液(A)-0.5%醋酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0→10 min，98%A，10→60 min，98%→60%A，60→75 min，60%A；體積流量：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，加甲醇-水(3∶97)溶液制成含天麻素(0.603mg·mL-1)、對(duì)羥基苯甲醇(0.092mg·mL-1)、香莢蘭醇(0.154mg·mL-1)、巴利森苷A(1.556mg·mL-1)、巴利森苷B(0.956mg·mL-1)、巴利森苷C(0.446mg·mL-1)的混合對(duì)照品溶液。對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.天麻素；2.對(duì)羥基苯甲醇；3.香莢蘭醇；4.巴利森苷C；5.巴利森苷B；6.巴利森苷A。圖1 對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定本品粉末2g，放入具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50mL，振搖2h，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流3h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液10mL，濃縮至近干，殘?jiān)蛹状?水(3∶97)混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中。用甲醇-水(3∶97)混合溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系 精密量取混合對(duì)照品溶液5mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度。用倍比稀釋法以甲醇-水(3∶97)混合溶液制成系列對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，測(cè)定峰面積。以峰面積平均值(Y)與質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 6種成分的回歸方程

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為S9的天麻樣品制成的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄各峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的峰面積的RSD分別為2.35%、2.79%、1.45%、2.96%、2.34%和0.75%，表明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為S9的天麻樣品制成的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0、1、2、4、6、9、12、18 h各進(jìn)樣一次，共8次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄各峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的峰面積的RSD分別為1.98%、2.15%、3.52%、2.81%、1.99%和2.21%，表明供試品溶液中6種成分在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取編號(hào)為S9的天麻樣品，每份1 g，共6份，精密加入混合對(duì)照品溶液2 mL(每mL含天麻素2.286 mg、對(duì)羥基苯甲醇0.361 mg、香莢蘭醇0.728 mg、巴利森苷A 6.127 mg、巴利森苷B 2.619 mg、巴利森苷C 1.003 mg)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算6份樣品中6種成分的平均加樣回收率和RSD。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6種成分的加樣回收率試驗(yàn)

2.4樣品含量測(cè)定

取29批天麻樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，用外標(biāo)法計(jì)算其中的天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、香莢蘭醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 29批飲片中6種成分的含量 /mg·g-1

3 討論

結(jié)果顯示，29批天麻飲片中所含6種成分含量差異較大，同一產(chǎn)地飲片中的同一成分的含量相差數(shù)倍。分析其原因可能有以下幾種：1)地域差異，不同地域的氣候、土壤、海拔、光照、溫度、濕度均不相同，會(huì)對(duì)藥材生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不同的影響；2)種植技術(shù)，現(xiàn)有的天麻種植技術(shù)大致可分為野生和人工栽培兩種。很多文獻(xiàn)都提到不同的種植技術(shù)會(huì)對(duì)天麻的質(zhì)量產(chǎn)生影響[14]，所以同一產(chǎn)地的飲片可能因?yàn)榉N植技術(shù)不同而產(chǎn)生較大差異。例如S11與S25兩批飲片為野生天麻，該兩批飲片的6種成分的含量明顯高于同地區(qū)其他飲片；3)產(chǎn)地加工方法差異，不同產(chǎn)地對(duì)中藥材采摘后的加工處理方式不同，有的地區(qū)采用蒸的方法，有的采用煮的方法，還有的采用硫磺熏蒸的方式[15]；4)炮制工藝差異，不同地區(qū)、不同飲片廠的炮制工藝和炮制設(shè)備不同，會(huì)對(duì)飲片中各種成分的含量產(chǎn)生影響[16]。

在本試驗(yàn)的29批飲片中，除少數(shù)幾批外，大部分天麻飲片均高于《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)(2015版一部按干燥品計(jì)算，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總量不得少于0.25%)，說(shuō)明藥材質(zhì)量較好。云南、四川地區(qū)天麻飲片中所含6種成分的含量均較高，甚至有兩批天麻素含量高于0.7%，巴利森苷A含量高于1.2%。其中云南地區(qū)天麻飲片中6種成分的含量較為穩(wěn)定，而安徽地區(qū)差異較大。原因可能是云南產(chǎn)區(qū)較近湖南產(chǎn)區(qū)，隨著湖南產(chǎn)區(qū)種植規(guī)模的擴(kuò)大，所產(chǎn)的藥材質(zhì)量也較好[17]。

觀察天麻飲片中活性成分的含量趨勢(shì)可知，天麻飲片中巴利森苷類(lèi)成分含量最高，按照其含量高低排序?yàn)榘屠誂>巴利森苷B>巴利森苷C，天麻素含量次之，對(duì)羥基苯甲醇與香莢蘭醇的含量最低。同時(shí)，除少數(shù)幾批天麻飲片中天麻素含量低、巴利森苷類(lèi)成分含量較高外，大部分同一產(chǎn)地的飲片中天麻素含量越高，巴利森苷類(lèi)成分的含量越高。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上觀察，巴利森苷A、B、C均為天麻素和檸檬酸結(jié)合而成的酯類(lèi)[15]。由此說(shuō)明，巴利森苷類(lèi)成分可能與天麻素存在相互依存或內(nèi)在轉(zhuǎn)化的關(guān)系。因此還需進(jìn)一步探索巴利森苷類(lèi)成分對(duì)天麻藥效的貢獻(xiàn)，以及與天麻素之間的依存或轉(zhuǎn)化的關(guān)系，為建立更加全面、更有效的天麻質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

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Determinationof6ActiveComponentsinCommerciallyAvailableGastrodiaeRhizomabyHPLC

LIUSiting1，2，SHANMingqiu1*，GUOShuchen1，QIANYan1，ZHANGLi1

(1.CooperativeInnovationCenterofChineseMedicineResourceIndustrializationofNanjingUniversityofChineseMedicine，JiangsuNanjing210023，China；2.NanjingChildren'sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity，JiangsuNanjing210008，China)

Objective：To determine6active components (gastrodin，4-hydroxybenzyl alcohol，vanillyl alcohol，parishin A，parishin B，parishin C) ofGastrodiaeRhizomaby HPLC.Methods：The separation was carried out by an Hypersil C18column (250mm×4.6，5μm) in a mobile phase consisting of0.5%CH3COOH-H2O(A) and0.5%CH3COOH-CH3OH(B) with a gradient elution system (0→10min，98%A；10→60min，98%→60%A；and60→75min，60%A).Detection wavelength was set at270nm and column temperature was30℃.Injection volume was20μL.Results：The six components had good linearity (r≥0.9993).The average recovery rates were96.99%～101.73% with RSD<2.5%.Gastrodiae Rhizoma of29different batches was determined，in which Gastrodiae Rhizoma from Yunnan and Sichuan areas had the highest content of gastrodin.The contents of6components in Gastrodiae Rhizoma varied in different areas.The contents of parishin A was the highest while the contents of4-hydroxybenzyl alcohol and vanillyl alcohol were lower.Conclusion：The method is rapid，simple，accurate and can be used to control quality of Gastrodiae Rhizoma in a more comprehensive and effective way.

Gastrodiae Rhizoma；HPLC；determination；quality control

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.9.027

2016-03-07)

江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(ZDXM-1-3)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)

*

單鳴秋，副教授，博士，研究方向：中藥炮制及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；Tel：(025)85811519，E-mail：shanmingqiu@163.com