鐘婷，薛變變，王增艷，王瑩，劉春禹，于靜華，胡冬華*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)教研室，吉林 長春 130000；2.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春 130000；3.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春 130000；4.長春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院 針灸科，吉林 長春 130000；5.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 艾滋病與病毒研究所，吉林 長春 130000)

土槿皮乙酸抗肝癌機(jī)制研究△

鐘婷1，薛變變2，王增艷3，王瑩2，劉春禹4，于靜華5*，胡冬華1*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 藥物化學(xué)教研室，吉林 長春 130000；2.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春 130000；3.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長春 130000；4.長春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院 針灸科，吉林 長春 130000；5.吉林大學(xué) 白求恩第一醫(yī)院 艾滋病與病毒研究所，吉林 長春 130000)

目的：在細(xì)胞水平研究土槿皮乙酸(PAB)抗人肝癌細(xì)胞(HepG2)的機(jī)制。方法：以4 μmol·L-1PAB分別處理12、24、36、48 h后，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法確定PAB的抑制率；通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察確定PAB是否誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；劃痕實(shí)驗(yàn)觀察PAB對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響；熒光染色法檢測(cè)PAB處理后HepG2細(xì)胞中微管聚集情況；Real-time PCR檢測(cè)PAB對(duì)P53基因轉(zhuǎn)錄的影響；Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：PAB時(shí)間依賴性地抑制HepG2 細(xì)胞的生長，并且誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的死亡；有效降低肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白聚集；降低P53基因轉(zhuǎn)錄，并調(diào)控P53蛋白和P27蛋白表達(dá)。結(jié)論：PAB對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2 細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，并且通過調(diào)控微管分布來抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

土槿皮乙酸；人肝癌HepG2細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞轉(zhuǎn)移

據(jù)報(bào)道，肝癌容易復(fù)發(fā)并且轉(zhuǎn)移率高。目前，臨床上抗肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的治療措施主要有放射介入、全身化療，由于患者大多有慢性肝病背景，任何一種放療、化療方案都伴有明顯的不良反應(yīng)。所以中藥在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、穩(wěn)定瘤體生長、改善癥狀體征、減毒增效、預(yù)防復(fù)發(fā)、提高生存質(zhì)量、延長生存期等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

土槿皮為松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮，土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B，PAB)是從土槿皮中分離得到的新型二萜酸化合物。有研究表明土槿皮乙酸具有抗腫瘤[1-4]、抗血管生成[5]、抗微管[6-7]等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)探討土槿皮乙酸的抗肝癌作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

土槿皮乙酸(PAB)購于中國食品藥品檢定研究院，應(yīng)用時(shí)用二甲基亞砜(DMSO)溶解，并使DMSO的終濃度低于0.01%。胎牛血清購自北京元亨圣馬生物試劑公司；DAPI、Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate、二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol reagent和Glycogen為Invitrogen公司產(chǎn)品；Anchored Oligo(dT)18、2×ES Reaction Mix、RNase-free Water為北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司產(chǎn)品；SYBR GREEN(ABI，USA)為ABI公司產(chǎn)品；Histone、P53、Tubulin、P27抗體及相應(yīng)的二抗購自Santa Cruz Biotec公司(CA，USA)；DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific，USA)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞單層接種在含10%胎牛血清和4.0 mmol·L-1谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞生長的抑制

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中。隨機(jī)分為用藥組和對(duì)照組，用藥組培養(yǎng)液中分別加入用DMSO溶解的4 μmol·L-1PAB，對(duì)照組(Con)培養(yǎng)液中加入與治療組等量的DMSO，再分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后，用臺(tái)盼蘭染色后立即對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，至細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期后，加入4 μmol·L-1PAB，培養(yǎng)12、24、36、48 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

2.3 細(xì)胞骨架的變化

對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)，然后換為終濃度為4 μmol·L-1的PAB培養(yǎng)液培養(yǎng)，并設(shè)對(duì)照，置CO2培養(yǎng)箱中分別孵育12、24、36、48 h后，將爬片好的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，PBS洗5 min，0.8% TritonX-100穿孔15 min，PBS洗兩次，加入5 μg·mL-1的Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞骨架染色40 min，PBS漂洗多次，每次5 min，DAPI染色15 min，封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架的變化。

2.4 Real-time PCR

收集PAB(4 μmol·L-1)處理12、24、36、48 h后的PAB組和對(duì)照組細(xì)胞，取200 μL樣品到1.5 mL離心管中，加入1 mL Trizol，用手振搖15 s，再在室溫加入200 μL三氯甲烷，靜置5 min后，12 000 g、4 ℃離心17 min，離心取上層水相(勿混中層沉淀)，加入新離心管中(事先加入1 μL Glycogen)，再加入0.5 mL異丙醇(4 ℃預(yù)冷)，搖勻，-20℃靜置30 min，12 000 g、4 ℃離心10 min，棄上清液，加入4 ℃預(yù)冷的75%乙醇水溶液1 mL，7500 g、4 ℃離心5 min，棄上清液，待完全干燥10 min后加入30 μL DEPC水溶解得到mRNA產(chǎn)物。再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書對(duì)以上所得的mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系的總體積為20 μL，體系的反應(yīng)條件為42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 min失活。最后根據(jù)所得的產(chǎn)物CDNA進(jìn)行定量PCR，體系的總體積為20 μL，每個(gè)樣均重復(fù)3次。以上操作過程中所加試劑及模板的量均是一致的。P53基因的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度見表1，反應(yīng)中GAPDH作為內(nèi)部參照。

表1 基因的引物序列度和產(chǎn)物長度

2.5 檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

以PAB濃度為4 μmol·L-1分別處理細(xì)胞12、24、36、48 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，置于冰上；加入細(xì)胞裂解液及蛋白酶抑制劑混合液，吹打均勻，冰上放置5 min，加入上樣5×樣品緩沖液混勻后于沸水浴中煮沸1 h。再14 000 r·min-1、離心5 min后又混勻，上樣，用western blot法檢測(cè)目標(biāo)蛋白。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

如無特殊提示，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得自3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 PAB抑制HepG2細(xì)胞增殖

PAB(4 μmol·L-1)作用細(xì)胞12、24、36、48 h后，對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用呈明顯的時(shí)間依賴性(圖1 A、B)。

注：A.細(xì)胞抑制率；B.細(xì)胞數(shù)目。圖1 PAB抑制HepG2細(xì)胞增殖圖

3.2 PAB對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

PAB(4 μmol·L-1)處理細(xì)胞以后，觀察到正常對(duì)照組(Con)細(xì)胞形態(tài)正常完整，細(xì)胞連接緊密，有較少數(shù)細(xì)胞死亡；而PAB組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，浮起變圓，出現(xiàn)細(xì)胞死亡，見圖2。

注：Bar=15 μm。圖2 PAB對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響

3.3 PAB抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

PAB作用12、24、36、48 h 后，對(duì)照組細(xì)胞間劃痕隨著時(shí)間的遷移消失，而PAB組劃痕依然存在。所以PAB抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移，見圖3。

注：?表示劃痕寬度。圖3 PAB抑制HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況

3.4 PAB對(duì)肝癌細(xì)胞Tubulin的影響

對(duì)照組細(xì)胞生長密集，細(xì)胞呈梭形、三角形、或不規(guī)則形；胞核圓形或橢圓形、核膜完整、界限清晰；胞質(zhì)密度高、不透明、胞膜連續(xù)；紅色的微管蛋白均勻分布。而經(jīng)PAB處理后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞稀疏、形態(tài)不規(guī)則；微管蛋白(紅色熒光)聚集在胞核周，并聚集成束狀，而細(xì)胞周的微管蛋白表達(dá)顯少(熒光淡)、透明度高。從DAPI細(xì)胞核染色可明顯看到，與對(duì)照組相比，PAB處理后實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞出現(xiàn)了較多的雙核、甚至多核細(xì)胞，見圖4。

圖4 PAB對(duì)微管的影響

3.5 PAB對(duì)P53基因轉(zhuǎn)錄的影響

在PAB處理12、24、48 h時(shí)，4 μmol·L-1PAB上調(diào)P53基因的mRNA水平，但在36 h與對(duì)照組比較，PAB下調(diào)P53基因的mRNA水平，見圖5。

注：* P<0.05，**P<0.01。圖5 PAB對(duì)P53基因轉(zhuǎn)錄的影響

3.6 PAB對(duì)P53蛋白表達(dá)的影響

從蛋白表達(dá)可以看到，4 μmol·L-1PAB分別作用不同時(shí)間以后，相比于對(duì)照組，細(xì)胞中的P53的表達(dá)在12、24、36 h減少，但在48 h時(shí)，其蛋白表達(dá)量明顯增加。P27是P53蛋白下游蛋白，其與P53蛋白具有相同的趨勢(shì)，見圖6。

圖6 PAB處理HepG2細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)P53和P27蛋白的表達(dá)情況

4 討論

迄今為止，對(duì)PAB抗腫瘤機(jī)制的研究已有了很大的進(jìn)展，但對(duì)其抗腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的研究較少，導(dǎo)致其還未應(yīng)用于臨床。因此，本課題對(duì)PAB抑制腫瘤增殖、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討，這將為開發(fā)PAB為抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。

4.1 PAB抑制HepG2細(xì)胞的生長

惡性腫瘤具有無限增殖生長的特征，抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖，一方面可以抑制其生長進(jìn)程，另一方面也有效地抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移(腫瘤細(xì)胞生長到一定大小后開始轉(zhuǎn)移)[8]。從細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)PAB有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長，其抑制率最高達(dá)到了95%。在PAB作用期間，對(duì)照組細(xì)胞迅速生長，而PAB處理組細(xì)胞數(shù)目隨著處理時(shí)間的延長而減少，說明在PAB處理過程中有細(xì)胞的死亡，而無限增殖則說明肝癌的惡性度很高。為了驗(yàn)證PAB促進(jìn)細(xì)胞死亡這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)從12 h 開始，PAB處理組細(xì)胞浮起變圓并開始死亡。所以PAB通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡執(zhí)行腫瘤抑制作用。

4.2 PAB抑制HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)移

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移后會(huì)出現(xiàn)癌癥細(xì)胞擴(kuò)散的現(xiàn)象，本來可以手術(shù)切除的腫瘤組織，卻因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而無法完成，所以在評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物的時(shí)候，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是非常重要的指標(biāo)[8-9]。我們研究發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，而PAB可以有效抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，說明PAB除了通過抑制細(xì)胞增殖來抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移外，還可以直接抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而肝癌的迅速轉(zhuǎn)移進(jìn)一步證明肝癌惡性程度高。

4.3 PAB干預(yù)HepG2微管功能

微管蛋白是細(xì)胞的骨架蛋白，決定著細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等細(xì)胞機(jī)能。在發(fā)現(xiàn)PAB抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移后，我們進(jìn)一步探討了其對(duì)細(xì)胞微管蛋白的影響，以確定PAB通過干擾微管功能來影響細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)從12 h起，PAB處理的細(xì)胞，微管分布不均呈纖維狀分布，并且隨著時(shí)間的延長細(xì)胞核出現(xiàn)多核性，所以我們得到這樣的假說：PAB毒害了微管的功能，使其沒有力量來完成向兩極牽拉的細(xì)胞分裂功能來完成細(xì)胞分裂過程，進(jìn)而導(dǎo)致多核細(xì)胞的形成，這也是其抑制細(xì)胞增殖的原因。同時(shí)由于微管毒性作用，細(xì)胞微管也沒有足夠的能量來完成細(xì)胞移動(dòng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

4.4 PAB對(duì)P53基因轉(zhuǎn)錄及P53蛋白表達(dá)的調(diào)控

P53蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白，其參與細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方面。本課題觀察了PAB對(duì)其轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的影響來進(jìn)一步探討PAB作用機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)PAB處理后增加了P53基因的轉(zhuǎn)錄，盡管在36 h有所降低。而我們?cè)谟^察P53蛋白表達(dá)的時(shí)候卻發(fā)現(xiàn)在36 h前，PAB處理卻降低了P53蛋白的表達(dá)，在48 h時(shí)又增加P53蛋白表達(dá)。 同時(shí)我們觀測(cè)了P53下游蛋白P27的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)P27蛋白的表達(dá)趨勢(shì)和P53一致。所以我們推測(cè)PAB處理后，一致努力增加P53蛋白的表達(dá)，直到48 h時(shí)得以實(shí)現(xiàn)。而PAB處理后P53蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的不一致則說明了多個(gè)因素參與了P53蛋白的表達(dá)。PAB從多個(gè)角度執(zhí)行抗腫瘤作用，是潛在的抗肝癌藥物。

[1] Yu J H，Cui Q，Jiang Y Y，et al.Pseudolaric acid B induces apoptosis，senescence，and mitotic arrest in human breast cancer MCF-7[J].Acta Pharmacol Sin，2007，28(12)：1975-1983.

[2] 熊斌，雷志勇，陳虹，等.土槿乙酸衍生物PAB-D1誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡及其機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(7)：867-871.

[3] 段紹維，徐波，陳云利，等.高內(nèi)涵法探討土槿皮乙酸對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用的機(jī)制[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37(12)：1313-1322.

[4] Yu J H，Wang H J，Li X R，et al.Protein tyrosine kinase，JNK，and ERK involvement in pseudolaric acid B-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells[J].Acta Pharmacologic Sinica，2008，29(9)：1069-1076.

[5] 于靜華，張亞宏，劉春禹，等.土槿皮乙酸B增加活性氧水平誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和衰老的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(7)：63-65.

[6] Wong V K，Chiu P，Chung S S，et al.Pseudolaric acid B，a novel microtubule-destabilizing agent that circumvents multidrug resistance phenotype and exhibits antitumor activityinvivo[J].Clin Cancer Res，2005，11(16)：6002-6011.

[7] Tong Y G，Zhang X W，Geng M Y，et al.Pseudolarix acid B，a new tubulin-binding agent，inhibits angiogenesis by interacting with a novel binding site on tubulin[J].Mol Pharmacol，2006，69(4)：1226-1233.

[8] Martines C，Miroff G，Bittner J J.Effect of size and/or rate of growth of a transplantable mouse adenocarcinoma on lung；metastasis production[J].Cancer Res，1956，16(4)：313-315.

[9] Klekotka P A，Santoro S A，Wang H，et al.Specific residues within the alpha 2 integrin subunit cytoplasmic domain regulate migration and cell cycle progression via distinct MAPK pathways[J].J Biol Chem，2001，276：32353-32361.

Anti-tumorEffectofPseudolaricAcidBonHepatocellularCarcinomaHepG2CellLine

ZHONG Ting1，XUEBianbian2，WANGZengyan3，WANGYing2，LIUChunyu4，YUJinghua5*，HUDonghua1*

(1.MedicinalChemistry，CollegeofPharmacy，ChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China2.DepartmentofGastroenterology，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China3.DepartmentofInternalMedicine，TheFirstHospitalofJilinUniversity，Changchun130000，China4.Acupuncturedepartment，TheaffiliatedhospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China5.ResearchInstituteofvirologyandAIDSresearch，ThefirsthospitalofJilinUniversity，Changchun130021，China)

Objective：The aim of this study was to investigate the anti-tumour role of pseudolaric acid B(PAB)on hepatocellular carcinoma HepG2.Methods：Cell counting analysis confirmed the inhibitory ratio of PAB.The morphological changes were observed by phase contrast microscopy.Scratch test was applied for cell immigration.Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate staining was performed for tubulin polymerization.Real time PCR detected the p53 transcription.Western blot was used for protein expression.Results：The inhibitory role of PAB was in time dependent manner.PAB treatment induced the cell death.Cell immigration was inhibited by PAB treatment.Intervening α-tubulin polymerization was visualized after PAB treatment.Real-time PCR test confirmed that PAB treatment inhibited the transcription of p53 gene.And western blot analysis found that PAB regulated the expression of P53 and P27 protein.Conclusion：Therefore PAB had anti-tumor effect on HepG2 through various mechanisms.

Pseudolaric acid B(PAB)；hepatocellular carcinoma HepG2；cell proliferation；cell immigration

2015-04-21)

國家自然科學(xué)基金(81301416)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20140204004YY)；國家博士后基金(2014M561302)

*

胡冬華，副教授，研究方向：藥物化學(xué)和腫瘤分子藥理學(xué)，Tel：(0431)86045208，E-mail：hudonghua8888@126.com;于靜華，醫(yī)師，研究方向：腫瘤分子藥理學(xué)和病毒學(xué)，Tel：(0431)88783235，E-mail：yjh-0-2002@ 163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.2.005