王慧智，李會影，徐清雨，馬志*

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院 紅旗醫(yī)院 婦產(chǎn)科，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院 紅旗醫(yī)院 兒外科，黑龍江 牡丹江 157011)

·基礎(chǔ)研究·

紫草素抑制STAT3信號通路對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

王慧智1，李會影1，徐清雨2，馬志2*

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院 紅旗醫(yī)院 婦產(chǎn)科，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院 紅旗醫(yī)院 兒外科，黑龍江 牡丹江 157011)

目的：觀察紫草素抑制信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)信號通路對人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，探討其抗絨毛膜癌的可能機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)JEG-3細(xì)胞，加入0.2、0.4 μg·mL-1紫草素作為實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組加入等體積0.1%二甲基亞砜，甲氨蝶呤組(MTX組)作為陽性對照組加入2 μg·mL-1MTX。采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察紫草素對JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。采用免疫組織化學(xué)分析STAT3和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)陽性細(xì)胞的表達(dá)。進(jìn)一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達(dá)。結(jié)果：紫草素可顯著抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力(P<0.05或P<0.01)，降低STAT3和p-STAT3陽性細(xì)胞的表達(dá)以及STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：紫草素能明顯抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與抑制STAT3信號通路有關(guān)。

紫草素；遷移；侵襲；信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3信號通路

絨毛膜癌(choriocarcinoma)也稱絨毛膜上皮癌，簡稱絨癌，是一種來源于滋養(yǎng)細(xì)胞的高度惡性腫瘤，其特點(diǎn)是滋養(yǎng)細(xì)胞失去了原來的絨毛或葡萄胎的結(jié)構(gòu)，而散在地侵入子宮肌層，早期即可發(fā)生血道和淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者迅速死亡[1]。遷移和侵襲是絨毛膜癌的重要特征，是滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件[2]。所以，研究絨毛膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲機(jī)制必將為其治療指明新的方向。某些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲過程，可能參與了絨毛膜癌的發(fā)生和發(fā)展。信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)是 JAK-STAT信號通路中一種非常關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，是多種致癌信號通路的匯聚點(diǎn)。STAT3是公認(rèn)的癌基因，如乳腺癌、大腸癌等可表現(xiàn)為高表達(dá)[3-4]。有研究表明，紫草素可誘導(dǎo)人絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞凋亡[5]，但是其是否抑制JEG-3細(xì)胞的遷移和侵襲尚未見報道。本研究旨在探討紫草素對JEG-3細(xì)胞遷移、侵襲能力以及STAT3信號通路的影響，為明確紫草素抑制JEG-3細(xì)胞的遷移和侵襲提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，探討其可能的作用機(jī)制，為其開發(fā)應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株與試藥

人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3(中國科學(xué)院動物研究所計劃生育生殖生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)；DMEM培養(yǎng)液(美國HyClone公司)；甲氨蝶呤(MTX，美國輝瑞制藥有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、Hoechst33342(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；基質(zhì)膠Matrigel(美國BD公司)；STAT3鼠單克隆抗體和酪氨酸磷酸化STAT3(p-STAT3)鼠單克隆抗體(美國ProMab公司)；HRP標(biāo)記抗鼠IgG二抗(上海碧云天公司)；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Reverse Transcriptase kit promega，Japan)；其他試劑均為分析純。紫草素(北京市藥品檢驗(yàn)所，溶解于0.1%二甲基亞砜，配成0.4 μg·mL-1溶液，-20 ℃保存，臨用時，以DMEM培養(yǎng)液稀釋到所需濃度)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

JEG-3細(xì)胞保存在含有10%BSA的DMEM培養(yǎng)液(含2 mmol·L-1L-谷氨酰胺，1 mmol·L-1丙酮酸鈉和100 U·mL-1青霉素)，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。當(dāng)JEG-3細(xì)胞達(dá)80%匯合度時，用0.05%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化。37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)48 h。收集懸浮的細(xì)胞經(jīng)EDTA處理制備成單細(xì)胞懸液，然后用DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)

JEG-3細(xì)胞按照細(xì)胞密度5×104個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞單層生長鋪滿板底時，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部劃“一”字型劃痕，加入終濃度為0.2 μg·mL-1紫草素(低劑量組)，0.4 μg·mL-1紫草素(高劑量組)[6]，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，陽性對照組(MTX組)加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。倒置顯微鏡下檢測細(xì)胞向致傷區(qū)遷移的相對距離并拍照，計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率(%)=(1-藥物組細(xì)胞遷移面積/對照組細(xì)胞遷移面積)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值。

2.2 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室用前鋪上50 μL 0.5% Matrigel膜基質(zhì)37 ℃孵育過夜。JEG-3細(xì)胞加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。調(diào)整細(xì)胞密度5×104個細(xì)胞·mL-1，分別取200 μL接種于Transwell小室內(nèi)室，并在Transwell小室下室加入含有10% BSA的DMEM培養(yǎng)液。孵育24 h后，取出Transwell小室去除未穿膜細(xì)胞。甲醇固定15 min后，再以10 mg·mL-1Hoechst33342染色30 min[7]。OlympusIX51熒光顯微鏡計數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)。每組細(xì)胞隨機(jī)計數(shù)10個視野，取其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 免疫組織化學(xué)分析

JEG-3細(xì)胞胰蛋白酶消化、離心、500 μL DMEM培養(yǎng)液重懸。無菌乙醇洗滌，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下過夜培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼在蓋玻片上后更換新鮮培養(yǎng)液，加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)2 h。陰性對照組加入等體積0.1%DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。95%乙醇固定，中性樹膠粘到載玻片上，PBS洗滌3次，滴加一抗(陰性對照組以PBS代替一抗)，室溫培養(yǎng)3 h，PBS洗滌3次。滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫培養(yǎng)15 min，PBS洗滌3次。滴加DAB顯色劑初染，蘇木素復(fù)染，中性樹膠蓋玻片封片，倒置顯微鏡鏡檢。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：STAT3和p-STAT3蛋白陽性細(xì)胞均呈棕褐色陽性顆粒樣物質(zhì)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，胞核內(nèi)可有輕度黃染。每張圖片隨機(jī)選取10個高倍視野，Smart scape圖像分析系統(tǒng)對陽性染色細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行分析。

2.4 Real-Time PCR分析

JEG-3細(xì)胞加入終濃度為0.2、0.4 μg·mL-1紫草素，37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h。陰性對照組加入等體積0.1% DMSO，MTX組加入2 μg·mL-1MTX，其余條件與實(shí)驗(yàn)組完全一致。按照TRIzol試劑盒說明書抽提總RNA。Nanodrop2000檢測RNA純度。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)成單鏈的cDNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物。STAT3正向引物：5′-CAGACGGGCATTGTGGAT-3′，反向引物：5′-AGTCTTGGGCATGTCAGTGTG-3′，共224bp；p-STAT3正向引物：5′-TTGCCAGCACAAAGACACTCC-3′，反向引物：5′-CTCCAAAGCAAACCGAATACAG-3′，共135 bp；β-actin正向引物：5′-CCAGTATGATTCTA-CCCACGGC-3′，反向引物：5′-CGGAGATGATGACC-CTTTTGGC-3′，共227 bp。使用Quant SYBR Green PCR kit按照PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，用Applied Biosystems 7500型定量PCR儀測出ΔC值及熔解曲線，計算出相對基因表達(dá)量。每份樣品檢測3次。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陰性對照組可見JEG-3細(xì)胞遷移率明顯增高，而紫草素對JEG-3細(xì)胞遷移具有明顯抑制作用，并呈濃度依賴性，與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示紫草素可以抑制JEG-3細(xì)胞遷移能力。結(jié)果見圖1和圖2。

注：A.陰性對照組；B.低劑量組；C.高劑量組；D.MTX組。圖1 紫草素對JEG-3細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，下同。圖2 紫草素對JEG-3細(xì)胞細(xì)胞遷移率結(jié)果

3.2 Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

陰性對照組可見JEG-3細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多，而紫草素對JEG-3細(xì)胞侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)具有明顯抑制作用，并呈濃度依賴性，與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與MTX組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示紫草素可以抑制JEG-3細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果見圖3和圖4。

注：A.陰性對照組；B.低劑量組；C.高劑量組；D.MTX組。圖3 紫草素對JEG-3細(xì)胞Transwell小室體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)

圖4 紫草素對JEG-3細(xì)胞穿膜細(xì)胞個數(shù)結(jié)果

3.3免疫組織化學(xué)分析結(jié)果

陰性對照組表現(xiàn)STAT3和p-STAT3陽性細(xì)胞高表達(dá)，可見胞質(zhì)內(nèi)分布大量的濃密的棕褐色陽性顆粒，而紫草素可使STAT3和p-STAT3陽性細(xì)胞顯著減少，可見內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)棕褐色陽性顆粒減少，并且呈劑量依賴性。提示紫草素顯著減少STAT3和p-STAT3陽性細(xì)胞的高表達(dá)。結(jié)果見圖5。

注：A～D.STAT3免疫組織化學(xué)分析結(jié)果；E～F.p-STAT3免疫組織化學(xué)分析結(jié)果；A、E為陰性對照組；B、F為低劑量組；C、G為高劑量組；D、H為MTX組。圖5 STAT3和p-STAT3免疫組織化學(xué)分析結(jié)果(×400)

3.4 Real-Time PCR分析結(jié)果

陰性對照組可見STAT3mRNA和p-STAT3mRNA呈高表達(dá)，而紫草素可使STAT3mRNA和p-STAT3mRNA顯著降低，并且呈劑量依賴性，提示紫草素顯著減少STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達(dá)。結(jié)果見圖6。

圖6 STAT3 mRNA和p-STAT3 mRNA Real-Time PCR分析結(jié)果

4 討論

紫草素是從我國傳統(tǒng)中藥天山紫草根部提取出來的萘醌色素，具有抗炎、抑制脂肪形成、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等廣泛的藥理作用及生物學(xué)效應(yīng)[8]，其中抗腫瘤作用是目前研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。研究表明，紫草素對多種抗腫瘤增殖具有明顯的抑制作用，如對肝癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及絨毛膜癌等[9-12]。另有研究表明，紫草素還能夠抑制非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞SGC-7901的遷移和侵襲能力[13-14]。然而紫草素對JEG-3細(xì)胞是否具有抑制遷移和侵襲作用，目前尚不明確。本研究以不同終濃度紫草素作用于JEG-3細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫草素顯著抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力。此結(jié)果提示紫草素可作為抗絨毛膜癌的潛在性選擇藥物。

為了闡明紫草素抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的機(jī)制，本研究對STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行了分析?，F(xiàn)階段，STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的重要作用受到學(xué)者的高度重視。STAT3是人類惡性腫瘤中最常見且易被激活的STAT家族成員，主要介導(dǎo)細(xì)胞間或者細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是一個十分重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其在腫瘤發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)變中有重要的作用，在多種實(shí)體瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌和卵巢癌等中均有異常表達(dá)和活性增強(qiáng)，已經(jīng)成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[15-16]。當(dāng)STAT3被上游的JAK激活后，活化形成p-STAT3，隨后p-STAT3形成二聚體，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)與癌細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄活性[17]。Segatto等[18]報道，STAT3及其活化形式p-STAT3都會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。本研究免疫組織化學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素明顯減少STAT3和p-STAT3陽性細(xì)胞的表達(dá)，提示其可能是抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的機(jī)制。進(jìn)一步采用Real-Time PCR分析STAT3mRNA和p-STAT3mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素可抑制STAT3mRNA和p-STAT3mRNA的表達(dá)，結(jié)果與免疫組織化學(xué)分析相一致，進(jìn)一步證實(shí)紫草素抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力的機(jī)制可能與抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

綜上所述，紫草素抑制JEG-3細(xì)胞遷移和侵襲能力，抑制STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是其機(jī)制之一。

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EffectofShikoninonSuppressingMigrationgandInvationgofJEG-3CellsthroughInhibitingSTAT3SignalPathway

WANGHuizhi1，LIHuiying1，XUQingyu2，MAZhi2*

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China；2.DepartmentofPediatricsurgery，HongqiHospitalofMudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective：To investigate the effect of shikonin on suppressing migration and invation of JEG-3 cells through inhibiting signal transducer and activator of transcription-3(STAT3)signal pathway and discuss the possible mechanisms of anti-choriocarcinoma.Methods：JEG-3 cells were culturedinvitroand treated with shikonin at 0.2 μg·mL-1and 0.4 μg·mL-1concentrations as experimental group，the negative control group was treated with equal volume of 0.1% DMSO，MTX group(methotrexate group)was treated with 2 μg·mL-1MTX as positive control group.Wound healing assay and transwell chamber invasion assay were used to detect the effect of shikonin on migration and invasion of JEG-3 cells.Immunohistochemistry was used to detect the expression of STAT3and tyrosine phosphorylation STAT3(p-STAT3)positive cells.Real-Time PCR analysis was used to detect the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA.Results：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells(P<0.05 orP<0.01)，the expression of STAT3and p-STAT3positive cells and the expression of STAT3mRNA and p-STAT3mRNA were inhibited significantly(P<0.05 orP<0.01).Conclusion：Shikonin could inhibit migration and invasion of JEG-3 cells，the mechanism may be inhibition of STAT3signal pathway.

Shikonin；migration；invasion；Signal transducer and activator of transcription-3 signal pathway

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.006

2015-07-08)

*

馬志，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：兒科常見腫瘤的臨床治療；E-mail：mz13945307895@163.com