聶 健，楊水蓮，莫美華，胡智豪

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

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7種不同來(lái)源靈芝熱水提物體外抗氧化活性研究

聶 健，楊水蓮，莫美華*，胡智豪

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642)

[目的]比較不同地區(qū)靈芝熱水提物的體外抗氧化活性。[方法]分別從總還原力、清除羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和DPPH自由基4個(gè)方面對(duì)7種靈芝子實(shí)體熱水提物的體外抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。[結(jié)果]在相同濃度下，貓兒山野生靈芝熱水提物的總還原力最強(qiáng)，吸光度高達(dá)2.48；·OH清除能力最高，清除率99.46%；清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，清除率為96.62%；清除O2-·能力排第三。[結(jié)論]貓兒山野生靈芝熱水提取物在總還原力、清除·OH、DPPH自由基3個(gè)方面的抗氧化能力表現(xiàn)出最強(qiáng)，說(shuō)明貓兒山野生靈芝具有非常好的開(kāi)發(fā)潛力。

靈芝；體外；抗氧化性；熱水提取物；不同來(lái)源

靈芝Ganodermalucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst 是一種珍貴藥用真菌，屬于真菌界、真核真菌亞界、真菌門(mén)、擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、非褶菌目、靈芝菌科(Ganoderma taceae)、靈芝屬(Ganoderma)的大型真菌[1]。世界上靈芝科的種類(lèi)主要分布在亞洲、澳洲、非洲及美洲的熱帶和亞熱帶，少數(shù)分布于溫帶。地處北半球溫帶的歐洲僅有靈芝屬的 4 種，而北美洲大約 5 種[2]。我國(guó)地跨熱帶至寒溫帶，靈芝科種類(lèi)多而分布廣。國(guó)內(nèi)外大量的研究結(jié)果證明，靈芝具有較重要、廣泛的藥理作用且毒性極低，它具有抗細(xì)菌[3-4]、抗真菌[5]、抗病毒[6-7]、抗癌[8]等功效。靈芝的生物活性成分十分豐富，目前已從靈芝子實(shí)體、孢子和菌絲中分離到 300 多種化合物，可分為三萜類(lèi)、多糖類(lèi)、核苷類(lèi)、呋喃類(lèi)、生物堿類(lèi)、蛋白質(zhì)多肽類(lèi)、脂肪酸、糖蛋白、甾醇類(lèi)、有機(jī)鍺、礦質(zhì)元素等[9]。由于靈芝獨(dú)特的藥用價(jià)值，有關(guān)靈芝的栽培技術(shù)、有效成分的提取、分離、純化以及其生物學(xué)活性和藥理價(jià)值的研究已引起了國(guó)際上的廣泛關(guān)注[10-16]。

目前，研究表明人類(lèi)的許多慢性疾病和衰老現(xiàn)象均與人體內(nèi)的自由基水平失衡有關(guān)[17-19]。清除自由基等抗氧化研究越來(lái)越受到重視，除了維生素類(lèi)、氨基酸類(lèi)抗氧化劑之外，從植物、菌類(lèi)等生物來(lái)源的化合物中的天然抗氧化劑，由于其安全性高、無(wú)副作用而受到廣泛關(guān)注。但這類(lèi)天然化合物的提取過(guò)程復(fù)雜，多為純品，成本較高，如提取出靈芝中的多糖或三萜，而對(duì)于這類(lèi)生物粗提物的抗氧化作用研究較少[20]。筆者以不同地區(qū)的多種靈芝子實(shí)體(貓兒山野生靈芝、陽(yáng)江海靈芝、長(zhǎng)白山靈芝、方回春堂靈芝、泰山靈芝、黃山靈芝、日本靈芝)為材料，比較分析了它們的熱水提物的體外抗氧化活性，為不同靈芝的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為靈芝優(yōu)良菌種選育奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。陽(yáng)江海靈芝，采于廣東省陽(yáng)江市閘坡，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室馴化栽培；貓兒山野生靈芝，采自廣西貓兒山國(guó)家自然資源保護(hù)區(qū)；長(zhǎng)白山靈芝，采自吉林長(zhǎng)白山；泰山靈芝，采自山東泰山；黃山靈芝，采自黃山云樂(lè)基地；方回春堂靈芝，采自福建莆田；日本靈芝，取自廣西宏旺菌業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2試劑藥品。磷酸，分析純，成都市聯(lián)合化工試劑研究所；鐵氰化鉀，分析純，天津市百世化工有限公司；三氯乙酸(TCA)，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；三氯化鐵(FeCl3)，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；番紅花，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；EDTANa2，分析純，廣州市威佳科技有限公司；磷酸二氫鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；過(guò)氧化氫(H2O2)，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵(FeSO4)，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚，分析純，天津市副晨化學(xué)試劑廠；Tris，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸(HCl)，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；95%乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；DPPH(二苯基苦味?；诫?，分析純，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。1.1.3儀器。METTLER AE 100 電子分析天平，中國(guó)上海精科天平廠；H-1微型渦旋混合器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；新一佳HH-2恒溫水浴鍋，江蘇金上云市宏華儀器廠；UV-7500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，中國(guó)上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDC-140HK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；昆山舒美KQ-600雙頻超聲波清洗器，昆山舒美超聲儀器有限公司；Sartorius普及型pH計(jì)(PB-10)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；YB-500A型高速多功能粉碎機(jī)，上海力箭機(jī)械有限公司。

1.2方法

1.2.1不同來(lái)源靈芝熱水提物總還原力測(cè)定。

1.2.1.1試劑配制。0.2 mol/L NaH2PO4溶液：稱(chēng)取NaH2PO4·2H2O 31.2 g(或NaH2PO4·H2O 27.6 g)加重蒸水1 000 mL即得。0.2 mol/L Na2HPO4溶液：稱(chēng)取Na2HPO4·12H2O 71.632 g(或Na2HPO4·7H2O 53.6 g 或Na2HPO4·2H2O 35.6 g)加重蒸水1 000 mL即得。0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液：取62.5 mL 0.2 mol/L NaH2PO4加入37.5 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，即得。1%鐵氰化鉀溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g鐵氰化鉀，加水溶解，定容至100 mL 棕色瓶中，保存?zhèn)溆谩?0%三氯乙酸(TCA)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g TCA，加水完全溶解后，定容至100 mL棕色容量瓶中，保存?zhèn)溆谩?.1% FeCl3：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g FeCl3，加水完全溶解后，定容至100 mL，棕色容量瓶中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2總還原力測(cè)定。參照文獻(xiàn)[21-22]的測(cè)定方法并略有修改。在2 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖溶液中加入2 mL樣品、2 mL 1%鐵氰化鉀，混勻，混合物在50 ℃恒溫條件下加熱20 min，急速冷卻到室溫，加2 mL 10%三氯乙酸，充分混勻，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上層清液2 mL，加2 mL水，再加0.4 mL 0.1% FeCl3，混合均勻，靜置10 min后在700 nm下測(cè)吸光度A700。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2不同來(lái)源靈芝熱水提物對(duì)羥基自由基(·OH)的清除作用。

1.2.2.1試劑配制。6 mmol/L FeSO4：精確稱(chēng)取0.166 8 g FeSO4·7H2O，溶于適量水中，最后定容至100 mL。6 mmol/L H2O2：30% H2O2溶液相當(dāng)于10 mol/L，配制時(shí)將0.06 mL 30%H2O2溶液稀釋至100 mL即可。6 mmol/L水楊酸：稱(chēng)取0.082 8 g水楊酸溶于適量水中，定容至100 mL，置棕色瓶中保存。

1.2.2.2清除率計(jì)算。參考Smirnoff等[23]測(cè)定方法并略有修改，在10 mL的試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、樣品溶液1 mL、6 mmol/L H2O2溶液1 mL，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol/L 水楊酸溶液1 mL，搖勻，靜置30 min后，以雙蒸水為參比，于510 nm處測(cè)其吸光值。清除率計(jì)算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%，式中，A0為用水代替樣品溶液時(shí)測(cè)得的吸光度；Ai為不同樣品液下測(cè)得的吸光度；Aj為水代替水楊酸時(shí)不同樣品溶液測(cè)得的本底吸光度。

1.2.3不同來(lái)源靈芝熱水提物對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)清除作用。

1.2.3.1試劑配制。0.1 mol/L HCl 溶液：取1 mL濃鹽酸定容至100 mL即可。pH 8.0 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液：取Tris 0.61 g、EDTANa20.037 g用雙蒸水溶解至98 mL左右，用HCl調(diào)節(jié)pH=7.9，最后定容至100 mL。10 mmol/L HCl溶液：取100 μL濃鹽酸定容至100 mL即可。50 mmol/L鄰苯三酚溶液：稱(chēng)取鄰苯三酚0.063 g，用10 mmol/L HCl溶液溶解，定容至10 mL，避光，冷凍保存。

1.2.3.2清除率計(jì)算。參照Marklund等[24]測(cè)定方法并略有修改，取0.05 mol/L Tris-HCl(pH =8.2)緩沖液4.4 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱25 min，加入不同濃度測(cè)試液0.10 mL，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，以蒸餾水為空白，混勻，于25 ℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，立即用10 mol/L HCl 2滴終止反應(yīng)，并在299 nm處測(cè)其吸光度值。清除率計(jì)算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中，Ac為用水代替樣品溶液時(shí)測(cè)得的吸光度；Ai為不同樣品溶液下測(cè)得的吸光度；Aj為水代替鄰苯三酚時(shí)不同樣品溶液下測(cè)得的本底吸光度。

1.2.4不同來(lái)源靈芝熱水提物對(duì)DPPH自由基清除作用。參照Brand-Williams等[25]測(cè)定方法并略有修改，準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg DPPH用95%乙醇溶解并定容于250 mL 容量瓶中，得濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，于棕色瓶中4 ℃保存。將樣品溶液 2 mL與2 mL 2 ×10-4mol/L DPPH 溶液均勻混合，避光反應(yīng)30 min 后在 517 nm 處測(cè)定其吸光度(Ai)，同時(shí)用同法測(cè)定2 mL 2×10-4mol/L DPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度(Ac)，以及 2 mL提取液與 2 mL 溶劑混合后的吸光度(Aj)。清除率計(jì)算公式為：清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中，Ac為用水代替樣品溶液時(shí)測(cè)得的吸光度；Ai為不同樣品溶液下測(cè)得的吸光度；Aj為95%乙醇代替DPPH時(shí)不同來(lái)源樣品溶液下測(cè)得的本底吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1不同來(lái)源靈芝熱水提物總還原力的測(cè)定由圖1可知，不同來(lái)源的靈芝在同一熱水提取物濃度下(4 mg/mL)，總還原力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝的總還原力遠(yuǎn)高于其他幾種靈芝，吸光度達(dá)2.48，最低為陽(yáng)江海靈芝，吸光度為0.3，總還原力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、日本靈芝、方回春堂靈芝、長(zhǎng)白山靈芝、黃山靈芝、泰山靈芝、陽(yáng)江海靈芝。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖1　不同來(lái)源靈芝熱水提物總還原力Fig.1　Reducing power of hot water extracts from different sources of G.lucidum

2.2不同來(lái)源靈芝熱水提物清除羥基自由基(·OH)的測(cè)定從圖2可以看出，不同來(lái)源的靈芝熱水提取物在同一濃度下(10 mg/mL)清除·OH能力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝熱水提取物對(duì)·OH清除能力最高，清除率為99.46%，陽(yáng)江海靈芝清除率為96.3%，兩者差異不顯著(P>0.05)，長(zhǎng)白山靈芝熱水提取物清除·OH能力最弱，清除率為17.94%。羥基自由基清除能力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、陽(yáng)江海靈芝、黃山靈芝、日本靈芝、泰山靈芝、方回春堂靈芝、長(zhǎng)白山靈芝。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05-)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖2　不同來(lái)源靈芝熱水提物清除羥基自由基(·OH)效果Fig.2　Hydroxyl radical (·OH)scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖3　不同來(lái)源靈芝熱水提物清除超氧陰離子自由基·)效果Fig.3　Superoxide radical ·)scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

2.4不同來(lái)源靈芝熱水提物清除DPPH自由基的測(cè)定從圖4可以看出，不同來(lái)源靈芝熱水提取物在同一濃度下(2 mg/mL)清除DPPH自由基能力有顯著性差異。其中貓兒山野生靈芝熱水提取物清除DPPH自由基能力最高，清除率為96.62%；陽(yáng)江海靈芝熱水提取物清除DPPH自由基能力最弱，清除率為30.78%。DPPH自由基清除能力由高到低依次為貓兒山野生靈芝、長(zhǎng)白山靈芝、方回春堂靈芝、日本靈芝、泰山靈芝、黃山靈芝、陽(yáng)江海靈芝。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicated significant differences (P<0.05)。圖4　不同來(lái)源靈芝熱水提物清除DPPH自由基效果Fig.4　DPPH radlcal scavenging of hot water extracts from different sources of G.lucidum

3　結(jié)論與討論

該試驗(yàn)通過(guò)清除DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基活性及還原力能力4個(gè)體外抗氧化模型的測(cè)定，對(duì)不同來(lái)源

靈芝子實(shí)體熱水提取物體外抗氧化性進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)各種靈芝子實(shí)體熱水提取物均有不同程度的體外抗氧化能力。但此次試驗(yàn)僅測(cè)定了同一濃度下不同來(lái)源靈芝的熱水提取物體外抗氧化性，即通過(guò)預(yù)試驗(yàn)將熱水提取物濃度調(diào)整到一個(gè)適宜比較的濃度進(jìn)行橫向比較，沒(méi)有將水提物稀釋成不同濃度梯度測(cè)定EC50，通常當(dāng)EC50值低于10 g/L，表明真菌提取物具有很好的體外抗氧化活性[26]。從自由基清除率的比較可看出，靈芝熱水提取物均具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，且不同的靈芝熱水提取物抗氧化能力有顯著差異，表明靈芝熱水提取物對(duì)人體的氧化損傷有較好的保護(hù)作用。因?yàn)長(zhǎng)ee等[26]研究表明熱水提取物主要組成成分為粗多糖。說(shuō)明貓兒山野生靈芝粗多糖具有較強(qiáng)的生理活性，粗多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及抗氧化機(jī)理研究，還有待于進(jìn)一步深入探討。

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Antioxidant Activity of Hot Water Extracts from Seven Different Sources ofGanodemalucidum

NIE Jian, YANG Shui-lian, MO Mei-hua*et al

(College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642)

Ganodermalucidum; In vitro; Antioxidant activity; Hot water extracts; Different sources

聶健(1989- )，男，江西樂(lè)安人，碩士研究生，研究方向：靈芝活性成分。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事食藥用菌資源開(kāi)發(fā)利用研究。

2016-04-15

S 567.3+1

A

0517-6611(2016)18-134-03

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