謝　鑫,孫　寧,魏鳳菊

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定　071001)

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擬南芥CPK10/CPK30雙突變體的構(gòu)建及表型分析

謝鑫,孫寧,魏鳳菊

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定071001)

CDPKs是植物細(xì)胞內(nèi)一類重要的鈣感受器,擬南芥CPK10屬于CDPK家族成員。為研究CPK10及與其同源性較高的CPK30是否共同參與逆境響應(yīng)。首先構(gòu)建了cpk10×cpk30雙突變體,然后進(jìn)行多種逆境下的生理表現(xiàn)檢測,并利用RT-PCR方法分析2個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,模擬干旱、鹽、ABA處理擬南芥幼苗后,雙突變體與野生型無差異;成苗期雙突變體與單突變體對干旱敏感程度類似。轉(zhuǎn)錄水平檢測到,在干旱脅迫時(shí)雙突變體中RD29A的表達(dá)與野生型及單突變體趨勢相反,呈下降趨勢;響應(yīng)ABA的OST1在雙突變體中受干旱誘導(dǎo)后0.5 h明顯表達(dá)上調(diào)。成功獲得了cpk10×cpk30雙突變體,由生理表型和表達(dá)分析結(jié)果推測CPK10與CPK30可能共同參與了依賴ABA的干旱逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,且二者之間存在功能冗余。

鈣依賴的蛋白激酶;雙突變體;逆境脅迫;表型分析

鈣依賴的蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs)作為生物體內(nèi)重要的鈣信號感受器,在胞內(nèi)鈣信號的級聯(lián)傳遞過程中起著重要的作用。植物CDPK屬于多基因家族,家族中許多成員在應(yīng)答非生物逆境過程發(fā)揮重要功能。尤其在干旱、高鹽脅迫方面最為明顯,如擬南芥AtCPK10和AtCPK11可以受干旱和高鹽誘導(dǎo)表達(dá)[1-2];AtCPK27[3]參與植株對鹽脅迫的應(yīng)答;過量表達(dá)AtCPK8[4]和AtCPK10[5]可以使植株耐旱力明顯增強(qiáng);其他植物中如玉米ZmCPK4[6]、葡萄VaCPK20[7]、姜ZoCDPK1[8]過量表達(dá)后,植株對干旱脅迫的耐受性明顯增強(qiáng);OsCPK12[9]正調(diào)控水稻應(yīng)答高鹽脅迫。有些CDPK成員表現(xiàn)對逆境的負(fù)調(diào)控,如AtCPK21[10]的突變體表現(xiàn)出對逆境脅迫耐受力增強(qiáng)。由于多基因家族中結(jié)構(gòu)域的保守性,會存在多個(gè)基因的功能冗余現(xiàn)象,如AtCPK4和AtCPK11共同介導(dǎo)了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[11];AtCPK2和AtCPK20共同調(diào)控花粉管陰離子通道SLAH3[12]。煙草的NaCDPK4和NaCDPK5共同參與茉莉酸的早期合成過程,二者同時(shí)被沉默后,會導(dǎo)致茉莉酸的積累[13]。

前期研究發(fā)現(xiàn),擬南芥CPK10參與對干旱脅迫的響應(yīng),通過ABA及鈣離子介導(dǎo)了對氣孔運(yùn)動的調(diào)節(jié)[5]。在干旱處理?xiàng)l件下,Atcpk10突變體比野生型葉片失水萎蔫明顯。擬南芥CDPK家族中,AtCPK30與AtCPK10屬于同一亞家族,且序列相似性為家族最高,有研究顯示AtCPK30參與了擬南芥幼苗期ABA等激素信號途徑[14],而在應(yīng)答逆境方面的研究未見報(bào)道。是否高度同源性的AtCPK30與AtCPK10基因存在相似或冗余的功能,這2個(gè)基因在同時(shí)缺失的情況下,對于逆境會發(fā)生怎樣的表型變化,它們在參與逆境過程中的作用有什么相關(guān)性,這些問題都尚不清楚。本研究分別以CPK10基因及CPK30基因單突變體為父母本,通過單突變體雜交獲得雙突變體,結(jié)合生理表型及逆境相關(guān)基因檢測,為深入探討AtCPK10及AtCPK30在非生物逆境中的功能提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

擬南芥cpk10(SALK_082441)及cpk30(SALK_087240)T-DNA插入突變體自SALK庫購得。植物總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶、dNTP等購自大連寶生物公司(TaKaRa);膠回收試劑盒等購自天根生物科技公司(Tiangen);質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。植物激素ABA、MOPS等購自Sigma公司。其他化學(xué)藥品為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2植物材料培養(yǎng)方法

1.2.1植物材料培養(yǎng)首先用0.5%次氯酸鈉消毒液(0.5%(V/V)NaClO+0.01%(V/V)Triton X-100)對擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子進(jìn)行消毒處理,4 ℃黑暗處理2～3 d,之后播種于MS培養(yǎng)基上生長約7 d。將幼苗移栽到土壤(蛭石∶營養(yǎng)土1∶1～1∶2)中培養(yǎng)(用透明塑料膜覆蓋保濕4～5 d)。溫室培養(yǎng)條件為:光/暗周期為16 h/8 h,溫度22 ℃,濕度60%,光照強(qiáng)度80～100 μmol/(m2·s)。

1.2.2雜交試驗(yàn)采用常規(guī)的人工雜交方法獲得雙突變體。選取純合單突變體作為親本,雜交前去除母本已長角果和已開花以及未開花的花瓣和雄蕊,將父本的花粉涂布在母本未沾花粉的柱頭上。授粉10 h后柱頭毛萎蔫,3 d后角果形成并伸長,即為雜交成功。對雜交子代F1進(jìn)行PCR檢測,獲得2個(gè)目的基因均雜合的個(gè)體,然后進(jìn)行自交,分別從DNA和RNA水平對F2進(jìn)行純合鑒定,最終獲得純合體。

1.2.3逆境生理表型試驗(yàn)種子萌發(fā)階段表型篩選:將各種基因型的種子播種在MS篩選培養(yǎng)基上。每種篩選濃度均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。播種好的培養(yǎng)皿豎直放于溫室中培養(yǎng),定期交換擺放位置,排除位置效應(yīng)可能對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。培養(yǎng)14 d觀察并照相。

幼苗階段表型篩選:播種于MS培養(yǎng)基上的種子,豎直培養(yǎng)4 d。選取不同基因型長勢相同的幼苗移栽到MS篩選培養(yǎng)基上。每種篩選濃度均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。培養(yǎng)條件同上。生長14 d,觀察照相。

成苗階段表型篩選:溫室培養(yǎng)缽中生長21 d左右的幼苗,進(jìn)行干旱、高鹽處理。定期交換培養(yǎng)缽位置,避免位置效應(yīng)對試驗(yàn)結(jié)果造成影響,觀察植株長勢并照相。

1.3分子試驗(yàn)相關(guān)方法

1.3.1T-DNA插入檢測參照CTAB法提取成熟葉片基因組DNA,T-DNA插入突變體的鑒定引物依據(jù)Signal網(wǎng)站(http://siganl.salk.edu/tdnaprimers.html)的方法設(shè)計(jì)。以基因組DNA為模板,不同引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測其T-DNA插入情況。

1.3.2總RNA的提取及RT-PCR利用TRIzol方法提取成熟葉片RNA,以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板擴(kuò)增擬南芥組成型表達(dá)的持家基因EF1a,通過調(diào)整模板的加入量使得EF1a基因電泳檢測時(shí)條帶亮度基本一致。擴(kuò)增目的基因,觀察分析目的基因的亮度變化。

1.4引物設(shè)計(jì)與合成

PCR引物由上海生工通過PAGE純化方式合成,各引物名稱及序列如表1所示。

2　結(jié)果與分析

2.1F1cpk10×cpk30雙突變雜合體的獲得擬南芥CDPK家族中,CPK30與CPK10的序列相似性為86%。是否這二者共同參與了幼苗期植株響應(yīng)逆境的過程,通過純合單突變體雜交,構(gòu)建cpk10×cpk30的雙突變體,以cpk10×cpk30雜交F1各株基因組DNA為模板檢測和篩選兩基因的雜合體,利用CPK30TF/LBa1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,只有cpk10×cpk30雙突變雜合體能夠擴(kuò)增出條帶。本試驗(yàn)隨機(jī)選取約40棵F1植株進(jìn)行檢測,其中1,6,36,38號植株為cpk10×cpk30雙突變雜合體,如圖1所示。

表1　引物序列

圖1　雙突變F 1雜合體鑒定

2.2F2雙突變純合體篩選

F1雜合體自交后,獲得4個(gè)F2株系分別標(biāo)記為:H1、H6、H36、H38。對這4個(gè)株系進(jìn)行DNA水平鑒定以獲得純合的雙突變體。首先檢測CPK10基因的純合情況。如果以CPK10TF和CPK10TR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增,雜合體與野生型植株一樣可以擴(kuò)增出CPK10基因的片段;利用LBa1與CPK10TF組成引物對擴(kuò)增,雜合體與純合體植株均能擴(kuò)增出條帶。利用上述PCR方法對H1(24個(gè)植株樣品)、H6(24個(gè)樣品)、H36(6個(gè)樣品)以及H38(18個(gè)樣品)4個(gè)株系的材料分別進(jìn)行了CPK10基因鑒定(圖2-A)。結(jié)果顯示,H1株系的10棵植株;H6株系的3棵植株;H36株系的4號植株;H38株系的5棵植株為cpk10純合突變體(圖2-A)。

經(jīng)鑒定為CPK10基因插入純合的植株再進(jìn)行CPK30基因的插入突變鑒定。分別利用CPK30TF和CPK30TR、CPK30TF和LBa1 2對引物搭配進(jìn)行PCR擴(kuò)增。確定H1株系中1,3,4號植株;H38株系中5,7,13,15,17號植株;H36的4號植株為DNA水平上cpk10×cpk30雙突變純合體(圖2-B)。

A.F2雙突變純合體CPK10基因純合鑒定;B.F2雙突變純合體CPK30基因純合鑒定。

2.3F3純合雙突變體的篩選

DNA水平上確定為CPK10和CPK30基因雙突變的純合體,接下來通過RT-PCR技術(shù),在RNA水平檢查2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄情況。野生型材料中能檢查到特異擴(kuò)增出的CPK10與CPK30基因片段(圖3);cpk10單突變體中能檢測到CPK30基因的片段,而沒有擴(kuò)增出CPK10基因的特異性條帶;cpk30突變體材料中能夠擴(kuò)增出CPK10特異片段,而不能擴(kuò)增出CPK30基因片段;雙突變體材料中CPK10與CPK30 2個(gè)基因的目的片段都不能擴(kuò)增出來。由以上結(jié)果得出,H1株系的4號植株為cpk10×cpk30的雙突變純合體。

圖3　RT-PCR鑒定雙突變純合體

2.4雙突變的表型篩選

2.4.1萌發(fā)期表型觀察在含有ABA的MS篩選培養(yǎng)基上,雙突變體與單突變體均未見與野生型明顯差異的表型。在MS培養(yǎng)基中加入Mannitol,觀察各基因型在滲透物質(zhì)處理?xiàng)l件下種子萌發(fā)情況,同樣沒有發(fā)現(xiàn)cpk10×cpk30雙突變體與cpk10、cpk30植株及野生型有明顯差異(圖4)。將雙突變體種子播種在含有100 mmol/L NaCl的MS篩選培養(yǎng)基上(圖4),與正常培養(yǎng)基相比,雙突變體、單突變體及野生型都表現(xiàn)為冠小發(fā)黃、根短;幾種材料與野生型相比無明顯差異。表型檢測結(jié)果表明,在種子萌發(fā)階段CPK10與CPK30可能不是擬南芥響應(yīng)逆境脅迫過程中的關(guān)鍵基因。

圖4　雙突變在處理培養(yǎng)基上種子萌發(fā)表型觀察

2.4.2萌發(fā)后表型觀察把MS培養(yǎng)基上長勢相同的幼苗移到含有不同濃度的滲透物質(zhì)(Mannitol)、ABA、NaCl的處理培養(yǎng)基上,雙突變體、單突變體與野生型之間長勢基本相同,無明顯差異(圖5)。這表明CPK10、CPK30基因的敲除,并沒有使植株對以上逆境的應(yīng)答發(fā)生改變,證明這2個(gè)基因不是擬南芥幼苗生長期響應(yīng)上述逆境的關(guān)鍵因子。

圖5　各基因型材料在處理培養(yǎng)基上表型觀察

2.4.3成苗期表型觀察正常生長14 d后的幼苗經(jīng)干旱處理后,雙突變體表現(xiàn)出與單突變體相似的干旱敏感表型:葉片萎蔫,莖稈倒伏(圖6)。CPK10基因的缺失會導(dǎo)致植株耐旱能力減弱[11],雙突變體也變現(xiàn)同樣的表型,說明CPK30基因的缺失并沒有使雙突變體比cpk10對干旱更敏感。

圖6　雙突變體成苗期干旱脅迫表型觀察

2.5干旱相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析

為了探討CPK10/CPK30是否共同參與了響應(yīng)干旱脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,本研究通過雙突變體、單突變體及野生型植株進(jìn)行干旱處理,利用RT-PCR技術(shù)對干旱逆境信號通路的關(guān)鍵基因表達(dá)情況進(jìn)行了分析。對成苗蓮座葉片進(jìn)行0,0.5,1.0,3.0 h的干旱處理,RT-PCR結(jié)果顯示,干旱脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因RD29A,隨著時(shí)間的變化在野生型及單突變體中呈現(xiàn)明顯的上升趨勢,而在雙突變體中呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(圖7),表明CPK10/CPK30基因與水分脅迫響應(yīng)相關(guān)。OST1是依賴于ABA的干旱脅迫信號途徑的關(guān)鍵基因。通過檢測發(fā)現(xiàn),雙突變體中OST1基因在干旱處理0.5 h時(shí)表達(dá)量增加,而后又逐漸恢復(fù)到原來的水平;而在野生型與單突變體中OST1的表達(dá)量并沒有明顯變化(圖7)。這預(yù)示著CPK10與CPK30基因可能共同參與了ABA依賴的干旱脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。那么,在該信號途徑中這2個(gè)基因是否參與了對ABA合成的調(diào)控。接下來,選擇了ABA合成關(guān)鍵基因ABA3和轉(zhuǎn)錄因子MYB2作為標(biāo)記基因,結(jié)果顯示這2個(gè)基因在干旱處理下的表達(dá)趨勢在4種不同材料中并沒有明顯差異(圖7),推測CPK10與CPK30可能在植株響應(yīng)干旱脅迫過程中只參與ABA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),并未參與ABA的合成。

圖7　干旱逆境標(biāo)記基因的RT-PCR分析

3　討論

對于多基因家族,一些成員表現(xiàn)為功能冗余,可使得植物對不良環(huán)境做出適應(yīng)性調(diào)整。CDPKs家族成員在植物響應(yīng)非生物逆境過程中發(fā)揮著重要作用,有些核心CDPKs對植物生存至關(guān)重要,序列同源性較高的CDPK基因,功能相似或冗余的可能性較大,如擬南芥CPK4、CPK5、CPK6和CPK11幾個(gè)成員共同參與調(diào)控早期MAMP信號途徑中基因的表達(dá),4個(gè)成員同時(shí)缺失的突變體對flg22的抗性明顯減弱[15]。馬鈴薯StCDPK4和StCDPK5共同參與對NADPH氧化酶的磷酸化,進(jìn)而促使活性氧爆發(fā)[16]。AtCPK4、AtCPK11[11]、AtCPK10、AtCPK30和AtCPK32[17]都能通過轉(zhuǎn)錄因子ABF4調(diào)控植物對ABA的響應(yīng)。AtCPK10與AtCPK30具有高度的序列相似性,本研究通過構(gòu)建二者的T-DNA插入雙突變體,進(jìn)而分析探討二者響應(yīng)非生物逆境方面的功能。結(jié)果表明,幼苗期各種處理?xiàng)l件下雙突變體與野生型無差異;成苗時(shí)期干旱處理?xiàng)l件下,雙突變體與cpk10單突變體沒有表型差異。由表型檢測結(jié)果推測,在植株成苗期對干旱逆境的應(yīng)答過程中,CPK10和CPK30二者并不存在功能冗余。接下來的轉(zhuǎn)錄水平檢測顯示,CPK30參與了對干旱逆境的應(yīng)答,表型檢測和轉(zhuǎn)錄水平檢測結(jié)果的不一致性,暗示著在應(yīng)答干旱逆境過程中,可能還有該家族的其他成員發(fā)揮功能。

CDPK屬于鈣受體激酶,逆境脅迫引發(fā)的鈣信號經(jīng)CDPK傳遞給下游哪些蛋白,這是探討CDPK作用機(jī)制的關(guān)鍵所在。AtCPK10和AtCPK30是CDPK家族中最早報(bào)道的正向調(diào)控ABA信號的蛋白因子[18-19]。本研究結(jié)果顯示,CPK10/CPK30在植株響應(yīng)干旱脅迫過程中參與ABA信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,這與前人研究結(jié)果一致。體外試驗(yàn)證明,AtCPK10、AtCPK30都能通過轉(zhuǎn)錄因子ABF4調(diào)控植物對ABA的響應(yīng),表明CDPK介導(dǎo)的ABA信號的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能是通過轉(zhuǎn)錄因子ABFs起作用。體內(nèi)試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn):AtCPK32可以體內(nèi)激活A(yù)BF4并啟動下游基因的表達(dá)[17]。AtCPK4、AtCPK11可以調(diào)控ABF1和ABF4而影響逆境基因的表達(dá),cpk4/cpk11雙突變體表現(xiàn)出耐旱力減弱,雙突變體中ABA響應(yīng)的基因表達(dá)受到影響[11]。同樣水稻的OsCPK21[20]過表達(dá)后,ABA響應(yīng)基因會因ABFs活性變化而改變。CPK10[5]與CPK30[14]二者均定位于細(xì)胞膜,它們在體內(nèi)是否會直接影響到細(xì)胞核中ABFs的活性,它們?nèi)绾瓮ㄟ^磷酸化作用將干旱逆境信號向下傳遞,這是我們將來進(jìn)一步探討的方向。

通過雜交獲得cpk10×cpk30雙突變體;表型檢測得出,在種子萌發(fā)過程和幼苗時(shí)期CPK10和CPK30可能不是參與非生物逆境響應(yīng)的關(guān)鍵蛋白;在植株成苗期二者參與干旱脅迫響應(yīng),并在依賴ABA的逆境響應(yīng)信號途徑中發(fā)揮功能。

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Construction and Phenotype Analysis of CPK10/CPK30 Double MutantinArabidopsis

XIE Xin,SUN Ning,WEI Fengju

(College of Life Sciences,Agricultural University of Hebei,Hebei Province Key Laboratory of Plant Physiology and Molecular Pathology,Baoding071001,China)

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) function as Ca2+sensor in various plant physiological processes.CPK10 was one member of CDPK family.In order to investigate the molecular mechanisms ofCPK10 and it′s high homologyCPK30 in response to stress,cpk10×cpk30 double mutant was firstly constructed.The phenotypes in response to various stress were detected,and the RT-PCR method was used to analyzed the two genes expression.The results showed that there was no difference in the seed germination stage between double mutant and wild-type plants in the treatment of drought,salt and ABA.In the mature stage,double mutant exhibited no difference to drought stress compared with wild-type and single mutant.Nevertheless,the expression levels ofRD29Awas decreased in the double mutant and showed opposite trend in wild-type and single mutant during drought stress.The expression of ABA-responsive geneOST1 was enhanced obviously in double mutant after drought stress 0.5 h.Thecpk10×cpk30 double mutant was successfully obtained.Our data indicated thatCPK10 andCPK30 might be involved in ABA-dependent signal transduction pathway,and showed redundant functions.

CDPK;Double mutant;Adversity stress;Phenotype analysis

2016-05-18

國家自然科學(xué)基金專項(xiàng)(31040052)；國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31101022)；植物生理學(xué)與生物化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(SKLPPBKF1504)

謝鑫(1990-)，女，河北邯鄲人，在讀碩士，主要從事植物逆境研究。謝鑫、孫寧為同等貢獻(xiàn)作者。

魏鳳菊(1979-)，女，河北衡水人，講師，博士，主要從事植物抵抗逆境分子機(jī)制方面的研究。

Q78

A

1000-7091(2016)04-0094-06

10.7668/hbnxb.2016.04.016