張維宏,安　哲,范學(xué)鋒,馮月琪,楊文香,劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北 保定　071001)

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EMS誘導(dǎo)小麥TcLr19感葉銹病突變體的篩選

張維宏,安哲,范學(xué)鋒,馮月琪,楊文香,劉大群

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心,河北 保定071001)

為了利用小麥感葉銹病突變體進(jìn)行抗病基因功能和機(jī)制研究,用EMS處理小麥抗葉銹病近等基因系TcLr19的種子,對獲得的M2、M3植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀觀察和田間抗葉銹性鑒定。結(jié)果顯示,不同濃度的EMS溶液處理種子共獲得367個M1單株,處理濃度為1.0%時,接近半致死劑量,且M2表型突變頻率最高,適宜突變篩選。在2 359個M2突變?nèi)后w中,共篩選到表型突變體38個,表型突變頻率1.61%;篩選出感葉銹病突變體53個,感病突變頻率2.25%。在459個M3感病突變?nèi)后w中,共鑒定出146個感病突變體,其中M36-2、M333-8、M333-9、M333-11、M344-4、M396-8這6個M3感病突變材料,遺傳穩(wěn)定率較高,達(dá)70%以上。為保證結(jié)果的可靠性,試驗中還利用Lr19的分子標(biāo)記對突變體進(jìn)行分子輔助篩選。結(jié)果表明,EMS誘變是獲得小麥感葉銹病突變體的有效手段,不僅為小麥抗葉銹基因的克隆和功能研究提供了重要的基礎(chǔ)材料,還為小麥育種提供了新的種質(zhì)。

小麥;葉銹病;甲基磺酸乙酯;突變體

EMS(Ethyl methane sulphonate,甲基磺酸乙酯),作為化學(xué)誘變劑能夠引起單一堿基對改變而形成點突變。利用其誘導(dǎo)植物創(chuàng)制突變體,不需要進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,可以在短時間內(nèi)獲得大量功能基因的點突變,引起不同基因的等位變異,能夠針對作物的某一種性狀進(jìn)行改良[4],是目前最有效、應(yīng)用最廣的化學(xué)誘變劑。以EMS突變體為基礎(chǔ),結(jié)合TILLING技術(shù),能夠高通量快速篩選目的基因突變個體,挖掘新基因、開展功能基因研究[5],該技術(shù)已成功應(yīng)用于小麥[6-7]、玉米[8]、水稻[9]、大麥[10]、高粱[11]、大豆[12]等作物。利用EMS誘變技術(shù),在小麥上構(gòu)建了偃展4110[13]、豫農(nóng)201[14]、京411[15]等表型變異豐富的突變體庫,篩選到一些性狀優(yōu)良的突變體,為作物遺傳改良提供了一批新的種質(zhì)。

小麥抗葉銹病基因Lr19來源于長穗偃麥草(Agropyronelongatum),定位在7DL染色體上,具有很強(qiáng)的抗葉銹性,目前很少發(fā)現(xiàn)對其有毒力的小麥葉銹菌[16]?？寺≡摶?研究其抗病機(jī)制對于該基因的高效利用具有重要意義。國內(nèi)外目前已定位了多個Lr19的分子標(biāo)記[17-20],并發(fā)現(xiàn)了一個Lr19的候選基因[21],但至今仍未克隆到該基因,并且該基因的抗病機(jī)制,也了解很少。本試驗用EMS處理攜帶Lr19基因的小麥近等基因系TcLr19材料創(chuàng)建感病突變?nèi)后w,不但能為小麥抗葉銹基因的克隆和功能研究提供重要的基礎(chǔ)材料,還能為小麥育種提供了新的種質(zhì)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

試驗所用小麥材料以Lr19為回交6代的近等基因系材料TcLr19,感病親本Thatcher和感病品種鄭州5389;對小麥TcLr19低毒的小麥葉銹菌混合菌種。上述小麥試材和菌種均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究中心提供。

誘變劑EMS為SigMa公司產(chǎn)品。

1.2EMS誘變處理

選取飽滿的小麥種子每組300 粒,蒸餾水浸泡8 h至吸水飽和;在室溫下分別放入0.8%,1.0%,1.2%的EMS磷酸溶液中緩慢振蕩處理8 h,清水漂洗2～3次,用流動的自來水沖洗12 h后大田播種。以磷酸緩沖液浸泡的種子作為對照。

1）臺車模板及支撐油缸等由于設(shè)計剛度不足，或在超挖較大的部位澆筑混凝土?xí)r，由于超出臺車模板承受力發(fā)生收斂變形，造成襯砌環(huán)向接縫出現(xiàn)錯臺。2）臺車小邊模與邊墻（邊頂拱）模板接縫處由于未打磨而形成錯臺。

1.3田間播種及加代繁殖

將誘變處理后的小麥種子于2012年10月中旬播種于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。每行30粒進(jìn)行點播,每個處理10行,設(shè)野生型TcLr19對照區(qū)。小區(qū)四周播種2～4行感病品種鄭州5389。常規(guī)管理,出苗后至收獲前進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀的考察,并在苗期和成株期進(jìn)行抗葉銹病鑒定,成熟后單株收獲感病植株M1種子,其他材料混收,保留M1感病植株上的葉銹菌,繁殖備用。M2于2013年10月中旬大田單株播種,出苗后至收獲前進(jìn)行田間農(nóng)藝性狀的考察,并在苗期和成株期接種M1獲得的葉銹菌,進(jìn)行抗葉銹病鑒定,成熟后單株收獲;M3按上述方法繼續(xù)進(jìn)行加代繁殖。

1.4感葉銹病突變體的篩選

從M1突變?nèi)后w中鑒定出感葉銹病單株,收獲種子。繼續(xù)對其M2和M3株系進(jìn)行小麥葉銹病抗性鑒定。具體鑒定方法如下:在小區(qū)四周播種接種行感病品種鄭州5389。將對M1表現(xiàn)高毒力的小麥葉銹菌株制成孢子懸浮液(加入0.03%吐溫20),在春天返青后對接種行及突變植株進(jìn)行噴霧接種,黑暗保濕14 h,第2天揭開保濕膜,自然條件下生長,待感病對照充分發(fā)病后,按照Roelfs等[22]提出的9級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行侵染型鑒定,0～2為低侵染型;3～4為高侵染型,表示感病。在小麥進(jìn)入乳熟期后進(jìn)行第2次鑒定。

1.5小麥TcLr19突變體的分子輔助篩選

在田間抗性鑒定完成后,采集各單株葉片,CTAB法提取小麥基因組DNA,對感病突變體進(jìn)行Lr19分子標(biāo)記檢測。引物見表1,參考Gupta等[23]。PCR體系為10 μL,含10×Buffer(含Mg2+)1 μL、dNTP 0.2 μL、引物(10 mmol/L)1 μL、模板DNA 30 ng、Taq酶1 U。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,65 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,3次生物學(xué)重復(fù)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1EMS處理濃度對小麥TcLr19出苗率的影響

試驗采用0.8%,1.0%,1.2% 3個濃度的EMS磷酸緩沖液為誘變劑對小麥種子進(jìn)行處理,以磷酸緩沖液為對照。播種7 d后對小麥TcLr19種子出苗率進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果表明(表2),EMS誘變處理TcLr19播種5～7 d后,不同的處理濃度間種子出苗率差異明顯,隨著處理濃度的增大,出苗率逐漸降低,當(dāng)EMS處理濃度為1.2%時,小麥的出苗率僅為30.3%。EMS處理濃度的增大,雖然可能獲得較高的突變率,但低出苗率又直接影響后期突變體的成功篩選,當(dāng)EMS處理濃度為0.8%或1.0%,處理時間8 h時,接近半致死劑量,適宜突變體的篩選。試驗最終成功收獲M1材料367份。

表1　試驗使用的引物序列

表2　不同EMS濃度處理的小麥TcLr19 M1出苗及變異情況

2.2EMS誘導(dǎo)的小麥田間表型突變

種子經(jīng)EMS處理后,觀察到M1部分植株的表型發(fā)生了變異,主要表現(xiàn)在葉片畸形、穗子畸形、早衰、植株矮化、分蘗不均、不育等方面。為排除EMS誘導(dǎo)引起的生理損傷,在M2生育期內(nèi)以野生型為對照,重點對葉片、株高、分蘗、穗型、生育期等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查。在2 359個EMS不同處理濃度的M2突變?nèi)后w中,共觀察到表型突變植株38株,表型突變頻率1.61%。主要突變類型有:葉片黃化、葉片卷曲畸形、穗部畸形、分蘗增多、分蘗減少、生育期延長、不育等(表3)。其中突變頻率最高的兩類突變?yōu)橥沓樗胪蛔兒腿~片畸形突變,說明EMS對小麥的抽穗期和葉片形態(tài)影響較大。晚抽穗突變共14株,其抽穗時間比正常植株晚5～7 d,突變頻率0.59%;葉片畸形突變6株,表現(xiàn)為旗葉卷曲、窄葉,突變頻率0.25%。圖1為部分突變體的田間農(nóng)藝性狀。

EMS不同的處理濃度對表型突變也有影響。在0.8%處理中,共觀察到12個表型突變體,突變頻率為0.51%;1.0%處理中,共觀察到16個表型突變體,突變頻率為0.68%;1.2%處理中,共觀察到10個表型突變體,突變頻率為0.42%。1.0%處理突變頻率最高。

表3　不同EMS濃度處理的小麥TcLr19 M2表型突變

2.3EMS誘導(dǎo)的感小麥葉銹病突變體的篩選

本試驗重點對EMS誘導(dǎo)后的M2、M3篩選感葉銹病突變體。用毒力較高的小麥葉銹混合菌株進(jìn)行接菌后,M1田間鑒定結(jié)果顯示,對照組TcLr19對小麥葉銹菌表現(xiàn)為高抗,侵染型為0、；、1。 在EMS誘變組,初步篩選出40株抗病性變化的突變體,其抗病性由高抗變?yōu)橹锌够蚋胁?侵染型為2、3、4,中抗和感病植株單株收獲。在苗期和成株期分別對2 359個M2混合突變?nèi)后w(包括成功加代的19個M1感病/中抗株系)進(jìn)行抗葉銹性鑒定,結(jié)果如表4所示。共篩選到53個M2感葉銹病突變體,感病突變頻率2.25%。其中50個感病突變體來源于在M1表現(xiàn)感病/中抗的16個不同株系,3個突變體由在M1表現(xiàn)抗病的混合試材中篩選得到;3個感病突變株系其抗病性在M2恢復(fù)正常。同一株系各單株的抗病性也出現(xiàn)分離,不同株系間存在差異。

圖1　EMS誘導(dǎo)的小麥TcLr19 M2表型突變

M2感病突變體大田加代繁殖,459個M3感病突變?nèi)后w中,共鑒定出146個高侵染型感病突變體,主要集中在M5、M6、M10、M19、M33、M44、M54、M64、M76、M96這10個株系,其中M36-2、M333-8、M333-9、M333-11、M344-4、M396-8這6個M3感病突變試材,遺傳穩(wěn)定率較高,達(dá)70%以上(表5)。

表4　M2感葉銹病突變體的田間鑒定

表5　部分M3感葉銹病突變體的田間侵染型表現(xiàn)

2.4TcLr19感葉銹病突變體的分子輔助篩選

用與Lr19基因正相關(guān)的SCAR引物SCS265-F和SCS265-R及負(fù)相關(guān)引物SCS253-F和SCS253-R以Thatcher、TcLr19為對照分別對TcLr19突變體試材進(jìn)行分子輔助篩選,排除試驗中的假陽性。結(jié)果顯示,試驗中篩選出的所有TcLr19 M1、M2、M3突變體,用SCS265引物均可在TcLr19及TcLr19突變體試材中擴(kuò)增出512 bp的特異性片段;用反向引物可在Thatcher中擴(kuò)增出736 bp的特異性片段,而TcLr19及TcLr19突變體試材無此片段。圖2,3為Lr19基因正、負(fù)相關(guān)引物在部分M3感葉銹病突變體上的擴(kuò)增結(jié)果。試驗中有個別試材用以上2對引物未能擴(kuò)增出特異性片段,表明該試材不含Lr19基因,極有可能為非TcLr19突變體試材,為保證試驗的可靠性,本試驗不再進(jìn)行加代繁殖及后續(xù)相關(guān)研究。

M.DL2000 Marker;Tc.Thatcher;Lr19.TcLr19;100～113.M3 TcLr19感病突變體單株。圖3同。

圖3　SCS253引物在M3感葉銹病突變體上的擴(kuò)增結(jié)果

3　討論

突變體是作物育種和功能基因組學(xué)研究的重要基礎(chǔ)材料。構(gòu)建飽和、變異豐富的突變體庫,篩選優(yōu)良突變個體是誘變技術(shù)的核心。EMS因其突變效率高、頻率高和范圍廣等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物化學(xué)誘變[24]。EMS在誘變的同時會造成生理損傷,在一定范圍內(nèi),隨著處理濃度和處理時間的提高,突變效率增加,但生理損傷同時加大。合適的濃度范圍是誘變試驗成功的關(guān)鍵,一般使用半致死劑量作為最佳處理濃度。在不同作物或品種間對EMS的敏感性也不同,小麥上0.3%～1.2%的EMS處理濃度都曾被使用[1-2,6-7,13-15]。本試驗用0.8%,1.0%,1.2% 這3個濃度的EMS誘變劑對TcLr19小麥種子進(jìn)行處理,采用多個濃度處理不但可以獲得高突變率和豐富的突變類型,而且還可能獲得更多的突變個體。由于EMS誘變處理,本身具有一定的不確定性,其處理濃度和時間及處理過程中受外界環(huán)境溫、濕度等影響較大,因此在構(gòu)建變異類型豐富的飽和突變體庫時,可采用多個濃度,多時間處理的混合群體。

小麥的基因組龐大,EMS誘變時能產(chǎn)生大量的突變位點,目前報道的突變頻率最高的突變體庫是Colbert等[25]創(chuàng)建的2 500株普通軟質(zhì)小麥突變體庫,試驗研究發(fā)現(xiàn)每12 kb就會有一突變體產(chǎn)生。由于普通小麥?zhǔn)橇扼w,當(dāng)某一基因發(fā)生突變時,位于另外兩染色體上的同源基因則會彌補(bǔ)其突變?nèi)毕?從而使基因突變無法在表型上反映。本試驗主要目的不是構(gòu)建飽和突變體庫,而是進(jìn)行感葉銹突變體篩選,因此,選用的突變?nèi)后w樣本量較小,M2表型突變體篩選也不太全面,對于穗形、籽粒等表型突變均未統(tǒng)計,表型突變率較文獻(xiàn)報道偏低。試驗中重點對突變?nèi)后w的抗葉銹性變化進(jìn)行觀察,M2共篩選到感葉銹病突變體53個,感病突變頻率2.25%,表明EMS誘變對小麥抗葉銹性有一定影響。但植物與病原物的互作是一個十分復(fù)雜的過程,誘變對抗病性的影響由多種因素構(gòu)成,受多種環(huán)境因素的影響。本試驗篩選到的感病突變株系其抗病性在M2、M3都出現(xiàn)分離,有的株系甚至完全恢復(fù)正常,在試驗中還觀察到了3株M1表現(xiàn)抗病，M2表現(xiàn)感病的突變體。

誘變加代過程中為排除其他因素影響,增加結(jié)果的可靠性,本試驗又增加了分子輔助篩選部分,通過Lr19特異片段的PCR擴(kuò)增,能夠排除試驗中的假陽性,但是同時也有可能漏篩一部分因Lr19基因發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,而不能擴(kuò)增出特異性片段的突變體,做出進(jìn)一步鑒定分析還需借助其他先進(jìn)的分子生物學(xué)手段來完成。

EMS誘發(fā)小麥遺傳基因突變,能在短期內(nèi)獲得形態(tài)、生理、生化、抗病性變異等方面的突變體,從而為種質(zhì)創(chuàng)新、新品種培育及基因功能的研究等創(chuàng)造條件。薛芳等[26]以春小麥新春11為試材,篩選出了7個抗性淀粉含量高且綜合性狀優(yōu)良的M2突變家系;陸燕等[27]對EMS誘變獲得小麥矮稈圓粒突變體W98進(jìn)行了遺傳分析,并利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了定位;張紀(jì)元等[28]以EMS誘變創(chuàng)制了軟質(zhì)小麥寧麥9號高分子量谷蛋白亞基缺失突變體;陳洋等[29]用EMS誘導(dǎo)獲得感黃矮病YW642突變體,并利用分子標(biāo)記對突變基因進(jìn)行了檢測;馬燕欣[30]以含有Pm21基因的小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL為基礎(chǔ)試材,釆用EMS誘變方法,創(chuàng)造感白粉病突變體NM14,并利用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)(Digital gene expression,DGE)對抗、感材料差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。本試驗從M3中篩選到了來自4個能夠穩(wěn)定遺傳的不同M2株系的6個感病突變體,這會為Lr19基因和功能研究提供理想的試驗材料。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理實驗室小麥銹病研究組目前正在利用RNA-seq技術(shù)對突變型與野生型進(jìn)行基因表達(dá)分析,感病突變基因的定位與遺傳分析也會在以后的試驗中補(bǔ)充完善。

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Screening of Mutants Susceptible to Puccina triticina in TcLr19 Induced by EMS

ZHANG Weihong,AN Zhe,FAN Xuefeng FENG Yueqi,YANG Wenxiang,LIU Daqun

(College of Plant Protection,Agricultural University of Hebei,Biological Control Center of Plant Disease and Plant Pests of Hebei Province,Baoding071001,China)

In order to study the function and mechanism of the resistance gene of wheat leaf rust,seeds of wheat TcLr19 was treated by EMS.The leaf rust resistance and agronomic traits were investigated and phenotypic mutants were identified in M1and M2.A total of 367 individual plants were obtained in M1with different concentrations of EMS.According to the emergence rate,seed rate and mutation rate,EMS 1.0% was considered the optimum concentration.In 2 359 M2mutant,a total of 38 phenotype mutations were screened out with 1.61% mutation rate,and a total of 53 susceptible mutations toPucciniatriticinawere screened out with 2.25% mutation rate.A total of 146 susceptible plants were obtained in 459 M3susceptible populations,especially M36-2,M333-8,M333-9,M333-11,M344-4 and M396-8,and the frequency of susceptible mutation were more than 70%.Furthermore,Lr19 molecular marker-assisted selection was also used in order to guarantee the reliability of the results in the test.The results showed that EMS treatment was an effective method in screening of mutants susceptible toP.triticina.The result not only provided important genetic resources for wheat leaf rust resistance gene cloning and functional genomic research,but also provided new germplasms in wheat breeding.

Wheat;Leaf rust;Ethyl methane sulfonate (EMS);Mutant

2016-04-08

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2013CB127700)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系小麥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目

張維宏(1980-)，女，河北石家莊人，實驗師，在讀博士，主要從事分子植物病理學(xué)及植物病害生物防治研究。

楊文香(1966-)，女，河北滄州人，教授，博士，主要從事分子植物病理學(xué)及植物病害生物防治研究。

劉大群(1958-)，男，河北石家莊人，教授，博士，主要從事分子植物病理學(xué)及植物病害生物防治研究。

S512.1;S335.3

A

1000-7091(2016)04-0088-06

10.7668/hbnxb.2016.04.015