曹淑燕,榮　毅,古咸杰,李清南,廖　玲,葉　霜,邱　霞,汪志輝,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,四川 成都　611130;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所,四川 成都　611130)

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不同砧木對黃果柑果實有機(jī)酸含量和酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響

曹淑燕1,榮毅1,古咸杰1,李清南1,廖玲1,葉霜1,邱霞1,汪志輝1,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,四川 成都611130;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 果蔬研究所,四川 成都611130)

為了探究不同砧木對黃果柑果實有機(jī)酸含量、酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響,為黃果柑砧木的選擇提供理論依據(jù)。以枳殼、紅橘、香橙為砧木,黃果柑實生苗為對照進(jìn)行研究。黃果柑果實以積累檸檬酸為主,香橙砧能夠最有效地降低果實有機(jī)酸含量,成熟期比實生苗低24.35%;嫁接能夠一定程度的降低CS活性,而對PEPC、MDH活性的影響較小;花后250～330 d,ACO和NADP-IDH活性均表現(xiàn)出香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK的趨勢;除實生苗外，黃果柑N(yùn)ADP-IDH表達(dá)水平與總酸含量間呈顯著性負(fù)相關(guān),而CS、MDH、ACO與總酸含量均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。香橙是黃果柑理想的砧木品種,砧木間果實有機(jī)酸差異是ACO和NADP-IDH活性共同作用的結(jié)果,且NADP-IDH基因的表達(dá)可能是影響不同砧木黃果柑果實中有機(jī)酸含量的關(guān)鍵限制因子。

黃果柑;砧木;有機(jī)酸;酶活性;基因表達(dá)

黃果柑(Citruscultivarcv.Huangguogan)為蕓香科(Rutacese)柑橘亞科(Subfamily aurantioideae)植物,是我國具有自主產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良雜交柑橘[1]。其果實翌年3-5月成熟,具有極晚熟、無核、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)等優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀[2]。良好的砧穗組合有2種。近年來,石棉縣引進(jìn)香橙作為新的黃果柑砧木,但3種砧木對黃果柑果實品質(zhì)的影響尚不明確。

柑橘果實中所含的糖分、有機(jī)酸含量及其比值是決定柑橘果實風(fēng)味的重要指標(biāo)[3-4],決定了柑橘的營養(yǎng)和商業(yè)價值[5]。多數(shù)柑橘品種在成熟期糖酸比較低,嚴(yán)重影響了柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。相對來說,果實內(nèi)糖含量的變化幅度較小,而有機(jī)酸的變化幅度較大。因此,對決定糖酸比大小而言,有機(jī)酸的影響更為重要[7]。檸檬酸合成酶(CS)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、順-烏頭酸酶(ACO)、異檸檬酸脫氫酶(IDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)[8]等作為有機(jī)酸代謝的關(guān)鍵酶,通過三羧酸循環(huán)途徑參與果實有機(jī)酸的代謝。砧木對柑橘的生長量[9]、果實品質(zhì)[10-11]、抗逆性[12-13]等具有很大的影響作用。至今,對于柑橘果實有機(jī)酸代謝的研究主要集中在成熟過程中檸檬酸的代謝機(jī)理[14]、品種間的代謝差異[15]和脅迫處理等對代謝酶活性及基因表達(dá)的影響[16]上,有關(guān)砧木影響酸代謝的研究較少。通過2012-2014年的觀察記錄發(fā)現(xiàn),不同砧木黃果柑的可滴定酸含量差異顯著,但是上述3種砧木對黃果柑有機(jī)酸含量、相關(guān)酶活性及基因表達(dá)方面的研究尚未見報道。

本試驗研究了不同砧木對黃果柑有機(jī)酸含量、酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響,從而了解其影響機(jī)理,最終為篩選出黃果柑的優(yōu)良砧木,實現(xiàn)黃果柑產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效提供理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗地條件試驗地位于四川省石棉縣黃果柑栽培標(biāo)準(zhǔn)示范園,年均氣溫17 ℃,年均積溫5 468 ℃,年均無霜期326 d,年日照數(shù)1 242.9 h,年均降雨量778.3 mm,屬中亞熱帶干熱河谷氣候類型,壤土。

1.1.2試驗材料以枳殼[Poncirustrifoliate(L.)Raf]、紅橘(CitrusreticulataBlanco)和香橙[C.junos(sieb.) Tanaka]3種砧木嫁接的黃果柑為試材,黃果柑實生苗為對照。每種砧木選擇樹勢、樹載、管理方式基本一致的5年生健壯黃果柑3株,進(jìn)行果實的采樣與相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2試驗方法1.2.1采樣方法2014年11月15日(花后210 d,果實轉(zhuǎn)色期)至2015年3月15日,每隔20 d左右,在樹冠的外圍東、南、西、北4個方位,隨機(jī)摘取生長正常、大小均勻、無病蟲害的黃果柑果實各2個,每株樹采8個,用液氮立即帶回實驗室,進(jìn)行測定。

1.2.2黃果柑果實有機(jī)酸含量的測定參照郭燕[17]和肖玉明[13]的方法進(jìn)行果實有機(jī)酸的提取與測定(高效液相色譜法)。

1.2.3酸代謝相關(guān)酶活性的測定參照 Hirai等[18]的方法進(jìn)行酶液的制備,并用Srene法測定酶活性。

1.2.4總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成RNA提取與純化方法參照劉慶[19]和Zhang等[20]的方法略有改進(jìn)。提取的黃果柑果實RNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別進(jìn)行質(zhì)量檢測和濃度分析。用DNase去除殘留的DNA雜質(zhì),然后嚴(yán)格地按照PrimeSciptTMRT reagent Kit (DRR037A) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自寶生物工程大連有限公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成后續(xù)試驗所需的cDNA。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5實時熒光定量PCR分析實時熒光定量PCR引物設(shè)計:根據(jù)筆者克隆的黃果柑相關(guān)基因序列片段(登錄號:KU319552、KU319556、KU319555、KU319553、KU319557、GQ389668.1),運(yùn)用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計,并進(jìn)行擴(kuò)增篩選,結(jié)果見表1。

表1　黃果柑實時熒光定量PCR引物序列

基因的定量表達(dá)分析:以β-actin基因為內(nèi)參基因進(jìn)行實時熒光定量PCR分析,每個樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)根據(jù)SYBR?Rremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)熒光定量試劑盒(購自寶生物工程大連有限公司)進(jìn)行。反應(yīng)體系:cDNA(1.5 μg) 2 μL;2×SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL;正、反向引物(10 μmol/L)各1 μL;ddH2O 8.5 μL,總體系為25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃,5 min;95 ℃,10 s;58 ℃,15 s;72 ℃,20 s(第2至4步進(jìn)行40個循環(huán))。溶解曲線在PCR運(yùn)行完畢后立即開始。

1.2.6統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)用Excel、SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理分析。

2　結(jié)果與分析

2.1砧木對黃果柑有機(jī)酸含量的影響

由圖1看出:不同砧木黃果柑檸檬酸含量與總酸含量變化趨勢一致,呈先上升后下降的趨勢,且檸檬酸含量占總酸含量的90.45%～96.79%,說明黃果柑果實以積累檸檬酸為主;3種砧木與實生苗相比,酸含量均有所下降,成熟期總酸含量分別降低13.17%,6.93%和24.35%,說明香橙砧木能夠最有效地降低酸含量;CK、枳殼砧、紅橘砧有機(jī)酸含量在花后230 d達(dá)到最高值,之后逐漸分解直到成熟,香橙砧最高值出現(xiàn)在花后250 d,說明香橙砧木能夠推遲黃果柑的成熟;蘋果酸和奎寧酸含量很低,整體呈現(xiàn)下降趨勢,不同砧木之間無明顯的規(guī)律性。

2.2砧木對黃果柑有機(jī)酸代謝相關(guān)酶活性的影響

2.2.1砧木對黃果柑有機(jī)酸合成酶類活性的影響由圖2可知,不同砧木CS活性(以鮮質(zhì)量計)在花后250 d達(dá)到峰值,之后緩慢下降,但仍維持在一個較高的活性水平,說明黃果柑有機(jī)酸在花后250 d后的快速降解受CS活性下降的影響較小;除了花后270 d,CS活性均表現(xiàn)為CK最高,但是3種砧木之間CS活性在各個時期表現(xiàn)出不同的差異情況,無明顯規(guī)律,說明嫁接能夠降低黃果柑CS活性,但3種砧木間有機(jī)酸含量的差異不是由CS活性的差異造成;不同砧木PEPC活性(以鮮質(zhì)量計)在花后210～330 d均呈現(xiàn)快速下降的趨勢,但各時期,處理之間的PEPC活性差異情況無明顯規(guī)律,說明黃果柑成熟過程中PEPC酶活性的下降,導(dǎo)致果實有機(jī)酸含量下降,但不同砧木之間有機(jī)酸含量的差異形成與PEPC活性無關(guān);MDH活性在花后250 d達(dá)到峰值,之后緩慢降低,花后330 d活性稍有提高,但處理之間MDH活性(以鮮質(zhì)量計)在不同時期差異情況無明顯變化規(guī)律,說明MDH活性的降低使得黃果柑有機(jī)酸含量降低,但不同砧木之間有機(jī)酸含量的差異與MDH活性關(guān)系不大。

圖1　不同砧木對黃果柑檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸、總酸含量的影響

同一時期進(jìn)行LSD檢驗,小寫字母代表0.05差異水平。圖3～5同。

圖3　不同砧木對黃果柑ACO和NADP-IDH活性的影響

2.2.2砧木對黃果柑分解酶類活性的影響由圖3可以看出:不同砧木黃果柑ACO活性(以鮮質(zhì)量計)呈現(xiàn)先上升后稍微下降的趨勢,相同時期,各處理差異顯著,且花后250～330 d均表現(xiàn)為香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK,說明嫁接能夠提高ACO活性,從而降低有機(jī)酸含量,其中香橙砧木能夠更好地提高ACO活性;NADP-IDH活性(以鮮質(zhì)量計)隨著黃果柑果實的成熟,呈現(xiàn)上升的趨勢,同一時期差異顯著,且花后230～330 d均表現(xiàn)為香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK,說明嫁接同樣能夠提高NADP-IDH的活性,且提高能力依次為香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK。綜合說明,不同砧木黃果柑果實有機(jī)酸含量的差異,是ACO和NADP-IDH活性共同作用的結(jié)果。

2.3砧木對黃果柑有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

2.3.1砧木對黃果柑有機(jī)酸合成酶類基因表達(dá)的影響由圖4可知:不同砧木合成酶類基因表達(dá)的變化趨勢與酶活性的變化趨勢一致,說明基因表達(dá)量的多少直接決定相應(yīng)酶的活性強(qiáng)度。實生苗(CK)的CS基因表達(dá)量總體上高于其他砧木嫁接苗，說明嫁接能夠在一定程度上抑制CS基因的表達(dá)；除個別時期,各個處理間PEPC和MDH相對表達(dá)量都無顯著的差異,說明砧木基本不影響黃果柑果實PEPC、MDH的基因表達(dá)。

將實生苗(CK)花后210 d的數(shù)據(jù)作為1個表達(dá)水平計算各酶表達(dá)相對豐度。圖5同。

2.3.2不同砧木對黃果柑有機(jī)酸分解酶類基因表達(dá)的影響由圖5可以看出,在黃果柑成熟過程中,有機(jī)酸分解酶類基因的表達(dá)量,總體呈上升的趨勢,說明在黃果柑成熟期有機(jī)酸的降解,取決于成熟期高的分解酶類基因的表達(dá)。枳殼砧果實的ACO表達(dá)峰值出現(xiàn)在花后230 d,CK和紅橘砧的表達(dá)峰值出現(xiàn)在花后250 d,而香橙砧卻在花后270 d,說明ACO基因的啟動枳殼砧>CK和紅橘砧>香橙砧,在一定程度上,枳殼砧木提早了黃果柑有機(jī)酸的分解,香橙砧木延遲了有機(jī)酸的分解;除了花后210 d,砧木間NADP-IDH的表達(dá)量差異顯著,且香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK,說明嫁接能夠改變黃果柑果實NADP-IDH的表達(dá),導(dǎo)致果實相應(yīng)酶活性發(fā)生變化,最終導(dǎo)致有機(jī)酸含量出現(xiàn)差異。

圖5　不同砧木對順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫基因表達(dá)的影響

2.3.3不同砧木黃果柑有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)與總酸含量相關(guān)性分析將各處理有機(jī)酸代謝相關(guān)基因表達(dá)水平與總酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)枳殼砧的果實中PEPC表達(dá)水平與總酸含量間呈顯著性正相關(guān),但在其他處理中相關(guān)性不顯著;各處理的NADP-IDH表達(dá)水平與總酸含量間呈顯著性負(fù)相關(guān),且枳殼砧呈極顯著負(fù)相關(guān),而CS、MDH、ACO與總酸含量均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。上述結(jié)果說明NADP-IDH基因的表達(dá)是影響不同砧木黃果柑果實中有機(jī)酸含量的關(guān)鍵限制因子(表2)。

表2　不同砧木黃果柑有機(jī)酸代謝相關(guān)酶基因表達(dá)與總酸含量的相關(guān)系數(shù)

注:*和**分別表示在P<0.05 和P<0.01 水平下顯著相關(guān)。

Note:*and**indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01,respectively.

3　討論

Yamaki[21]試驗發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)柑橘品種以積累檸檬酸為主,極少數(shù)以積累蘋果酸為主。本研究發(fā)現(xiàn),黃果柑整個果實成熟期,檸檬酸含量占總酸含量的90%以上,說明黃果柑果實以積累檸檬酸為主。在柑橘花后6-12個月為成熟過程,常常伴隨著明顯的有機(jī)酸的降低[22-23]。本試驗中,黃果柑果實有機(jī)酸含量在花后230或250 d開始逐漸降低,說明黃果柑果實有機(jī)酸的降解主要在果實成熟后期。成熟期黃果柑果實的總酸含量CK>紅橘砧>枳殼砧>香橙砧,說明對黃果柑進(jìn)行嫁接能夠有效地降低果實有機(jī)酸含量,且香橙砧最好。

CS是一個變構(gòu)酶,存在于果實細(xì)胞線粒體中,能催化草酰乙酸(OAA)與乙酰輔酶A(Ac-CoA)結(jié)合生成檸檬酸;PEPC能催化丙酮酸與CO2形成OAA,可供進(jìn)一步合成檸檬酸;MDH能可逆催化蘋果酸的分解與合成,對蘋果酸的積累和檸檬酸的代謝具有重要作用。文濤等[24]研究發(fā)現(xiàn)CS活性與羅伯遜臍橙有機(jī)酸含量極顯著正相關(guān)。本研究中,黃果柑果實CS活性在花后250 d之后,雖然有一定程度的降低,但是仍保持在一個較高的活性水平,而有機(jī)酸含量呈明顯的下降趨勢,可能是黃果柑有機(jī)酸含量的降低不取決于CS活性的降低,與CS活性關(guān)系不大,這與羅安才等[25]的試驗結(jié)果一致。本試驗中,不同砧木的PEPC活性隨著黃果柑果實的成熟而不斷降低,與龔榮高等[26]的研究一致,說明PEPC在黃果柑果實有機(jī)酸合成過程中起關(guān)鍵作用,其活性的降低能夠抑制果實有機(jī)酸的合成。不同砧木間的CS、PEPC、MDH活性在各時期的差異性情況不同,說明其活性不是導(dǎo)致不同砧木間有機(jī)酸含量差異的主要因素。

順烏頭酸酶(ACO)是一個變構(gòu)酶,催化檸檬酸向烏頭酸的反應(yīng);異檸檬酸脫氫酶(IDH)與有機(jī)酸的合成、積累相關(guān),果實中普遍存在NAD依賴型和NADP依賴型2種型式的IDH,線粒體中的NAD-IDH催化異檸檬酸的形成,細(xì)胞質(zhì)中的NADP-IDH參與了檸檬酸的分解[27]。本試驗中,黃果柑果實成熟后期,ACO活性緩慢下降,說明其活性與后期黃果柑果實有機(jī)酸快速下降關(guān)系不大,與Hirai等[18]在溫州蜜柑上的研究結(jié)果一致。隨著果實成熟,NADP-IDH的活性不斷提高,與果實有機(jī)酸積累呈負(fù)相關(guān),這與陳明[8]的結(jié)果一致。成熟后期,不同砧木間ACO和NADP-IDH活性差異顯著,且表現(xiàn)為香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK,說明嫁接能夠提高黃果柑果實ACO和NADP-IDH活性,從而促進(jìn)有機(jī)酸的分解,ACO和NADP-IDH活性共同作用是導(dǎo)致砧木間有機(jī)酸含量出現(xiàn)差異的重要因素。

有機(jī)酸合成、代謝及分配受到許多因素控制,其中包括代謝酶相關(guān)基因的時空和組織特異性表達(dá)調(diào)控[28]。因此,明確不同砧木對有機(jī)酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響在黃果柑砧木的選擇中就顯得十分必要。本研究發(fā)現(xiàn),除花后270 d外,CS活性均表現(xiàn)為CK最高,說明嫁接能夠抑制CS基因的表達(dá),這可能是砧木影響黃果柑CS表達(dá)的細(xì)胞微環(huán)境的結(jié)果。除個別時期各個處理間PEPC和MDH相對表達(dá)量均無顯著差異,說明砧木基本不影響黃果柑果實PEPC的基因表達(dá),可能由黃果柑自身特性所決定,有待于進(jìn)一步研究。枳殼砧果實的ACO表達(dá)峰值出現(xiàn)在花后230 d,CK和紅橘砧的表達(dá)峰值出現(xiàn)在花后250 d,而香橙卻在花后270 d,說明,在一定程度上,枳殼砧木提早了黃果柑有機(jī)酸的分解,香橙砧木延遲了有機(jī)酸的分解。除了花后210 d,砧木間NADP-IDH的表達(dá)量差異顯著,且香橙砧>枳殼砧>紅橘砧>CK,說明砧穗互作能夠改變黃果柑果實NADP-IDH的表達(dá)。相關(guān)性分析結(jié)果表明:不同砧木的黃果柑N(yùn)ADP-IDH表達(dá)水平與總酸含量間呈顯著性負(fù)相關(guān),而CS、MDH、ACO與總酸含量均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。綜上表明,NADP-IDH基因的表達(dá)可能是影響不同砧木黃果柑果實中有機(jī)酸含量的關(guān)鍵限制因子,這與王西成等[29]在葡萄上的研究結(jié)果相同。

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Effects of Different Rootstocks on Huangguogan Fruit Organic Acid Content,Acid Metabolism-related Enzyme Activity and Gene Expression

CAO Shuyan1,RONG Yi1,GU Xianjie1,LI Qingnan1,LIAO Ling1,YE Shuang1,QIU Xia1,WANG Zhihui1,2

(1.College of Horticulture,Sichuan Agricultural University,Chengdu611130,China;2.Institute of Pomology and Olericulture,Sichuan Agricultural University,Chengdu611130,China)

In order to explore the effects of different rootstocks on fruit organic acid,acid metabolism-related enzyme activities and the gene expression,to provide theoretical evidence for the selection of the rootstocks.In this experiment withPoncirustrifoliate(L.)Raf,CitrusreticulateBlanco,C.junos(sieb.) Tanaka for the rootstocks from Huangguogan seeding as the control for study.Showed that:Huangguogan fruit had been accumulated mainly citric acid,C.junos(sieb.) Tanaka could most effectively reduce the organic content of the fruit,mature period was 24.35% lower than in the the seedling.Grafting can be reduced to some extent the activity of CS,but has little effect on the activity of PEPC and MDH.250-330 days after flowering,the ACO and NADP-IDH activity exhibited a trend ofC.junos(sieb.) Tanaka>Poncirustrifoliate(L.)Raf>CitrusreticulateBlanco>CK.In addition to seeding,Huangguogan fruit between the level of expression ofNADP-IDHand total acid content was significantly negatively correlated,there was no significant correlation betweenCS,MDH,ACOand total acid content.TheC.junos(sieb.) Tanaka is ideal rootstock varieties of Huangguogan,Organic acid content of different rootstocks fruit is the result of combined action of the ACO and NADP-IDH activity,andNADP-IDHgene expression may be the mainly limiting factor of Huangguogan fruit organic acid with different rootstocks.

Huangguogan;Rootstock;Organic acid;Enzyme activity;Gene expression

2016-04-12

四川省科技支撐計劃項目(2011NZ0034);四川省科技廳基金項目(10ZC1454)

曹淑燕(1991-),女,山東濱州人,在讀碩士,主要從事果樹栽培理論與技術(shù)研究。

汪志輝(1968-),男,四川眉山人,教授，博士,主要從事果樹栽培理論與技術(shù)研究。

S666.9;Q78

A

1000-7091(2016)04-0080-08

10.7668/hbnxb.2016.04.014