韓　磊,遲勝起,張劍峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院,山東 青島　266109)

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番茄褪綠病毒CP基因克隆、序列分析及原核表達(dá)

韓磊,遲勝起,張劍峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院,山東 青島266109)

為制備番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)抗血清,以番茄病葉為試驗(yàn)材料,提取總RNA,根據(jù)ToCVCP基因設(shè)計(jì)特異性引物,利用RT-PCR方法克隆目的基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-ToCVCP,在大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中表達(dá)CP蛋白。結(jié)果表明:ToCVCP基因(GenBank登錄號(hào):KT809400)全長774 bp,編碼257個(gè)氨基酸,與GenBank中其他地區(qū)分離物核苷酸序列同源性為97.2%～99.6%,推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為97.3%～100.0%。核苷酸序列保守位點(diǎn)占全部位點(diǎn)的91.3%,氨基酸序列保守位點(diǎn)占全部位點(diǎn)的88.3%,表明不同地理來源的番茄褪綠病毒的CP基因保守性較高。將ToCVCP基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)上,并在體外條件下誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。SDS-PAGE分析表明,轉(zhuǎn) pET32a-ToCVCP載體的大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株表達(dá)了分子量約33 kDa的重組蛋白。該重組蛋白在37 ℃,1.0 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)6 h,表達(dá)量最大。

番茄褪綠病毒;外殼蛋白基因;原核表達(dá);基因克隆

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus,ToCV)往往能引起番茄老葉葉片黃化,葉邊緣區(qū)域輕微卷曲,新生葉片起初沒有癥狀,但隨著病害的發(fā)展,葉脈間逐漸壞死,葉片變脆[1]。番茄褪綠病毒病發(fā)病初期與某些缺素癥狀相似,往往被認(rèn)為是營養(yǎng)失調(diào)所致。1998年,該病毒在美國佛羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)[2],2004年在我國臺(tái)灣首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了ToCV[3],隨后在國內(nèi)多個(gè)省市的溫室番茄植株上檢測出了ToCV的發(fā)生[4-7]。

番茄褪綠病毒屬于長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),其基因組為正義單鏈RNA分子,5′端有甲基化帽子結(jié)構(gòu),3′端無Ploy(A)尾巴[8]。不能通過汁液摩擦傳播,可由粉虱傳播。ToCV可以侵染茄科、菊科、藜科、莧科、番杏科、夾竹桃科及白花丹科等多種植物[9]。其中以茄科寄主數(shù)目最多,如:番茄[10]、甜椒[11]、馬鈴薯[12]等。單獨(dú)或與其他病毒復(fù)合侵染,可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

當(dāng)前,國內(nèi)對ToCV的鑒定多采用RT-PCR方法,未見應(yīng)用血清學(xué)檢測的報(bào)道,尚未發(fā)現(xiàn)有商用ELISA檢測試劑盒,因此制備高純度的ToCV抗血清十分必要。利用原核表達(dá)技術(shù)為基礎(chǔ)制備抗血清,克服了通過提純的病毒粒子為抗原制備抗血清的弊端,而且能夠獲得表達(dá)量大且特異性高的抗血清。本試驗(yàn)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-ToCVCP,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化了原核表達(dá)條件,為制備ToCV高效價(jià)抗血清奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

毒源采自山東省青島市,由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。試劑:大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta(DE3)、質(zhì)粒pET-32a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;TaqDNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA 連接酶、IPTG、RNAiso Plus、pMD18-T載體等購自TaKaRa公司;DNA回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸员本┒锛夹g(shù)有限公司;各種限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank 中 ToCVCP基因的序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了一對特異性引物P1/P2,序列見表1。

表1　引物信息

注:下劃線處分別為BamH Ⅰ、SalⅠ酶切位點(diǎn)。

Note:The underlined wereBamH Ⅰ,SalⅠ endonuclease sites.

1.3總RNA提取

稱取番茄病葉0.1 g,加液氮研磨成粉末,采用TaKaRa公司的RNAiso plus試劑提取總RNA,具體操作參考使用說明書。

1.4RT-PCR擴(kuò)增

cDNA合成反應(yīng)體系(10 μL):DEPC水3 μL、RNA模板2 μL、下游引物P2(10 μmol/L)0.5 μL,70 ℃保溫10 min,立刻放置于冰上冷卻2 min,再依次加入5×M-MLV Buffer 2 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL、M-MLV (200 U/μL) 0.25 μL、RNasin(40 U/μL) 0.25 μL。42 ℃保溫1 h,70 ℃ 15 min,4 ℃ 5 min,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系(25 μL):ddH2O 17 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 2 μL、cDNA 2 μL、上游引物P1(10 μmol/L) 0.5 μL、下游引物P2(10 μmol/L) 0.5 μL、Taq酶(TaKaRa)(5 U/μL) 0.5 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性3 min;循環(huán)參數(shù):94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像儀上觀察結(jié)果。

1.5CP基因序列測定及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后,與pMD18-T載體16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過菌液PCR篩選陽性克隆pMD18-ToCVCP,委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析,用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對分析,并采用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切陽性重組質(zhì)粒pMD18-ToCVCP和原核表達(dá)載體pET-32a(+)。然后在T4DNA 連接酶的作用下,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-ToCVCP,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌液PCR篩選陽性菌落,提取重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定后送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.7CP蛋白原核表達(dá)及SDS-PAGE分析

將重組質(zhì)粒pET32a-ToCVCP轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3),挑取單菌落,接種至含100 μg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中,37 ℃活化過夜,按1∶100比例接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 h,至OD600達(dá)到0.4～0.5時(shí),分別加入不同濃度的(0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)。8 000 r/min 離心2 min收集菌體,加入適量的ddH2O懸浮,通過SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)情況。

2　結(jié)果與分析

2.1ToCVCP基因擴(kuò)增及克隆

以總RNA為模板,利用特異性引物(P1/P2)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,得到了1條約774 bp 的特異性條帶(圖1)。將擴(kuò)增出的目的片段回收純化,與pMD18-T載體連接后委托上海生工公司測序。

1.陰性對照;2.RT-PCR 產(chǎn)物;M.DL2000 Marker。

2.2ToCVCP基因的序列分析

克隆得到的ToCV青島分離物CP基因(GenBank登錄號(hào):KT809400),片段全長774 bp,編碼257個(gè)氨基酸,分子量約28 kDa。其中含有 227個(gè)A、210個(gè)T、149個(gè)C、188個(gè)G,各堿基在CP基因中的百分比分別是29.3%,27.1%,19.3%,24.3%(圖2)。將獲得的ToCVCP基因序列,進(jìn)行Blast比對分析發(fā)現(xiàn),各分離物間核苷酸序列的同源性為97.2%～99.6%。利用DNAMAN 6.0軟件將ToCV青島分離物與33個(gè)標(biāo)明采集區(qū)域的ToCVCP基因序列分析對比后發(fā)現(xiàn),保守位點(diǎn)707個(gè),占全部位點(diǎn)的91.3%;變異位點(diǎn)67個(gè),占全部位點(diǎn)的8.7%;沒有缺失和插入。而且在整個(gè)開放閱讀框中,3′端的同源性要好于5′端(圖3)。將ToCV青島分離物CP基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn),同源性為97.3%～100.0%,保守位點(diǎn)227個(gè),占全部位點(diǎn)的88.3%;變異位點(diǎn)30個(gè),占全部位點(diǎn)的11.7%。結(jié)果表明,不同地理來源的番茄褪綠病毒的CP基因保守性較高。

經(jīng)Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，ToCV青島分離物CP基因核苷酸序列與GenBank中ToCV登錄號(hào)分別為KP335046.1、KP217196.1、KP137099.1、KP114534.1、KC887999.1、AB513443.1(分別表示中國、中國、韓國、韓國、中國、日本分離物)的同源率最高,達(dá)99.6%。與DQ136146.1(西班牙分離物)的同源率最低,為97.2%。氨基酸序列與GenBank中ToCV登錄號(hào)為YP293703.1(美國分離物)的同源性達(dá)100%。與AAZ77652.1(西班牙分離物)的同源率最低,為97.3%。采用MEGA 5.1軟件用Neighbour-joining方法構(gòu)建ToCVCP基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出,中國、日本、美國、巴西、以色列、希臘、韓國等分離物在一個(gè)分支上,而西班牙、法國等分離物在另一個(gè)大的分支上。青島地區(qū)分離物CP基因序列與中國、韓國、日本、美國距離較近,與巴西、以色列、希臘距離稍遠(yuǎn)。

圖2　ToCV CP基因核苷酸序列

2.3原核表達(dá)載體的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR鑒定后,得到了約為774 bp的特異性片段(圖5)?；厥占兓|(zhì)粒,用BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切陽性重組質(zhì)粒pET32a-ToCVCP,酶切片段大小也為774 bp目的片段(圖6),表明CP基因已連接至pET-32a(+)原核表達(dá)載體上。

圖3　不同ToCV分離物CP基因核苷酸序列5′端和3′端比對

圖4　ToCV青島分離物與其他分離物CP基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4體外誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

通過優(yōu)化原核表達(dá)誘導(dǎo)條件,結(jié)果表明,1.0 mmol/L IPTG、37 ℃誘導(dǎo)6 h,重組質(zhì)粒pET32a-ToCVCP在大腸桿菌Rosetta (DE3)菌株中的蛋白表達(dá)量最高。經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示,在約33 kDa處誘導(dǎo)出一個(gè)特異性的融合蛋白,與預(yù)期大小基本一致(圖7)。表明ToCVCP基因在Rosetta (DE3)菌株中得到了正確的表達(dá)。

M.DL2000標(biāo)記;1～4.PCR鑒定。

M.DL2000標(biāo)記;1.pET32a-ToCVCP重組質(zhì)粒；

M.蛋白質(zhì)Marker;1.IPTG誘導(dǎo)的重組載體;2.未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組載體;3.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體。

3　討論

病毒的外殼蛋白在寄主癥狀、病毒長距離和細(xì)胞間運(yùn)輸、病毒的介體傳播、病毒的免疫原性等方面起著重要的作用。Adams等[13]報(bào)道,病毒的CP基因核苷酸序列變異情況能夠反映出全基因組的變異情況。本試驗(yàn)利用RT-PCR方法成功克隆了ToCV的外殼蛋白基因,并在核酸水平進(jìn)行了分析鑒定。結(jié)果表明,該序列大小為774 bp,編碼257個(gè)氨基酸。ToCV病毒CP基因與 GenBank 中不同分離物核苷酸同源性為97.2%～99.6%,推導(dǎo)的氨基酸同源性為97.3%～100.0%,核苷酸保守位點(diǎn)占全部位點(diǎn)的91.3%。表明不同地理的番茄褪綠病毒的CP基因雖然存在差異,但整體有較高的保守性,且在整個(gè)開放閱讀框中,3′端的同源性要好于5′端。其推導(dǎo)的氨基酸序列也具有相似的結(jié)論。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明,ToCV青島地區(qū)分離物CP基因序列(GenBank登錄號(hào):KT809400)與中國、韓國、日本、美國等分離物的關(guān)系較近,說明該分離物或許源于上述國家。

血清學(xué)檢測技術(shù)仍然是目前病毒檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù),具有簡便、快速、批量檢測樣品等優(yōu)點(diǎn),其中制備高效價(jià)、特異性強(qiáng)的抗血清是關(guān)鍵的一步。傳統(tǒng)的方法是利用提純病毒粒子,以其作為抗原免疫動(dòng)物,獲得的抗血清中含有抗體。這種方法缺點(diǎn)是會(huì)引起非特異性反應(yīng),且大多數(shù)植物病毒粒子很難得到提純。ToCV病毒能通過粉虱進(jìn)行傳播,而且在植物寄主上還能與多種病毒復(fù)合侵染,因此，通過提純病毒粒子作為抗原制備抗體存在困難。目前,利用原核表達(dá)的方法,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)病毒外殼蛋白,以表達(dá)的融合蛋白作為抗原制備特異性抗體能達(dá)到很好的免疫效果[14]。Jacquemond等[15]成功應(yīng)用血清學(xué)的檢測技術(shù)檢測ToCV。近年來,國內(nèi)關(guān)于病毒檢測方面的報(bào)道,如蘋果莖溝病毒[16]、李矮縮病毒[17]、水稻黑條矮縮病毒[18]、番茄黑環(huán)病毒[19]、番茄黃化曲葉病毒[20]、黃瓜花葉病毒[21]、甘薯褪綠斑病毒[22],均采用了原核表達(dá)的方法獲得抗原制備抗血清,因此,本試驗(yàn)克隆ToCV外殼蛋白基因,成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體,以37 ℃、1.0 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)6 h條件下可獲得高效表達(dá)的外殼蛋白,為制備ToCV特異性抗血清及其血清學(xué)檢測的研究提供了參考依據(jù)。

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Cloning,Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Coat Protein Gene ofTomatochlorosisvirus

HAN Lei,CHI Shengqi,ZHANG Jianfeng

(College of Agronomy and Plant Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China)

In order to prepare the special antiserum ofTomatochlorosisvirus(ToCV),the total RNA of tomato leaves infected with ToCV were extracted.According to the coat protein gene of ToCV,specific primers were designed to amplify the coding region of coat protein by RT-PCR,the prokaryotic expression vector pET32a-ToCVCPwas constructed and the recombinant protein was expressed inE.coliRosetta (DE3).The results showed that the ToCVCPgene(NCBI:KT809400)owned 774 bp nucleotides,encoding 257 amino acids.The similarity of nucleotide and predicted protein were 97.2%-99.6% and 97.3%-100.0%,respectively,compared with theCPgene of other ToCV isolates registered in GenBank.The nucleotide sequence of conserved sites accounted for 91.3% of all loci,the amino acid sequence conserved sites accounted for 88.3% of all loci,indicated that the geographical origin of different ToCVCPgene had a relative higher conservative property.The ToCVCPgene was subcloned into the expression vector pET-32a(+) and the fusion protein was expressedinvitro.SDS-PAGE analysis showed that a specific recombinant protein of approximately 33 kDa was produced in the Rosetta (DE3) with the prokaryotic expression vector pET32a-ToCVCPin 37 ℃with 1.0 mmol/L IPTG for 6 hours.

Tomatochlorosisvirus;Coat protein gene;Prokaryotic expression;Gene cloning

2016-06-11

山東現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系薯類創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-10-011-06)

韓磊(1990-),男,山東棗莊人,在讀碩士,主要從事植物病理學(xué)研究。

遲勝起(1970-),男,山東海陽人,副教授,博士,主要從事植物病理學(xué)研究。

張劍峰(1964-),男,內(nèi)蒙古呼和浩特人,教授,博士,主要從事植物病理學(xué)研究。

Q78;S641.03

A

1000-7091(2016)04-0057-06

10.7668/hbnxb.2016.04.010