袁金海,劉自剛1,,孫萬倉1,,曾秀存,馬　驪,方　園,劉海卿,郭仁迪,王治江,陳　奇,王凱音,劉林波

(1.甘肅省油菜工程技術研究中心,甘肅 蘭州　730070;2.甘肅農業(yè)大學 農學院,甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室,甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州　730070;3.河西學院 農業(yè)與生物技術學院,甘肅 張掖　734000)

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白菜型冬油菜葉片質外體蛋白提取及響應低溫脅迫的蛋白表達分析

袁金海2,劉自剛1,2,孫萬倉1,2,曾秀存1,3,馬驪2,方園2,劉海卿2,郭仁迪2,王治江2,陳奇2,王凱音2,劉林波2

(1.甘肅省油菜工程技術研究中心,甘肅 蘭州730070;2.甘肅農業(yè)大學 農學院,甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室,甘肅省干旱生境作物學重點實驗室,甘肅 蘭州730070;3.河西學院 農業(yè)與生物技術學院,甘肅 張掖734000)

為了研究質外體蛋白在低溫脅迫下白菜型冬油菜抗寒的作用機理,以隴油7號五葉期葉片為試材,采用2種不同提取液(提取液A:0.1 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.2 mol/L KCl、1 mmol/L PMSF,提取液B:0.05 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA-Na2、0.02 mol/L Vc、1 mmol/L PMSF)進行質外體蛋白提取效果比較。結果表明:提取液A的蛋白提取率達到了(0.073±0.004 6)mg/g,比提取液B提高了42.88%;經(jīng)六磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)活性檢測,提取液A提取的蛋白質污染率較提取液B低0.91%;雙向電泳第一向等電聚焦IEF中,提取液A提取的蛋白質不僅除鹽時間較提取液B短4.5 h,且獲得的凝膠圖譜清晰;通過豐度計算,得到隴油7號低溫脅迫(4 ℃,48 h)后具有顯著差異的蛋白點339個,其中表達量變化在2倍以上的蛋白點為46個,包括上調表達蛋白點18個,下調表達蛋白點21個,特異性表達蛋白點7個,推測這些差異蛋白點可能與低溫脅迫有關。對特異表達的7個蛋白點進行質譜分析鑒定,得到與低溫脅迫相關的蛋白,為白菜型冬油菜超強抗寒品種隴油7號抗寒相關分子機理的研究奠定了基礎理論。

質外體;隴油7號;蛋白;雙向電泳

植物的質外體由細胞壁、細胞壁間隙中的液相和氣相空間組成,其主要組成部分是細胞壁。它是一個動態(tài)空間,其內包括許多重要的生理生化過程,如維持細胞內環(huán)境的動態(tài)平衡、信號的傳導、光合和呼吸代謝的氣體交換及抵御逆境脅迫等[1]。當植物體遭受不良環(huán)境的脅迫時,作為植物體的第一道天然屏障-質外體,為了響應逆境脅迫,從而激發(fā)質外體信號系統(tǒng)的表達,同時質外體作為植物細胞之間物質交換與能量轉換的通道,在整個植物體生長發(fā)育中起著重要的作用[2]。目前對植物質外體蛋白的研究主要集中在模式植物擬南芥上[3],另外在水稻[4]、燕麥[5]、小麥[6]、葡萄[7]、鷹嘴豆[8]等農作物上也有所涉及。Zhang等[9]以水為緩沖液提取了水稻幼苗根部質外體蛋白,經(jīng)雙向電泳凝膠圖譜分析,僅得到了100個左右的蛋白點；陳穎等[10]以醋酸鈉為緩沖液,提取了楊樹莖段質外體蛋白,凝膠結果顯示,蛋白斑點主要分布在低分子量、酸性區(qū)域；孫萬倉等[11]用EDTA-Na2作為提取液研究出了白菜型冬油菜根質外體抗凍蛋白的提取方法,經(jīng)前期試驗發(fā)現(xiàn)該方法并不適合于白菜型冬油菜葉片質外體蛋白的提取。我國北方寒旱區(qū)冬寒春旱,而白菜型冬油菜是該地區(qū)唯一能夠安全越冬的冬油菜類型。目前,對于白菜型冬油菜葉片質外體蛋白的研究鮮見報道。因此,研究質外體蛋白質對明確其在低溫脅迫反應中的響應機制及冬油菜的抗寒機理具有重要意義。本試驗對提取白菜型冬油菜葉片質外體蛋白質的方法及低溫脅迫前后差異蛋白的表達進行了研究,以期為尋找和鑒定一些與低溫脅迫密切相關的蛋白質提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1植物材料

以超強抗寒白菜型冬油菜品種隴油7號為供試材料。

1.2緩沖液

提取液A:0.1 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.2 mol/L KCl、1 mmol/L PMSF，提取液B:0.05 mol/L pH值=7.6 Tris-HCl、0.01 mol/L EDTA-Na2、0.02 mol/L Vc、1 mmol/L PMSF。

1.3試驗設計

選取籽粒飽滿、大小一致的油菜種子,用10%過氧化氫處理30 min后,用無菌水沖洗2～3次,置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿內進行催芽(光照14 h,30 ℃,黑暗10 h,28 ℃),相對濕度70%,待種子露白后,播種于裝有育苗基質的花盆(14 cm×13 cm)中,每盆4株幼苗,于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為:光照14 h,25 ℃,黑暗10 h,20 ℃),待幼苗長至五葉期時,將材料分為2份,一份繼續(xù)在上述條件下生長,作為對照(CK),另一份于光照14 h,4 ℃,黑暗10 h,4 ℃條件下進行低溫脅迫處理,連續(xù)處理48 h后,取樣,3 次重復。

1.4測定方法

1.4.1總蛋白的提取總蛋白提取采用TCA-丙酮沉淀法[12-14]。

1.4.2質外體蛋白的提取質外體蛋白的提取參照Smallwood等[15]和Zhu等[16]的提取方法(略改進)。

①稱取10 g新鮮油菜葉片,用預冷的ddH2O沖洗2次,濾紙吸干表面水分后,切成1 cm左右的長條,裝入錐形瓶,加入足夠預冷的提取緩沖液,抽真空到35 kPa[17],15 min后將壓強恢復到正常大氣壓水平,期間振蕩3～4次,直至材料完全下沉;②倒掉緩沖液,用濾紙吸干葉片表面的溶液后,將其放入30 mL注射器內,再將注射器放入50 mL離心管中,4 ℃,7 000 r/min離心20 min,收集離心管底部液體,即粗提液;③在粗提液中加入5倍體積預冷的丙酮,-20 ℃ 沉淀10～20 h,4 ℃,10 000 r/min離心30 min,傾去丙酮,用100%,80%的甲醇各洗滌1次,沉淀在-20 ℃揮發(fā),獲得凍干的蛋白質樣品。

1.4.3蛋白含量的測定Bradford[18]法測定蛋白質濃度,用牛血清蛋白做標準曲線,在UV-1600紫外分光光度計下測定595 nm處的OD值,根據(jù)標準曲線方程計算樣品蛋白濃度。

1.4.4G6PDH活性檢測參照陳穎等[10]的方法,通過測定細胞內六磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)活性來檢測質外體蛋白的污染率。

1.4.5蛋白質雙向電泳第1向等點聚焦(IEF)使用17 cm的IPG膠條,按照GE Healthcare雙向電泳操作手冊操作,樣品上樣量為900 μg[19],將樣品與水化液按體積比1∶4混勻,總體積為500 μL,按表1 程序進行,第2向采用濃度為12% 丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳,電泳結束經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后通過UMAX的Powerlook 2100XL掃描采集圖像,用PDQuest 8.0 分析軟件對凝膠圖譜標準化處理,蛋白質點匹配和檢測。

表1　等電聚焦電泳程序

1.4.6差異蛋白點的質譜鑒定對差異表達蛋白點回收、酶解[20],送往上海中科新生命生物科技有限公司進行質譜鑒定(MALDI-TOF-TOF MS)和數(shù)據(jù)庫檢索。

2　結果與分析

2.1兩種提取液對質外體蛋白質提取效率及污染率的影響

從圖1 可以看出,用KCl和EDTA-Na2作為緩沖液,蛋白質提取率分別為(0.073±0.004 6),(0.042±0.000 9) mg/g,與EDTA-Na2相比,KCl蛋白提取率提高了42.88%,提取效果更加明顯;由圖2可以看出KCl和EDTA-Na2蛋白提取液污染率分別為1.34%,2.25%,KCl提取緩沖液蛋白污染率較EDTA-Na2低0.91%,可見KCl適合作為白菜型冬油菜葉片質外體蛋白提取緩沖液。

圖1　兩種提取液對質外體蛋白提取率的影響

2.2兩種提取液對雙向電泳IEF和SDS-PAGE的影響

由圖3-4可以看出,與EDTA-Na2相比,用KCl提取的質外體蛋白鹽分較少,在第1向等電聚焦IEF過程中,EDTA-Na2提取的質外體蛋白經(jīng)過11.5 h才能去除樣品的鹽分,而KCl則需要7.0 h就已經(jīng)徹底的達到除鹽的目的,除鹽時間明顯短于EDTA-Na2。第2向SDS-PAGE過程中,KCl提取液對質外體蛋白提取更加充分,基本沒有條紋狀蛋白,且獲得的蛋白質斑點數(shù)、清晰度、低豐度蛋白的表達量都明顯優(yōu)于EDTA-Na2,表現(xiàn)出了更好的聚焦效果,得到較好的2-DE圖譜,有利于后續(xù)的分析研究。

圖2　兩種提取液對質外體蛋白污染率的影響

圖3　不同提取液對等電聚焦的影響

2.3離心轉速對質外體蛋白提取率及污染率的影響

由圖5可知,離心轉速在3 000～4 000 r/min時,蛋白質的提取率隨著離心轉速的增長而升高,4 000 r/min時蛋白質提取率達到最大,較初始離心轉速(3 000 r/min)高17.9%,繼續(xù)提高離心轉速,蛋白提取率沒有增加反而呈下降趨勢。由圖6可知,隨著離心轉速的提高,在3 500 r/min時,較初始離心轉速蛋白質的污染率幾乎沒有變化,之后繼續(xù)提高轉速,蛋白污染率陡然增大,其原因可能是隨著離心轉速的增大,細胞膜受到破壞,導致胞內蛋白被離心出來,質外體蛋白受到污染,雖然4 000 r/min時的蛋白提取率較3 500 r/min時高,但是污染率較高。綜合以上因素考慮,3 500 r/min為提取白菜型冬油菜葉片質外體蛋白的最佳離心轉速。

圖5　離心轉速對質外體蛋白提取率的影響

圖6　離心轉速對質外體蛋白污染率的影響

隨著離心時間的延長,蛋白提取率呈先增加后保持不變的趨勢(圖7),當離心時間為20 min時,蛋白提取率達到最高,質外體蛋白已基本離心徹底,而離心時間再延長,質外體蛋白提取率并不再升高。由圖8可知,在離心時間為15～25 min時,隨著離心時間的延長,蛋白污染率幾乎沒有變化,綜合對蛋白質提取率和污染率的影響比較，離心時間為20 min時,質外體蛋白提取效果最優(yōu)。

圖7　離心時間對質外體蛋白提取率的影響

圖8　離心時間對質外體蛋白污染率的影響

2.5低溫脅迫下白菜型冬油菜葉片質外體差異蛋白點的表達分析

使用PDQuest 8.0軟件分析2-DE圖(圖9),進行自動匹配,并結合肉眼觀察及手動調整,共檢測到339個發(fā)生了具有統(tǒng)計學顯著差異的豐度變化蛋白點,低溫脅迫前后,隴油7號葉片中蛋白點表達量變化在2倍以上的為46個,包括上調表達蛋白點18個，下調表達蛋白點21個，特異性表達蛋白點7個，從而說明油菜葉片能夠通過改變原有蛋白質的含量和性質來調節(jié)體內代謝的平衡，進一步提高機體抵御寒害的能力。低溫脅迫下,植株體內原有蛋白質的含量發(fā)生明顯變化,以適應逆境脅迫,其雙向電泳凝膠圖譜與常溫下不同,這意味著低溫脅迫影響油菜葉片可溶性蛋白質結構與組分的變化。當植物受到低溫脅迫的刺激時,就會誘導相關基因的啟動表達,導致合成一些新的蛋白質(圖9-B中點43～46、圖10),即誘導表達蛋白點;這表明在正常條件下這些蛋白豐度較低或不表達,而在低溫脅迫下才表達發(fā)揮功能,使植物體內發(fā)生一系列生理生化變化,進而使植物耐受或抵御低溫環(huán)境的脅迫。與此同時,低溫也會導致一些正?；虮磉_通路受阻,致使體內部分原有蛋白質表達受到抑制(圖9-A中點2，3，28、圖10),即抑制表達蛋白點。低溫脅迫下,相關基因的誘導表達和抑制,是植物對不良生存環(huán)境的適應性表現(xiàn),同時,對植物的耐逆性在一定程度起到了馴化的作用。

A.對照；B.低溫脅迫。

圖10　差異蛋白點局部放大圖(質變)

2.6差異表達蛋白質的質譜鑒定及功能分類

切取低溫脅迫前后抑制和誘導表達的7個蛋白點(圖10中2，3，28，43～46),用胰蛋白酶進行膠內酶解,進行MALDI-TOF-TOF MS質譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索(表2),最后成功鑒定5個蛋白點,蛋白點2，3可能由于蛋白質量少、數(shù)據(jù)庫不完整或樣品中蛋白質復雜度較高等原因未鑒定出結果。

表2　特異蛋白點MALDI-TOF-TOF MS質譜鑒定結果

3　討論

當前,質外體蛋白研究的瓶頸仍然是如何獲得高提取率和低污染率的蛋白樣品;質外體蛋白提取受提取液、壓強、離心力等諸多因素的影響,其提取的關鍵是最大程度的防止胞外蛋白受到胞內蛋白的污染且盡可能最大量地獲取胞外蛋白。因此,在提取過程中選擇質外體蛋白親和力高的提取緩沖液且保證細胞膜的完整性是提取質外體蛋白的核心所在。本試驗比較了2種不同提取液對白菜型冬油菜葉片質外體蛋白的提取效果,結果顯示KCl提取緩沖液對質外體蛋白的提取效果明顯優(yōu)于EDTA-Na2提取緩沖液,不僅蛋白提取率較高,而且污染率更低,據(jù)相關文獻報道[21],污染率低于1% 即可視為無明顯污染。KCl對質外體蛋白的提取效率的影響原因可能是其對質外體蛋白的溶解更加充分,據(jù)Angyal報道[22]鉀離子對酸性和中性的多糖具有較強的螯合能力,能夠以競爭的方式與質外體蛋白結合,從而更容易被KCl提取緩沖液洗脫下來,這與本試驗的結果類似。此外,在保證合適的壓強下,導致質外體蛋白污染的潛在因素是離心轉速過大或離心時間過長,高的離心轉速或長的離心時間都會破壞細胞膜的柔韌性,使其破裂。相反,則會顯著降低質外體蛋白提取率。由于白菜型冬油菜葉片中含有大量的酚類、醌類、多糖類、脂類和色素等植物次級代謝產(chǎn)物,所以選擇不同的提取液能夠導致最后蛋白點的差異。舒佳賓等[23]研究表明,樣品中的鹽分、水溶性有機物、大分子帶電基團等都會對聚焦過程造成影響。本試驗中,以KCl為緩沖液提取的質外體蛋白鹽分更少,蛋白純度更高,能夠更好地滿足雙向電泳所需的條件,為后續(xù)利用雙向電泳技術分析質外體蛋白質組學研究奠定了良好的基礎。

前人研究發(fā)現(xiàn),低溫脅迫下植物細胞會發(fā)生一系列生理生化反應來抵御冷害,如抗氧化酶系統(tǒng)活性的升高,可溶性蛋白、游離脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的積累,有機物質的再分配,細胞膜脂氧化反應的轉化及蛋白質表達變化等。本試驗發(fā)現(xiàn),低溫脅迫后,隴油7號葉片蛋白質組發(fā)生了明顯變化。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(蛋白點28)是植物光合作用過程中的關鍵酶,其活性與光合作用密切相關[24],本試驗發(fā)現(xiàn)該蛋白點在低溫脅迫后被抑制表達,說明低溫脅迫下,隴油7號葉片光合機構受損,進行光合作用的質子傳遞鏈受到破壞或中斷,導致光合磷酸化過程被抑制;果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(蛋白點43)是糖酵解和糖異生過程中的一個關鍵酶,該酶主要參與可溶性糖的合成及響應低溫脅迫誘導表達,可溶性糖作為滲透調節(jié)物質,一方面可以防止膠狀細胞質冷凝,避免形成的冰晶對細胞造成機械損傷;另一方面可以維持細胞內外滲透壓,提高組織含水量,降低細胞質的冰點,從而提高了隴油7號對低溫的耐受性;湯曉麗[25]在擬南芥的研究中通過表型分析及基因芯片檢測發(fā)現(xiàn),在低溫致死的突變體中,果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因的表達量都發(fā)生明顯的上調,孫得壬[26]研究發(fā)現(xiàn)，在一定閾值的低溫脅迫下，都會誘導不同小麥品種果糖-1,6-二磷酸醛縮酶基因的積極響應，表現(xiàn)出表達量的顯著上調，從而使得相應的蛋白質合成并不斷積累,這與本結果相同。巰基蛋白酶抑制劑(蛋白點44)具有保護細胞、組織及器官中蛋白質免遭外源蛋白水解酶水解的作用[27];此外,試驗結果表明蛋白水解酶抑制劑基因的超表達也能提高轉基因植物抗低溫、干旱等非生物脅迫能力。沙冬青作為我國西北重要的抗逆植物資源,Liu等[28]克隆到了沙冬青低溫誘導AmpI基因,經(jīng)鑒定屬于巰基蛋白酶抑制劑基因。類甜蛋白(蛋白點45)是一種具有多種生物學活性及重要功能的植物防御蛋白,植物受到生物或非生物脅迫時,類甜蛋白在植物組織中迅速表達并積累,從而快速提高植物抗性[29]。楊成麗等[30]研究發(fā)現(xiàn),冬黑麥葉片質外體在低溫誘導下分泌的類甜蛋白,其抗凍活性與抗凍蛋白相同?？共《镜鞍?蛋白點46),一方面能夠誘導植物病程相關蛋白的表達,此蛋白在低溫脅迫下不斷積累進而誘導植株獲得抗寒性[31];另一方面能夠誘導其他蛋白或物質的產(chǎn)生,使植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性,從而抵御外界脅迫對植株造成的傷害[32-33]。在低溫下隴油7號抗寒響應相關蛋白的表達與積累,可有效地防止低溫對細胞生理、結構的損傷,從而明顯地提高其抗寒能力。

在質外體溶液受原生質污染程度小于1%且盡量提取完全,雙向凝膠電泳圖譜清晰,蛋白點完全分離的前提下,白菜型冬油菜葉片質外體蛋白提取的最佳方法是以KCl為提取緩沖液,真空度35 kPa、真空滲透時間15 min、離心轉速3 500 r/min、離心時間20 min。同時,低溫脅迫下,相關蛋白組成的強大抗逆防御機制對維持隴油7號的生長發(fā)育具有重要的作用。

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Extraction of Winter Turnip Rape Leaf Apoplast and Analysis of Protein Expression in Response to Low Temperature Stress

YUAN Jinhai2,LIU Zigang1,2,SUN Wancang1,2,ZENG Xiucun1,3,MA Li2,FANG Yuan2,LIU Haiqing2,GUO Rendi2,WANG Zhijiang2,CHEN Qi2,WANG Kaiyin2,LIU Linbo2

(1.Gansu Engineering and Technology Research Center of Rapeseed,Lanzhou730070,China;2.Agronomy College,Gansu Agricultural University,Gansu Key Laboratory of Crop Improvement &Germplasm Enhancement,Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,Lanzhou730070,China;3.College of Agronomy and Biotechnology,Hexi University,Zhangye734000,China)

In order to explore the mechanism of super cold resistant varieties of Winter turnip rape,select super cold resistant varieties of Winter turnip rape Longyou No.7 leaves as materials,using two different extraction liquids(Extraction A:0.1 mol/L Tris-HCl (pH=7.6),0.2 mol/L KCl,1 mmol/L PMSF,Extraction B:0.05 mol/L Tris-HCl (pH=7.6),0.01 mol/L EDTA-Na2,0.02 mol/L Vc,1 mmol/L PMSF) to compare the extracted effect.The experiment showed that the extraction A liquid protein yield reached (0.073±0.004 6) mg/g,and the extraction ratio increased by 42.88% compared to liquid B.Through the Glucose-6-phosphate dehydrogenize (G6PDH) activity detection and the extraction A was lower than B 0.91 percent;not only the extraction A extract protein was shorter than B 4.5 hours in the first oelectric focusing electrophoresis of two-dimensional electrophoresis,but also was get clear gel map;through the calculation of abundance,there were total 339 differentially expressed proteins discovered in Longyou No.7 under low temperature stress(4 ℃,48 h)later,changes in expression levels of more than two times the protein spots of 46,which 18 up-regulated protein expression spots,21 down-regulated protein expression spots,7 specific protein expression spots,these differential protein spots were suggested to be related to low temperature stress.This laid the foundation for the research of cold resistant varieties in Winter turnip rape Longyou No.7 proteomics aspect.

Apoplast;Longyou No.7;Protein;Two-dimensional electrophoresis

2016-03-12

國家“863”高技術研究發(fā)展計劃項目(2011AA10A104);國家自然科學基金項目(31460356);國家“973”計劃項目(2015CB150206);國家農業(yè)科技成果轉化項目(2014G10000317);國家自然基金項目(31560397);甘肅省自然基金項目(145RJZG050)

袁金海(1988-),男,甘肅靖遠人,在讀碩士,主要從事油菜遺傳育種研究。

劉自剛(1975-),男,甘肅天水人,副教授,博士,主要從事油菜遺傳育種研究。

Q945.78;Q946

A

1000-7091(2016)04-0044-07

10.7668/hbnxb.2016.04.008