劉嘉敏，任　彤，王　佳，徐　承，賈安琴

(渭南師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，陜西 渭南 714099)

?

【蓓蕾園地】

小鼠肝癌合并肝纖維化模型的構(gòu)建
——四氯化碳和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)

劉嘉敏，任彤，王佳，徐承，賈安琴

(渭南師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，陜西 渭南 714099)

研究四氯化碳聯(lián)合二乙基亞硝胺誘導(dǎo)小鼠肝癌合并肝纖維化模型的建立。選小鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組每周兩次腹腔注射15%的CCl4/花生油溶液，同時(shí)自由飲用1‰的二乙基亞硝胺(DEN)連續(xù)進(jìn)行8周。對(duì)照組注射花生油，飲用蒸餾水。于處理后第3、6、8周處死實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠各4只，對(duì)其肝臟組織進(jìn)行常規(guī)固定、包埋、切片、HE染色，觀察肝臟的形態(tài)及變化。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠體重差異顯著(P<0.05)，四氯化碳和二乙基亞硝胺能顯著改變肝臟形態(tài)，使肝臟膠原纖維明顯增生，肝星狀細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞變長(zhǎng)并分泌膠原，最終導(dǎo)致肝癌的形成。CCl4聯(lián)合DEN誘導(dǎo)可成功建立小鼠肝癌并合并肝纖維化的模型。

四氯化碳；二乙基亞硝胺；肝臟

0　引言

四氯化碳(CCl4)是一種無(wú)色澄清透明油狀液體，具芳香性，易揮發(fā)，是典型的肝臟毒物，攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收可能致死，接觸可引起肝、腎損害。[1]低濃度長(zhǎng)期接觸則主要表現(xiàn)肝、腎受累,較小劑量的長(zhǎng)期暴露也可能增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)，通常以CCl4來(lái)建立肝纖維化的模型。二乙基亞硝胺(DEN)是一種黃色透明的液體，具有極強(qiáng)的刺激氣味，攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收可能致死，接觸可引起肝、腎損害，較小劑量的長(zhǎng)期暴露也可能增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)。低濃度的DEN可建立穩(wěn)定的肝硬化小鼠模型[2]，其過(guò)程與人肝硬化的發(fā)生過(guò)程相似，且其肝硬化發(fā)生率高，死亡率低，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，便于進(jìn)行藥物干預(yù)和療效分析。劉東璞[3]等人研究采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型的建立，匡志鵬采用二乙基亞硝胺、CCl4、乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)了小鼠肝癌，中間經(jīng)歷肝炎、肝硬化階段，建立了較為理想的動(dòng)物肝癌模型。而CCl4聯(lián)合DEN這兩種物質(zhì)都是誘導(dǎo)肝癌的重要物質(zhì)，是制造肝損傷及研究肝纖維化的有利模型。故將二者結(jié)合進(jìn)行誘導(dǎo)，具有高轉(zhuǎn)移率、高存活率、高浸潤(rùn)率等特點(diǎn)，且周期短、易行、簡(jiǎn)便、成功率高。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性小白鼠24只(購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué))，體重為20～25 g，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并觀察其生理形態(tài)特征。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

四氯化碳(購(gòu)于比特博公司)、二乙基亞硝胺(購(gòu)于sigma公司)、NaCl、10%福爾馬林溶液、乙醇、二甲苯、石蠟、三氯化鐵、酸性品紅、甘油、蒸餾水、蘇木素、鹽酸、苦味酸飽和溶液、鹽酸乙醇、伊紅、中性樹(shù)膠等。

1.1.3實(shí)驗(yàn)器材

光學(xué)顯微鏡、生物組織切片機(jī)、移液槍、1mL注射針管、電子分析天平、切片刀、石蠟(熔點(diǎn)56℃～58℃)、照相機(jī)、天平、恒溫培養(yǎng)箱。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

雄性鼠24只，實(shí)驗(yàn)前先觀察一周，后隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組2組，每組12只，將這兩組同條件分籠飼養(yǎng)。

1.2.2操作方法(模型的建立)

在無(wú)菌操作臺(tái)上，于每周兩次對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行腹腔注射15%的CCl4花生油溶液(CCl4∶花生油為3∶7)，每只小鼠每次劑量為0.2 mL，同時(shí)每天用1‰DEN溶液(純凈水配制而成)喂養(yǎng)小鼠。對(duì)照組注射花生油溶液，劑量與實(shí)驗(yàn)組相同，同時(shí)用蒸餾水喂養(yǎng)。

1.2.3活體觀察

觀察小鼠的食量及飲水情況，每周稱(chēng)量小鼠的體重且觀察其行為，并作記錄。

1.2.4解剖形態(tài)觀察與組織切片染色

在實(shí)驗(yàn)第3、6、8周分別麻醉處死每組小鼠中的4只并解剖，之后觀察小鼠的肝臟形態(tài)。用生理鹽水反復(fù)洗滌肝臟組織以除去殘留的血液，迅速剪碎然后用10%福爾馬林溶液對(duì)組織固定1～2天，并進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，石蠟包埋后切成6 μm厚的切片；切片后再進(jìn)一步經(jīng)過(guò)脫蠟、復(fù)水、HE染色等，樹(shù)膠封片后于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5用Van Gieson(V.G)染色法檢測(cè)小鼠組織中的膠原纖維細(xì)胞

將切片脫蠟至水，用Weigert氏蘇木素染20 min，進(jìn)行水洗，流水沖洗10 min，用Van Gieson氏染液1 min，用95%酒精快速分化，無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，封片觀察。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用3個(gè)獨(dú)立樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來(lái)表示，結(jié)果用雙樣本方差t檢驗(yàn)來(lái)分析不同組之間的差異顯著性，顯著水平定為P<0.05。所有結(jié)果通過(guò)EXCEL統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件來(lái)完成。

2　結(jié)果

2.1小鼠體重變化

圖1　小鼠平均體重的變化

從注射藥物第3周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)組小鼠食量明顯減少，飲水減少，體重增加程度明顯小于對(duì)照組，于第6周表現(xiàn)顯著差異，第8周表現(xiàn)極顯著差異。實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增長(zhǎng)緩慢，甚至有些小鼠體重有下降現(xiàn)象，對(duì)照組小鼠體重增加幅度快，體重一直在上升(如圖1所示)。

2.2肝臟大體形態(tài)觀察

解剖小鼠后觀察，對(duì)照組小鼠肝臟表面光滑，而實(shí)驗(yàn)組肝臟表面充血顏色晦暗局部有腫瘤塊，隨著時(shí)間的推移愈加粗糙，并有腫瘤發(fā)生(如圖2所示)。

對(duì)照組

實(shí)驗(yàn)組第8周

2.3小鼠肝臟系數(shù)的測(cè)定

小鼠經(jīng)脫頸椎方法處死后，解剖并暴露出完整的肝臟，在天平上稱(chēng)量全肝臟的濕質(zhì)量，按下列公式計(jì)算肝臟系數(shù)：肝臟指數(shù)=臟器重量/體重×100(見(jiàn)表1)。

表1　CCl4聯(lián)合DEN處理對(duì)小鼠體重與肝臟系數(shù)的影響

數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，P表示t檢驗(yàn)結(jié)果的可信度，顯著性與極顯著性水平定為P<0.05、P<0.01。

2.4HE染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰(圖3A)，大多肝細(xì)胞為多核，肝板呈索狀；經(jīng)藥物處理過(guò)的小鼠肝組織中可見(jiàn)：第3周(圖3B)病變組織較少，第6周(圖3C)病變組織逐漸變多，第8周(圖3D)病變肝組織面積大，排列混亂不清晰，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，形成假小葉[2]。

：正常肝細(xì)胞　　?。翰∽兏渭?xì)胞圖3　CCl4聯(lián)合DEN處理不同時(shí)間肝臟組織形態(tài)觀察(放大倍數(shù)：400 x)A：對(duì)照組；B：處理第3周組；C：處理第6周組；D：處理第8周組

2.5 V.G染色法檢測(cè)肝臟組織中的膠原纖維

在顯微鏡中觀察得知，經(jīng)四氯化碳和二乙基亞硝胺處理的肝臟組織塊內(nèi)聚集的膠原纖維大量增多，肝星狀細(xì)胞數(shù)量增多并且呈纖維化(如圖4所示)。

：膠原纖維細(xì)胞　　?。焊涡菭罴?xì)胞圖4　CCl4聯(lián)合DEN處理后肝臟組織膠原纖維觀察(放大倍數(shù)：400 x)A：對(duì)照組；B：處理第8周

3　討論

我國(guó)是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，肝硬化的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),肝損傷的最初表現(xiàn)是發(fā)生纖維化，肝纖維化是許多肝臟疾病的中間發(fā)展環(huán)節(jié)[4-5]，最終會(huì)發(fā)展為肝硬化至肝癌，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。因此，抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，對(duì)治療各種肝病具有極為重要的臨床意義。

肝纖維化是在損傷因子(如病毒、黃曲霉素、代謝病和酒精等)存在下，肝細(xì)胞持續(xù)性受損、變性、壞死并導(dǎo)致炎性反應(yīng)，在炎性環(huán)境中產(chǎn)生的氧自由基等誘變物質(zhì)引起肝細(xì)胞損傷，損傷的肝細(xì)胞應(yīng)答旁分泌細(xì)胞因子的刺激而增殖，這種不斷損傷、再生誘發(fā)的多基因變異是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵。

在類(lèi)似肝癌模型中,盡管CCl4在誘發(fā)肝癌的過(guò)程中亦可以出現(xiàn)很明顯也很典型的肝硬化,但是出現(xiàn)的肝癌種類(lèi)復(fù)雜,誘癌周期長(zhǎng)。[6]本研究采用CCl4聯(lián)合DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌合并纖維化，周期短、易行、簡(jiǎn)便、成功率高，是一種研究人體肝癌的理想模型。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)藥物處理的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，大多肝細(xì)胞為多核，肝細(xì)胞呈條索狀[7]，經(jīng)藥物處理過(guò)的小鼠在HE染色中可見(jiàn)肝組織病變區(qū)域多，面積大，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，形成假小葉。用V.G法觀察得知，未經(jīng)藥物處理的小鼠膠原纖維數(shù)量少，多分布在血細(xì)胞周?chē)g質(zhì)細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞數(shù)量少細(xì)胞個(gè)體體積小，經(jīng)藥物處理的小鼠細(xì)胞膠原纖維數(shù)量增多，大多發(fā)生在病變組織內(nèi)，表明本研究成功構(gòu)建了肝纖維化小鼠肝癌并合并纖維化模型。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)小鼠腹腔注射15%四氯化碳聯(lián)合飲用1‰二乙基亞硝胺溶液使小鼠染毒，實(shí)驗(yàn)成功地建立了小鼠肝癌并合并纖維化模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做了鋪墊，也為深入研究治療肝癌的機(jī)理提供了動(dòng)物模型。

(指導(dǎo)教師李亞琳)

[1] 孔娜,匡志鵬,楊帆,等. Axin-1在C57BL/6J小鼠肝癌模型發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)癌癥防治雜志，2014，(1)：7-11.

[2] 蘇普·吐?tīng)栠d,哈木拉提,阿不都卡德?tīng)枴?kù)爾班,等. 二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝硬化模型的建立及病理學(xué)研究[J]. 新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，(3):261-264.

[3] 劉東璞,盧鳳美,張輝,等.四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2009，32(4):14-15.

[4] 李亞琳.氣體甲醛吸入對(duì)小鼠肝組織的毒性作用[J].家庭心理醫(yī)生，2014，(2):11-13.

[5] 呂鵬.四氯化碳腹腔注射制備肝纖維化模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].胃腸病學(xué)和肝病雜志，2003，12(4):339-340.

[6] 周崢珍,章宗籍,錢(qián)忠義,等.DEN誘發(fā)大鼠肝癌模型的實(shí)驗(yàn)病理研究[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005，(3):15-19.

[7] 劉東璞,趙振富,盧鳳美,等.復(fù)方紅景天防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].解剖學(xué)研究，2008，(5)：340-343.

【責(zé)任編輯馬小俠】

Establishing a Mice Model Fhepatic Fibrosis Induced by the CCL4and DEN

LIU Jia-min,REN Tong,WANG Jia,XU Cheng,JIA An-qin

(School of Chemistry and Environment,Weinan Normal University,Weinan 714099,China)

The mice is taken as research materials to study the liver cancer and liver fibrosis in them when they were injected CCl4and DEN at the same time. Kunming mouse were randomly divided into two groups. The experimental groups were injected by 15% CCl4/ peanut oil solution intraperitoneally two times a week for eight weeks,meanwhile,drinking 1‰ DEN water solution freely. The control group was injected peanutoil,drinking purified water. Both experimental group and control group were killed at the 3,6 and 8 weeks respectively and were stained by HE dyeing,to observe the changes of liver structure and the number of sperm. The results show that the CCl4and DEN can significantly change the liver morphology. In the end,the liver collagen fiber was obviously proliferated,the amount of hepatic stellate cells were increased,and cells became longer and secreted collagen,which led the liver to become fibrosis and eventually caused the formation of liver cancer. The results showed that the CCl4and DEN can significantly change the liver morphology.

carbon tetrachloride (CCl4); diethylnitrosamine (DEN); liver

R735.7

A

1009-5128(2016)12-0088-05

2015-12-23

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目：肝纖維化模型形成機(jī)制的探索研究——以四氯化碳和二乙基亞硝胺誘導(dǎo)小鼠肝癌為例(201410723016)

劉嘉敏(1993—)，女，河北無(wú)極人，渭南師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境學(xué)院2011級(jí)本科生。