李學濤，唐　煒，姜　英，程　嵐#

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連　116600；2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心，山東臨沂　276001）

·實驗研究·

轉鐵蛋白修飾長春新堿-粉防己堿脂質體中主藥含量及包封率的測定Δ

李學濤1＊，唐煒2，姜英1，程嵐1#

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.臨沂市食品藥品檢驗檢測中心，山東臨沂276001）

目的：建立轉鐵蛋白修飾長春新堿-粉防己堿脂質體中主藥含量及脂質體包封率的測定方法。方法：采用高效液相色譜法測定長春新堿含量，色譜柱為依利特C18，流動相為甲醇-15%三乙胺水溶液（70∶30），流速為1.0 ml/min，檢測波長為297 nm，柱溫為30℃，進樣量為20μl；采用葡聚糖凝膠柱色譜法分離脂質體與游離藥物，計算包封率。結果：長春新堿檢測質量濃度為160～1 600 μg/ml（r=0.999 8，n=5），平均加樣回收率為99.20%（RSD=0.26%，n=9），精密度RSD為0.070%（n=5）。脂質體中長春新堿的平均含量為0.790 mg/ml（RSD=0.15%，n=3），平均包封率為85.94%（RSD=2.08%，n=3）。結論：該方法準確可靠、簡單快速，可用于轉鐵蛋白修飾長春新堿-粉防己堿脂質體中長春新堿的含量及包封率測定。

長春新堿；粉防己堿；轉鐵蛋白；脂質體；含量測定；包封率；高效液相色譜法

長春新堿（Vincristine，VCR）是一種由夾竹桃科長春花屬植物長春花中提取的一種生物堿，是一種有絲分裂抑制劑，可使細胞停止在有絲分裂中期，同時還可與微管蛋白結合以抑制細胞的生物活性。作為一種細胞周期特異性藥物，長春新堿被廣泛用于臨床化療過程中，其對急性淋巴細胞性白血病、霍奇金病、淋巴肉瘤、網狀細胞肉瘤和乳腺癌的治療效果顯著［1］。但長春新堿存在半衰期短、代謝快、神經系統(tǒng)和胃腸道毒性強等缺點［2-3］。脂質體作為抗腫瘤藥物的常用載體，可改善藥物理化性質、提高藥物穩(wěn)定性、降低藥物的毒副作用［4］。轉鐵蛋白（TF）是血漿中主要的含鐵蛋白質，負責運載由消化管吸收的鐵和由紅細胞降解釋放的鐵。腫瘤細胞表面的TF受體表達遠高于正常細胞（約2～10倍），TF與某些抗腫瘤藥物結合，可使藥物定向轉移至腫瘤部位，減少血腦屏障及避免藥物快速分解等［5-6］。粉防己堿是從中藥防己中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿［7］，是粉防己的主要活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降壓及阻斷鈣通道等廣泛的藥理作用。作為一種天然的鈣離子拮抗藥，粉防己堿能夠逆轉多種腫瘤細胞的多藥耐藥性，且具有高效、低毒的特點［8-9］。為了增強藥物的靶向性、延長藥物體內滯留時間、增強療效、降低毒副作用，課題組以長春新堿為主藥，以粉防己堿為輔藥，采用脂質體將二藥包裹在其中，再在其表面修飾TF，期望增加脂質體的主動靶向性能并降低腫瘤細胞的多藥耐藥性。筆者以高效液相色譜（HPLC）法測定該修飾脂質體中長春新堿的含量，并通過葡聚糖凝膠法分離測定脂質體中藥物的包封率，報道如下。

1　材料

1.1儀器

20AT液相色譜儀，包括UV檢測器、色譜工作站（日本島津公司）；LF-1脂質體擠出儀（加拿大奧維斯丁公司）。

1.2藥品與試劑

硫酸長春新堿原料藥、粉防己堿原料藥（大連美侖生物技術有限公司，批號：M0423AS、MB6635，純度均為：98.2%）；卵磷脂（EPC，日本NOF公司，批號：120015）；聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE）、PEG2000-DSPE-N-羥基琥珀酰亞胺（PEG2000-DSPE-NHS）（日本精化株式會社，批號：B10206、B11011）；膽固醇（Chol，上海普邁生物科技有限公司，批號：8280100）；TF原料藥（北京索萊寶科技有限公司，批號：1015567，純度：大于90%）；葡聚糖凝膠（Sephadex）G-50（上海華藍化學科技有限公司）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2　方法與結果

2.1TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體的制備

按照處方比例分別精密稱取卵磷脂、膽固醇、PEG2000-DSPE、PEG2000-DSPE-NHS和粉防己堿，加10 ml氯仿超聲使溶解，于40℃水浴中旋轉蒸發(fā)（60 r/min）除去氯仿，加入250 mmol/L（NH4）2SO4溶液5 ml水化，水化后的混懸液超聲10 min（超聲時間為10 s，間歇時間為10 s，功率為200 W），超聲后脂質體溶液依次通過孔徑為400、200 nm的聚碳酯膜各2次。將過膜后的脂質體裝入透析袋（截留分子質量：10 000～12 000）中，置于pH 7.6磷酸鹽緩沖液（PBS）中透析24 h，每8 h更換1次透析液。透析后的脂質體加入TF 2 mg，室溫磁力攪拌反應2 h，即得空白脂質體。將上述空白脂質體與適量的長春新堿混合，于40℃水浴振搖30 min，即得。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：依利特C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-三乙胺水溶液（取三乙胺15 ml加水985 ml，混勻）（70∶30），流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃，檢測波長：297 nm；進樣量：20μl。理論板數(shù)以長春新堿計不得低于3 000。取長春新堿空白脂質體溶液、對照品溶液、供試品溶液進樣分析，記錄色譜。結果，長春新堿的保留時間約為9.864 min，空白脂質體對長春新堿色譜峰測定無干擾，色譜圖見圖1。

圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatograms

2.3溶液的制備

2.3.1供試品溶液的制備精密量取脂質體樣品1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲破乳，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液備用。

2.3.2對照品溶液的制備精密稱取長春新堿對照品16.00 mg，置于10 ml量瓶中，加流動相定容至刻度，得質量濃度為1.60 mg/ml的對照品溶液。將該對照品溶液依次稀釋成質量濃度為1 600、1 200、800、400、160 μg/ml的系列對照品溶液。

2.3.3空白溶液的制備按“2.1”項下的方法制備空白脂質體，再按“2.3.1”項下方法制備空白溶液，即得。

2.4線性關系考察

取“2.3.2”項下系列對照品溶液按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以長春新堿質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y=1 005.9x-9 388.4（r=0.999 8，n=5）。結果表明，長春新堿檢測質量濃度在160～1 600 μg/ml范圍內線性關系良好，定量限為160 μg/ml。

2.5精密度試驗

取質量濃度為160 μg/ml的對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次測定。結果，長春新堿峰面積的RSD= 0.070%（n=5），表明儀器的精密度良好。

2.6重復性試驗

取同一供試品溶液，平行操作6份，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。結果，長春新堿峰面積的RSD=0.072%（n=6），表明方法重復性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。結果，長春新堿峰面積的RSD=0.097%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.8回收率試驗

精密稱取TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體樣品0.5 ml，共9份，分別加入質量濃度為400 μg/ml的對照品溶液適量，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，定容得高、中、低質量濃度的溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后，精密吸取20 μl，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄長春新堿峰面積，計算加樣回收率，結果見表1。

表1　回收率試驗結果Tab 1　Results of recovery tests

2.9含量測定

取3批TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體樣品，每批各3份，各精密量取1.0 ml，按“2.3.1”項下方法制備成供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算長春新堿的含量。結果，3批樣品中長春新堿的平均含量分別為0.791、0.790、0.790 mg/ml，平均值為0.790 mg/ml，RSD分別為0.18%、0.09%、0.18%，平均值為0.15%（n=3）。

2.10脂質體包封率的測定

2.10.1洗脫曲線的繪制［10］稱取葡聚糖凝膠G-50 2.0 g，置于pH 7.6 PBS中浸泡24 h，濕法裝柱。精密吸取TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體0.5 ml，加入長春新堿對照品0.2 mg，混勻，加至凝膠柱（1.0 cm×12 cm）上方，以pH 7.6 PBS進行洗脫，流速為1.0 ml/min，每份1 ml，共收集20份。從20份收集液中分別吸取0.5 ml，加入0.5 ml甲醇，混勻，超聲破乳，按“2.2”項下色譜條件進樣，測定長春新堿的含量。以管數(shù)為橫坐標、長春新堿含量為縱坐標，繪制曲線，見圖2。

圖2　長春新堿洗脫時的含量-管數(shù)曲線Fig 2　Content-tube curve of vincristine in elution

由圖2可知，脂質體和游離長春新堿可以完全分離，第3～8管為含藥脂質體，第9～19管為游離長春新堿。

2.10.2包封率的測定取3批TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體，各3份，精密吸取脂質體0.5 ml，按“2.10.1”項下方法操作，收集脂質體部分并加甲醇破乳，定容至5 ml，0.45 μm微孔濾膜過濾。取濾液20 μl測定脂質體中長春新堿的含量，計算脂質體的包封率=M總+M加入-M游離/M總×100%，式中，M總為脂質體中的長春新堿總量，M加入為洗脫時加入的長春新堿的量，M游離為游離長春新堿的量。結果，3批樣品中長春新堿的包封率分別為85.63%、86.81%、85.38%，平均值為85.94%，RSD分別為2.83%、1.02%、2.39%，平均值為2.08%（n=3）。

3　討論

近幾十年來，隨著對腫瘤認知水平的不斷提高，臨床上越來越多的藥物可以應用于癌癥的早期診斷和治療。但是，這些藥物并沒有給患者帶來滿意的治療效果。其主要原因之一就是在治療過程中不能將這些化療藥物成功地運送至患者的病變部位，從而無法在保證療效的前提下最大程度地降低化療藥物的毒副作用。

脂質體是由脂質雙分子層構成的內部為水溶性的封閉囊泡。由于脂質體本身所具有的機體親和性能、腫瘤組織靶向性，使脂質體制劑在癌癥治療方面受到越來越多的關注。但是傳統(tǒng)的脂質體進入體循環(huán)系統(tǒng)后很容易被血漿蛋白通過網狀內皮系統(tǒng)（Reticulo endothelial system，RES）快速清除［11］。為了能夠使這些微粒逃脫RES系統(tǒng)的識別和清除，可以在脂質體的表面修飾一層“保護膜”，例如經過PEG親水基修飾的脂質體不僅可以延長脂質體在體循環(huán)停留時間，更重要的是可以通過被動或主動靶向使藥物在腫瘤部位蓄積，提高藥物的治療指數(shù)。本試驗中，PEG2000-DSPE作為脂質體的親水基修飾材料，可以通過阻礙脂質體與apoA-1的結合，降低RES對脂質體的親和力，而達到延長藥效、提高靶向的目的。PEG2000-DSPE-NHS是一種常用的功能化磷脂材料，在該分子中-NHS作為活潑基團可以通過?；磻cTF中的胺基結合，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將TF修飾在磷脂材料的一端，可以充分發(fā)揮TF的主動靶向親和作用。

包封率是評價脂質體制劑質量的重要指標，也是脂質體能否發(fā)揮高效、低毒優(yōu)勢的關鍵［12］。影響脂質體中藥物包封率的主要因素為藥物的性質及濃度，脂溶性或水溶性強的藥物可制備成具有較好包封率的脂質體［13］。脂質體包封率一般是將游離藥物與載藥脂質體分離后再進行測定［14］。常用的分離方法有凝膠柱層析法、離心法、微柱離心法、透析法、超濾離心法等［15］。其中凝膠柱色譜法具有分子篩作用，能使混合物依據(jù)分子大小不同而分離，廣泛用于脂質體的分離及包封率的測定。葡聚糖凝膠色譜法分離條件較穩(wěn)定，凝膠柱可重復利用［16］。在預試驗中筆者使用凝膠柱色譜法分離長春新堿而繪制洗脫曲線時發(fā)現(xiàn)，單獨用脂質體進行洗脫繪制曲線時，由于脂質體中長春新堿的包封率較高從而導致洗脫曲線中的游離藥物部分不明顯，無法從洗脫曲線中清楚地分析出被包封和游離的長春新堿。所以筆者在正式試驗過程中往脂質體中加入了一定量的游離長春新堿，可以使得包封在脂質體中的藥物與游離的藥物在洗脫曲線中所圍成的曲線下面積大小相似，以便更好地滿足葡聚糖凝膠色譜法的操作要求。

本研究建立的HPLC法準確可靠、簡單快速、重復性好，采用葡聚糖凝膠柱分離效果較好，可用于該脂質體包封率的測定。建立的測定TF修飾長春新堿-粉防己堿脂質體含量的方法操作簡單、快捷，有利于提高和控制藥品質量。

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（編輯：鄒麗娟）

Determination of Content and Entrapment Efficiency of Transferrin Modified Vincristine-Tetrandrine Liposomes

LI Xuetao1，TANG Wei2，JIANG Ying1，CHENG Lan1
（1.School of Pharmacy，Liaoning University of TCM，Liaoning Dalian 116600，China；2.Linyi Center for Food and Drug Control，Shandong Linyi 276001，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the determination of main components content and entrapment efficiency of transferrin modified vincristine-tetrandrine liposomes.METHODS：HPLC method was adopted to determine the content of vincristine.The determination was performed on ELITE C18column with mobile phase consisted of methanol-15%triethylamine（70∶30）at a flow rate of 1.0 ml/min.The determination wavelength was set at 297 nm and column temperature was 30℃.The sample size was 20μl.Free drug was isolated from liposomes by dextran gel column chromatography，and entrapment efficiency was determined.RESULTS：The linear range of vincristine was 160-1 600 μg/ml（r=0.999 8，n=5）with average recovery of 99.20% （RSD=0.26%，n=9）.RSD of precision test was 0.070%（n=5）.The average content of vincristine in liposomes was 0.790 mg/ml（RSD=0.15%，n=3），and the average entrapment efficiency was 85.94%（RSD=2.08%，n=3）.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple and rapid，and can be used for the determination of the content and entrapment efficiency of vincristine in transferrin modified vincristine-tetrandrine liposomes.

Vincristine；Tetrandrine；Transferrin；Liposomes；Content determination；Entrapment efficiency；HPLC

R979.1；R927

A

1001-0408（2016）22-3034-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.04

國家自然科學基金資助項目（No.81541081）；遼寧省科學技術計劃項目（No.2014020046）；遼寧省教育廳重點實驗室基礎研究項目（No.LZ2015053）

＊副教授，博士。研究方向：藥物新型給藥系統(tǒng)。電話：0411-89850170。E-mail：lixuetao1979@163.com

教授，博士。研究方向：藥物新型給藥系統(tǒng)。電話：0411-89850145。E-mail：sychenglan@163.com

2015-11-24

2015-12-29）