吳旖，趙斌，江仁望

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

·中藥工業(yè)·

百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量標準研究△

吳旖1,2*，趙斌1,2*，江仁望3

(1.中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山 528436；2.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山 528436；3.暨南大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的：建立百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制標準。方法：采用薄層色譜法對百部總生物堿緩釋片中對葉百部堿進行定性鑒別，采用固相萃取-高效液相-蒸發(fā)光檢測法建立百部總生物堿緩釋片中對葉百部堿的含量測定方法，并測定其體外釋放度。采用蒸發(fā)光散射檢測器，色譜柱為Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為25 ℃；進樣量為30 μL；ELSD參數(shù)為漂移管溫度97 ℃、空氣流速為3 mL·min-1。結(jié)果：本品定性鑒別薄層色譜特征明顯，專屬性強。對葉百部堿的質(zhì)量濃度為0.02～0.30 mg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.86%，百部總生物堿緩釋片在2、8、12 h的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%，均符合規(guī)定。結(jié)論：該分析方法簡單、快速、準確、具有代表性，可作為百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制方法。

百部；總生物堿；緩釋片；高效液相色譜法；體外釋放度

百部是一味具有鎮(zhèn)咳活性的傳統(tǒng)中藥，始載于公元500年左右陶景洪編纂的《名醫(yī)別錄》?，F(xiàn)在，百部仍然是鎮(zhèn)咳復(fù)方中的常用中藥。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2010年版一部收載[1]，百部為百部科植物直立百部Stemonasessilifolia(Miq)Miq.、蔓生百部Stemonajaponica(BL.)Miq.或?qū)θ~百部StemonatuberosaLour.的干燥塊根。前期研究發(fā)現(xiàn)，百部生物堿是百部主要的鎮(zhèn)咳活性成分[2]，鎮(zhèn)咳有效部位BB-1(為總生物堿且不含金大剛堿等小毒成分)具有顯著的鎮(zhèn)咳活性[3]，與傳統(tǒng)鎮(zhèn)咳藥相比，其可針對咳嗽的多種原因進行鎮(zhèn)咳，具有高效、低毒的優(yōu)勢。目前，國內(nèi)外對百部總生物堿藥物制劑的研究未見文獻報道，本研究在百部總生物堿緩釋片工藝研究的基礎(chǔ)上，采用SPE-HPLC-ELSD法[4]建立百部總生物堿緩釋片中對葉百部堿的含量測定方法，并對其體外釋放度[5]進行研究，為建立百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量標準，有效控制制劑質(zhì)量提供參考[6]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；2000蒸發(fā)光散射檢測器(美國奧泰公司)；DK-S22電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；ZRS-8G智能溶出儀(天大天發(fā)科技有限公司)；SB-5200DT超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BP61型電子天平(德國Satorius)；UPT-I-10T超純水器(成都超純科技有限公司)；恒溫水浴鍋(金壇市鴻科儀器廠)。

1.2 材料

百部總生物堿提取物由本課題組提取分離獲得；對葉百部堿對照品由本課題組從對葉百部中提取分離獲得；百部總生物堿緩釋片(自制，批號分別為20141001，20141002，20141003)；乙腈為色譜純(上海純晶實業(yè)有限公司)；3 mL×500 mg固相萃取柱(美國色譜科技公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對葉百部堿薄層色譜鑒別

精密稱取對葉百部堿對照品適量，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成對照品溶液。取10粒百部總生物堿緩釋片，快速研勻后，精密稱定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超聲溶解，過濾，濾餅用5 mL 50%甲醇洗滌，合并濾液和洗液，并轉(zhuǎn)移至已處理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脫，再用5 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶中，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得供試品溶液。

依照《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄ⅥB薄層色譜法試驗，分別吸取2.1中對照品溶液和供試液各2 μL，在同一硅膠G薄層板上點樣，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(16∶4∶1)為展開劑，取出，吹干，再均勻噴上0.5%茚三酮溶液，150 ℃加熱2 min，至斑點顯色明顯后，再置碘蒸氣中熏至斑點清晰。見圖1。在薄層板對葉百部堿斑點的相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(為保證實驗準確性，供試品平行點樣3次)。

注：1～3.供試品；4.對照品。圖1 百部總生物堿緩釋片的TLC圖譜

2.2 百部總生物堿緩釋片的含量測定

本文根據(jù)前期研究發(fā)現(xiàn)，百部總生物堿中對葉百部生物堿含量高且穩(wěn)定，可以作為百部總生物堿的一個代表性含量檢測指標，所以在接下來百部總生物堿緩釋片含量及釋放度測定中均以對葉百部堿為代表物進行檢測。

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.12%三乙胺溶液(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：30 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度為97 ℃；空氣流速為3 mL·min-1。

2.2.2 對照品及供試液的制備 對照品溶液的制備精密稱取對葉百部堿對照品適量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的對照品儲備液。

供試品溶液的制備：取10粒百部總生物堿緩釋片，快速研勻后，精密稱定1.0 g，加入50 mL 50%甲醇，超聲溶解，過濾，濾餅用5 mL 50%甲醇洗滌，合并濾液和洗液并轉(zhuǎn)移至已處理好的C18固相萃取小柱中，先用5 mL水洗脫，再用5 mL甲醇洗脫。收集甲醇洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL的容量瓶，甲醇定容至刻度，精密量取甲醇溶液1.0 mL，至25 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，過0.22 μm的微孔濾膜即得供試品溶液。

陰性樣品溶液的制備：按百部總生物堿緩釋片的處方工藝，精密稱取各輔料適量，按供試品溶液制備的方法制成陰性樣品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察 專屬性試驗：取2.2.2項下對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，見圖2。結(jié)果表明，樣品中的輔料成分對測定無干擾。

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性樣品。圖2 百部總生物堿緩釋片的對照品、供試品、陰性樣品高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取對葉百部堿對照品適量，配置成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的對照品溶液，分別精密移取0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，各精密吸取上述溶液及2.2.2項下對照品溶液40 μL，注入液相色譜儀中，測定，記錄峰面積。對掃描積分值與進樣濃度進行雙對數(shù)直線回歸處理，即以進樣量的對數(shù)與峰面積積分值的對數(shù)作線性關(guān)系，得回歸方程：Y=1.380 2X+5.799 9(r=0.999 7)?？梢姡M樣濃度在0.02～0.30 mg·mL-1與積分值呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取對葉百部堿對照品溶液(0.2 mg·mL-1)30 μL，連續(xù)進樣5次，測得5次峰面積積分值，峰面積積分值平均值為39 379 682，RSD=1.40%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取供試品溶液(批號：20141001)30 μL，分別于0、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積積分值，峰面積積分值平均值為38 958 241，RSD=1.20%，表明供試樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣百部總生物堿緩釋片(批號：20141001)6份測定，結(jié)果RSD=1.08%，表明該方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取百部總生物堿緩釋片(批號：20141001)粉末6份，約0.5 g，精密稱定，分別加入對葉百部堿60 mg，按供試品制備方法制備得供試品溶液，測定計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率結(jié)果(n=6)

含量測定：依2.2項下測定方法，對3批樣品進行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 對葉百部堿含量測定結(jié)果

2.3 體外釋放度測定方法與結(jié)果

取百部總生物堿緩釋片6片，按《中華人民共和國藥典》2010年版(一部)釋放度測定法，附錄第一法(轉(zhuǎn)籃法)操作，1.0%十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)800 mL作為釋放介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，溫度為(37±0.5)℃，分別于2、4、6、8、10、12 h取樣5 mL，30 s內(nèi)用0.45 μm微孔濾膜過濾，同時補充等體積的同溫介質(zhì)。精密移取續(xù)濾液4 mL于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加入60%乙醇適量，溶解后搖勻，定容至10 mL。照2.2項下測定方法測定對葉百部生物堿含量，以對葉百部生物堿為代表物進行檢測，并按下式計算緩釋片的累積釋放度：

Q=CnVt+Vs∑Cn-1

其中，Q表示緩釋片累積釋放度；Cn表示實測濃度；Vt表示溶出介質(zhì)體積；Vs表示取樣體積。

取3批百部總生物堿緩釋片樣品，測定在各時間點的體外釋放度，結(jié)果見表3。

表3 3批樣品的體外釋放度測定結(jié)果(%)

根據(jù)《中華人民共和國藥典》有關(guān)規(guī)定，百部總生物堿緩釋片在2、8、12 h的累積釋放度分別為10%～30%、50%～70%、80%～100%。結(jié)果表明，3批百部總生物堿緩釋片的釋放度驗證結(jié)果均較理想，12 h的累積釋藥量均達95%以上，且重復(fù)性好，方法穩(wěn)定、可行，表明該緩釋片能達到很好緩釋效果。

3 討論

3.1 體外釋放度測定方法的選擇

百部總生物堿緩釋片的凝膠骨架材料易吸水膨脹并產(chǎn)生較大粘性，易粘于杯底，故采用轉(zhuǎn)籃法進行測定。

3.2 方法評價

百部總生物堿的含量測定方法已有文獻報道的有2個：溴甲酚綠顯色法和雷氏鹽比色法。由于比色法自身的靈敏度低，并且樣品制備過程中操作復(fù)雜，導(dǎo)致這兩種方法的測定結(jié)果并不準確。HPLC-ELSD是近年來檢測百部樣品比較理想的分析方法。實驗建立了制劑中對葉百部堿的薄層色譜鑒別方法，以對葉百部堿含量為評價指標，采用SPE-HPLC-ELSD法建立百部總生物堿緩釋片中對葉百部堿的含量測定方法。運用此分析方法測定了3批百部總生物堿緩釋片中對葉百部堿的含量，平均質(zhì)量分數(shù)為120.18 mg·g-1。說明對葉百部堿在所測的3批緩釋片中含量較為穩(wěn)定，可以作為百部緩釋片含量檢測的一個代表性指標。同時運用此方法測定了百部總生物堿緩釋片的體外釋放度，說明該方法準確、簡便、可靠，專屬性、重復(fù)性好，可用于百部總生物堿緩釋片的質(zhì)量控制。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 彭蜀瑩，沈建華，葉陽.4種百部生物堿的質(zhì)譜行為研究[J].分析化學(xué)，2006，34：497-502.

[3] 呂麗華，葉文才，趙守訓(xùn)，等.直立百部的化學(xué)成分[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2005，36(5)：408-410.

[4] Zhang RongRong，Lu DanYi，Yang ZhenYa，et al.Simultaneous quantification of six alkaloid components from commercial Stemonae Radix by SPE-HPLC-ELSD[J].Phramacognosymagazine,2015，11(42)：360-367.

[5] Zhang RongRong，Tian HaiYan，Wu Yi,et al.Isolation and chemotaxonomic significance of stenine-and stemoninine-type alkaloids from the roots of Stemona tuberosa[J].ChineseChemicalLetters,2014，38(9)，1252-1255.

[6] 張亞中，薛玉梅，陶建生.百部生物堿的研究現(xiàn)狀和思考[J].中成藥，2008，30(2)：248-251.

StudyonQualityStandardofStemonaAlkaloidsSustained-releaseTablets

WUYi1,2*，ZHAOBin1,2*，JIANGRenwang3

(1.ZhongshanTorchPolytechnic，Zhongshan528436，China；2.Zhongshanhealthproductscenter，NationalEngineeringResearchCenterformodernizationoftraditionalChineseMedicine，Zhongshan528436，China；3.CollegeofPharmacyJinanUniversity，Guangzhou510632，China)

Objective：To establish the quality control standard for the total alkaloids sustained-release tablets.Methods：The total alkaloids in the Radix Stemonae sustained release tablets were identified by TLC，and the content of the total alkaloids was determined by SPE-HPLC-ELSD method，and also the release rate of the Stemona alkaloids was determined.The method parameters were as follows：Evaporative light-scattering detector；Chromatographic column：Agilent Zorbax Extend-C18(250×4.6 mm，5 μL)；Mobile phase：acetonitrile-0.12% triethylamine solution(40∶60)；Flow rate：1.0 mL·min-1；Column temperature 25 ℃；Sample quantity：30(including l；ELSD parameters：the drift tube temperature is 97 ℃；The air flow rate for 3 mL·min-1.Results：This product characterized obviously in TLC，and the specificity was strong.Tubero stemonine concentration with peak area over the 0.02-0.30 mg·mL-1range showed a good linear relationship.The average recovery rate was 99.86%，the accumulative release rate of total alkaloids sustained-release tablets were 10%-30%，50%-70%，80%-100%，respectively，at 2，8，12 h，which conformed to the stipulation.Conclusion：The analysis method is simple，fast，accurate and representative，which can be used as the quality control method of the total alkaloids sustained-release tablets.

Radix Stemonae；total alkaloids；sustained-release tablets；HPLC；invitrorelease

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.023

2015-11-25)

廣東省新藥創(chuàng)制重大專項(2013A022100029)；中山市社會發(fā)展攻關(guān)項目(2013A3FC0325)

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吳旖，副主任藥師，研究方向：藥物制劑的研究與開發(fā)；Tel：(0760)88291713，E-mail:52419050@qq.com