王丹丹　宋寧寧　亢春彥　陳建中

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科　鄭州　450014　2)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理教研室　新鄭　451191

?

常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的抑制作用研究

王丹丹1)宋寧寧1)亢春彥2)陳建中1)

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科鄭州4500142)河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室新鄭451191

目的探討常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231及BALB裸鼠分為溶劑組、拉帕替尼組、常山酮+拉帕替尼組。首先通過體外實驗，以MTT法及劃痕試驗觀察各組MDA-MB-231增殖及遷移能力；然后制備乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型，通過神經(jīng)功能評分及腦部HE染色觀察各組腦轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果拉帕替尼顯著抑制了MDA-MB-231的增殖及遷移能力，并減少了MDA-MB-231向腦部的定植作用。常山酮顯著增強(qiáng)了拉帕替尼的治療效果。 結(jié)論常山酮聯(lián)合拉帕替尼能夠顯著提升拉帕替尼對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的抑制作用。

乳腺癌；腦轉(zhuǎn)移；常山酮；拉帕替尼

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤之一[1]。隨著近年治療技術(shù)的進(jìn)步，乳腺癌患者的生存期逐漸延長，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率有所增加。25%～30%的乳腺癌表達(dá)人表皮生長因子受體(humanepidermalgrowthfactor2，HER2)，該受體參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，其過度表達(dá)不僅與乳腺癌的惡化程度呈正比，且與腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。目前，大多抗癌藥物不能通過血腦屏障(bloodbrainbarrier，BBB)，導(dǎo)致乳腺癌腦轉(zhuǎn)移后生存期極低，1a生存率<20%[3]。因此尋找能夠通過BBB的抗癌藥物對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療有重要臨床意義。

拉帕替尼為一種小分子HER1及HER2抑制劑，已有研究證實該藥能夠通過BBB到達(dá)顱內(nèi)，對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移有較好的治療效果，目前已成為乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的一線藥物之一；常山酮為新型光譜抗球蟲藥，能夠通過BBB，對結(jié)腸癌、白血病及乳腺癌等發(fā)揮抗癌作用[4]。本研究旨在探討常山酮聯(lián)合拉帕替尼對乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的治療效果，以發(fā)現(xiàn)、提高治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移的藥物與方法。

1　材料與方法

1.1實驗材料及分組裸鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，6周齡，體質(zhì)量16～22g)購于南京大學(xué)模式動物研究所，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231購于美國ATCC公司，DMEM、胎牛血清均購于Hyclone公司，MTT試劑盒購于中國康為試劑公司，常山酮等化學(xué)試劑購于Sigma公司。本實驗分為3組：溶劑組、拉帕替尼組、常山酮+拉帕替尼組。

1.2細(xì)胞活性測定將人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以1×104/孔的密度接種于24孔板，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，然后分別加入DMEM、拉帕替尼(終濃度為0.5μM)及常山酮(終濃度為100nM)培養(yǎng)48h。之后將培養(yǎng)液吸出，加入MTT(最終濃度62.5μg/mL)，在37 ℃培養(yǎng)4h，之后吸出上層液體，加入DMSO后將上清取出，使用分光光度計在570nm波長下觀察吸收值，以測定各組細(xì)胞增殖能力。每組重復(fù)8次。

1.3細(xì)胞遷移能力測定本實驗使用劃痕試驗測定不同組別遷移能力。首先將MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長至90%左右，使用200μL槍頭在各組培養(yǎng)孔底部自上而下畫一條豎線，然后依據(jù)組別加入DMEM、拉帕替尼(終濃度為0.5μM)及常山酮(終濃度為100nM)。將培養(yǎng)板置于37 ℃條件下培養(yǎng)24h。使用倒置顯微鏡拍照，并通過ImageJ軟件計算各組劃痕兩側(cè)細(xì)胞之間的平均距離。每組重復(fù)8次。

1.4乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型制作依據(jù)Kunal等[5]方法制作乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型[5]：通過腹腔注射水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒后打開胸腔，在左心室注射1.75×105MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞，之后依次縫合傷口，于5周后通過改良的神經(jīng)功能評分(mNSS)觀察裸鼠神經(jīng)功能體征及腦部切片HE染色的方式觀察乳腺癌腦轉(zhuǎn)移情況。其中溶劑組不做任何處理，拉帕替尼組在注射MDA-MB-231細(xì)胞同時以100mg/kg劑量腹腔隔天注射拉帕替尼5周，常山酮+拉帕替尼組則在注射MDA-MB-231細(xì)胞同時分別以50mg/kg及100mg/kg的劑量隔天腹腔注射拉帕替尼及常山酮5周。每組各12只。

2　結(jié)果

2.1不同組別細(xì)胞增殖情況拉帕替尼(0.5μM)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖作用，常山酮(100nM)顯著增強(qiáng)了拉帕替尼抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖作用的療效。見表1。

表1　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231細(xì)胞增殖作用的影響

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

2.2不同組別遷移能力變化比較拉帕替尼(0.5μM)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力，常山酮(100nM)顯著增強(qiáng)了拉帕替尼抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖作用的療效。見表2。

表2　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的影響±s)

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

2.3不同組別乳腺癌轉(zhuǎn)移情況mNSS神經(jīng)功能評分及腦部HE染色顯示，制備乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型時同時處理拉帕替尼(100mg/kg)顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞定植于腦部的能力，常山酮(50mg/kg)顯著增強(qiáng)了拉帕替尼抑制MDA-MB-231向腦部定植能力的療效。見表3。

表3　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼對MDA-MB-231向腦部定植能力的影響

注：與溶劑組相比，*P<0.05；與拉帕替尼組相比，#P<0.05

3　討論

乳腺癌腦轉(zhuǎn)移作為乳腺癌患者終末期比較常見的轉(zhuǎn)移癌類型，因多數(shù)常規(guī)抗腫瘤藥物不能通過血腦屏障而導(dǎo)致治療困難，目前臨床上多采用全腦放療加化療的方式改善患者癥狀[6]。乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移后存活率極低，因此積極尋找能夠通過血腦屏障的高效抗癌藥物對預(yù)防及治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移具有重大的現(xiàn)實意義。如前所述，25%～30%的乳腺癌表達(dá)HER2，該受體與乳腺癌惡化及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；拉帕替尼為一種小分子HER1及HER2抑制劑，已有研究證實，其能夠順利通過血腦屏障到達(dá)顱內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移灶，并通過阻斷HER2受體顯著減小轉(zhuǎn)移灶體積，提示拉帕替尼可能預(yù)防并治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移[7]。但近期研究提示，拉帕替尼可能會誘導(dǎo)乳腺癌的抗藥性，進(jìn)而導(dǎo)致治療失敗。因此如何提高拉帕替尼的治療效果、短期高效的抑制腦轉(zhuǎn)移灶的活性尤為重要。

常山酮為中藥提取物，前期主要應(yīng)用于家禽類的抗球蟲治療[7]。但近十幾年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)其能通過抑制MMPs蛋白、TGF系列通路等明顯抑制結(jié)腸癌、血液系統(tǒng)腫瘤及乳腺癌的生長，并可以通過血腦屏障，提示其可能為腦部原發(fā)性腫瘤及轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在藥物[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，拉帕替尼在體外能夠顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖活性及遷移能力，且在制備乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型時應(yīng)用可以顯著減少乳腺癌細(xì)胞向腦部的定植作用。常山酮不僅能夠提高拉帕替尼抑制MDA-MB-231增殖及遷移的能力，而且與拉帕替尼合用可以大幅度提升拉帕替尼防治乳腺癌細(xì)胞向腦部定植的能力。本研究結(jié)果說明，拉帕替尼能夠抑制乳腺癌細(xì)胞向腦部定植能力，但合用常山酮可以大幅度提升治療效果，可能為治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移新的治療手段。但常山酮通過何種機(jī)制促進(jìn)拉帕替尼的治療效果尚需進(jìn)一步深入研究。

[1]杜鐵橋，王永利，于盛會，等.北京市女性乳腺癌危險因素與乳腺癌相關(guān)性的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17(1)：5-8.

[2]王建東，王全勝，白熠洲，等.mTOR信號通路在乳腺癌拉帕替尼耐藥細(xì)胞系中的作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(24)：1 915-1 917.

[3]王濤，江澤飛，宋三泰，等.拉帕替尼等治療乳腺癌腦轉(zhuǎn)移全腦放療后再復(fù)發(fā)1例[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009，89(4)：286-287.

[4]JinML，ParkSY，KimYH，etal.Halofuginoneinducestheapoptosisofbreastcancercellsandinhibitsmigrationviadownregulationofmatrixmetalloproteinase-9[J].IntJOncol，2014，44(1)：309-318.

[5]TaskarKS，RudrarajuV，MittapalliRK，etal.LapatinibdistributioninHER2overexpressingexperimentalbrainmetastasesofbreastcancer[J].PharmRes，2012，29(3)：770-781.

[6]MarshallDA，DealK，BombardY，etal.Howdowomentrade-offbenefitsandrisksinchemotherapytreatmentdecisionsbasedongeneexpressionprofilingforearly-stagebreastcancer?Adiscretechoiceexperiment[J].BMJOpen，2016，6(6)：e010 981.

[7]PinesM，SpectorI.Halofuginone-themultifacetedmolecule[J].Molecules，2015，20(1)：573-94.

[8]PinesM.Halofuginoneforfibrosis，regenerationandcancerinthegastrointestinaltract[J].WorldJGastroenterol，2014，20(40)：14 778-14 786.

[9]YoungSL，Al-HendyA，CoplandJA.Potentialnonhormonaltherapeuticsformedicaltreatmentofleiomyomas[J].SeminReprodMed，2004，22(2)：121-30.

[10]StreeterEH，HarrisAL.Angiogenesisinbladdercancer--prognosticmarkerandtargetforfuturetherapy[J].SurgOncol，2002，11(1/2)：85-100.

(收稿2016-03-21)

R-332

B

1673-5110(2016)16-0121-02