秦　川　渠文生

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　武漢　430030

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腦白質(zhì)低灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43的表達(dá)變化

秦川渠文生△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科武漢430030

目的研究慢性腦白質(zhì)缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞和縫隙連接蛋白Connexin43(Cx43)的變化。方法原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，建立體外慢性缺氧模型；雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄法，建立慢性低灌注腦白質(zhì)損傷小鼠模型；免疫熒光共染觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞活化與Cx43表達(dá)。Western蛋白定量分析髓鞘相關(guān)指標(biāo)髓鞘相關(guān)糖蛋白MAG，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和Cx43的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，細(xì)胞慢性缺氧7d后，星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生活化，伴隨Cx43表達(dá)水平明顯上調(diào)。Westernblot發(fā)現(xiàn)，在慢性腦白質(zhì)缺血過程中，MAG的表達(dá)逐漸降低，GFAP持續(xù)增高，Cx43表達(dá)明顯上調(diào)。免疫熒光共標(biāo)記可見，星形膠質(zhì)細(xì)胞中Cx43表達(dá)上調(diào)，主要分布于胼胝體中央?yún)^(qū)。結(jié)論慢性腦白質(zhì)缺血損傷過程伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)增加，Cx43可能成為臨床治療血管性認(rèn)知障礙的新靶點(diǎn)。

缺血性腦白質(zhì)損傷；星形膠質(zhì)細(xì)胞；縫隙連接蛋白43

隨著社會(huì)人口構(gòu)成的老齡化，認(rèn)知障礙疾病對(duì)人類健康造成的影響日益突出。血管性認(rèn)知功能障礙(vascularcognitiveimpairment，VCI)是臨床最常見的認(rèn)知功能障礙類型之一。以小血管病和低灌注為主要病因，以皮質(zhì)下多發(fā)腔隙性梗死和缺血性腦白質(zhì)病變(Whitematterlesions，WML)為主要腦部損傷特點(diǎn)的皮質(zhì)下缺血性認(rèn)知功能障礙，是VCI的主要和常見亞型[1]?！鞍踪|(zhì)神經(jīng)血管單元”由神經(jīng)元軸突、髓鞘、各種膠質(zhì)細(xì)胞以及深部血管構(gòu)成。其中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與各種膠質(zhì)細(xì)胞形成廣泛的網(wǎng)絡(luò)合胞體[2]，，對(duì)維持“白質(zhì)神經(jīng)血管單元”的發(fā)育、分化和功能穩(wěn)定具有重要作用[3-4]。然而，星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的縫隙連接蛋白conexin43(Cx43)是否直接參與腦白質(zhì)損傷的病理過程尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立慢性低灌注所致白質(zhì)損傷小鼠模型和原代星形膠質(zhì)細(xì)胞慢性缺氧模型，研究小鼠在低灌注的不同時(shí)期星形膠質(zhì)細(xì)胞激活增生情況與Cx43的表達(dá)改變，以期解釋腦白質(zhì)缺血缺氧改變所致的脫髓鞘改變與星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)變化之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑激光共聚焦熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；恒溫冰凍切片機(jī)(德國Leica公司)；牛血清白蛋白BSA、DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；山羊抗MAG單克隆抗體(美國SantaCruz公司)；小鼠抗GFAP單克隆抗體、兔抗Connexin43多克隆抗體(美國Millipore公司)；組織細(xì)胞裂解液、FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記的兔抗羊IgG、HRP標(biāo)記IgG(美國Pierce公司)。

1.2動(dòng)物分組與制作模型健康SPF級(jí)成年C57BL/6J小鼠30只，雄性，體質(zhì)量24～29g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。遵循隨機(jī)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：假手術(shù)組(n=10)、術(shù)后1d組(n=10)、術(shù)后10d組(n=5)和術(shù)后1個(gè)月組(n=5)，其中假手術(shù)組、術(shù)后1個(gè)月組各5只與術(shù)后1d組、術(shù)后10d組用于Westernblot檢測，假手術(shù)組和術(shù)后1個(gè)月組余5只用于免疫熒光檢測。小鼠BCAS模型的建立：根據(jù)ShibataM報(bào)道的方法稍加改良[4]，雙側(cè)頸總動(dòng)脈狹窄(bilateralcommoncarotidarterystenosis，BCAS)小鼠模型，用內(nèi)徑0.18mm的microcoil夾套小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，可選擇性損傷前額葉-皮層下白質(zhì)，影響該神經(jīng)環(huán)路，而無明顯的灰質(zhì)損傷。假手術(shù)組分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合頸部切口，不上彈簧圈。

1.3原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與體外模型建立參考文獻(xiàn)報(bào)道[5]的方法稍加改良進(jìn)行大鼠乳鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)。選取新生0～1d的SD大鼠，無菌條件下取腦，剔除軟腦膜及血管；用眼科剪剪碎組織，直至成為1mm3的組織碎塊；0.125%胰酶37 ℃條件下消化2min，含血清培養(yǎng)基終止消化；無菌巴氏管反復(fù)吹打?yàn)榧?xì)胞懸液；直徑200目篩網(wǎng)過濾；4℃離心 8min(800r/min)，棄上清；用全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基+20%胎牛血清)重懸細(xì)胞；接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、95%O2、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；常規(guī)換液培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為傳2代細(xì)胞。通過化學(xué)法建立體外慢性缺氧模型，基本方法為1MCoCl2誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞7d。

1.4樣本采集與檢測培養(yǎng)細(xì)胞在化學(xué)法缺氧干預(yù)7d后多聚甲醛固定。術(shù)后1個(gè)月麻醉取腦，行冠狀面切片，厚度為10m，用于冰凍切片染色取相同位置的切片進(jìn)行染色。染色主要步驟：4 ℃預(yù)冷的多聚甲醛溶液固定15min破膜液，室溫孵育10～15min；10%BSA封閉液，室溫封閉2h；添加稀釋的一抗(1：200)，在濕盒內(nèi)孵育過夜；添加稀釋的二抗(1：200)，室溫避光孵育1h；封片后觀察。

術(shù)后3d、10d、1個(gè)月取腦，分離提取白質(zhì)總蛋白，用于Western定量檢測?；静襟E為：組織細(xì)胞裂解液裂解腦組織，測定調(diào)整蛋白濃度后，上樣60μg蛋白，120V的恒壓繼續(xù)電泳90min，調(diào)整電流為250mA，4℃電泳轉(zhuǎn)移120min；加入稀釋的一抗(1：400)，4℃緩慢搖動(dòng)過夜；二抗(1：1000)室溫緩慢搖動(dòng)1h；顯色掃膜拍照。測量條帶的OD值，以GAPDH為基準(zhǔn)折算相對(duì)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1慢性缺氧細(xì)胞的變化化學(xué)誘導(dǎo)7d后，原代星形膠質(zhì)細(xì)胞慢性缺氧模型建立成功。通過免疫熒光共標(biāo)記GFAP和CX43，缺氧模型細(xì)胞組與對(duì)照組(圖1A)相比，可見缺氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生活化，胞體肥厚，細(xì)胞排列紊亂、密集，而Cx43表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖1B)。

圖1　慢性缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和CX43表達(dá)A：對(duì)照組；B慢性白質(zhì)缺血模型組。綠色熒光標(biāo)記GFAP，紅色熒光標(biāo)記Cx43

2.2動(dòng)物模型中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化慢性低灌注所致白質(zhì)損傷小鼠模型成功建立后，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，在慢性腦白質(zhì)缺血過程中，髓鞘損傷標(biāo)記物從BCAS第3d起表達(dá)明顯降低，1個(gè)月時(shí)降至最低，降低趨勢具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GFAP持續(xù)增高，縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)明顯上調(diào)(圖2)。

圖2　慢性腦白質(zhì)缺血模型組相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

2.3動(dòng)物模型建立1月后星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CX43的變化通過免疫熒光共標(biāo)記可見，與對(duì)照組(圖3A1/A2)相比，慢性低灌注模型組GFAP的表達(dá)明顯增高(圖3B1)，伴隨Cx43的表達(dá)增高(圖3B2)，GFAP和Cx43共表達(dá)，表明慢性腦白質(zhì)缺血1個(gè)月后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖仍活躍，伴隨Cx43的表達(dá)增高。Cx43表達(dá)上調(diào)，主要分布于胼胝體中央?yún)^(qū)，即白質(zhì)損傷最嚴(yán)重的區(qū)域。

圖3　慢性腦白質(zhì)缺血1個(gè)月后的變化A：對(duì)照組；B慢性白質(zhì)缺血模型組。綠色熒光標(biāo)記GFAP，紅色熒光標(biāo)記Cx43

3　討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的支持細(xì)胞和輔助免疫細(xì)胞，其功能具有雙面性。一方面，活化后肥大、增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞有助于保證缺血損傷后結(jié)構(gòu)的相對(duì)完整，可維持神經(jīng)纖維的營養(yǎng)，促進(jìn)其再生；另一方面，過度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量氧自由基和炎性因子以及谷氨酸等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，加重局灶組織損傷，同時(shí)其產(chǎn)生的內(nèi)皮素等還可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)的進(jìn)一步加重[2，5]。本研究通過免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)和Western技術(shù)觀察低灌注后不同時(shí)間點(diǎn)胼胝體中央?yún)^(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的變化，發(fā)現(xiàn)小鼠白質(zhì)區(qū)域(胼胝體中央部)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖，1個(gè)月時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖明顯，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體肥大，軸突分支增粗濃密，與文獻(xiàn)報(bào)道[4]相一致。伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖，Cx43表達(dá)量明顯上調(diào)，且在低灌注1個(gè)月后損傷最為明顯。在離體慢性缺氧模型中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與Cx43也具有同樣的變化趨勢。這些結(jié)果提示星形膠質(zhì)細(xì)胞活化伴隨的Cx43表達(dá)增加，可能參與到白質(zhì)損傷與修復(fù)的過程中。

髓鞘相關(guān)糖蛋白MAG是髓鞘受損額敏感指標(biāo)，在各類白質(zhì)損傷模型中其表達(dá)量均明顯下調(diào)[4，6]。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著低灌注時(shí)間延長，MAG表達(dá)量逐漸降低，到1個(gè)月時(shí)下降最為顯著，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相一致[4]，與星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)上調(diào)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道稱，腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接可介導(dǎo)損傷信號(hào)分子(Ca2+，Glu等)在細(xì)胞間傳播，導(dǎo)致?lián)p傷的擴(kuò)大[7]。同時(shí)神經(jīng)損傷導(dǎo)致的細(xì)胞外Ca2+降低及炎性因子釋放，可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞半通道，釋放ATP、谷氨酸。Glu、ATP相關(guān)信號(hào)通路誘發(fā)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生Ca2+信號(hào)，調(diào)控軸突傳導(dǎo)，是參與缺血時(shí)白質(zhì)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及軸突損傷的重要因素[8]。由此我們推測若選擇性抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接通訊的表達(dá)及功能可能可以通過減少ATP、Glu等興奮性物質(zhì)的釋放，抑制損傷因子在膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)合胞體內(nèi)的異常傳播而產(chǎn)生腦白質(zhì)保護(hù)作用。這也是我們值得進(jìn)一步探索的研究方向。

本研究發(fā)現(xiàn)缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活躍和Cx43表達(dá)持續(xù)上調(diào)的動(dòng)態(tài)變化，特點(diǎn)與髓鞘損傷變化相一致，為進(jìn)一步闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞與Cx43在低灌注腦白質(zhì)損傷病變過程中的具體作用提供了研究基礎(chǔ)。

[1]FieldsRD.Neuroscience.Changeinthebrain'swhitematter[J].Science，2010，330(6005)：768-769.

[2]MagnottiLM，GoodenoughDA，PaulDL.Functionalheterotypicinteractionsbetweenastrocyteandoligodendrocyteconnexins[J].Glia，2011.59(1)：26-34.

[3]CotrinaML，NedergaardM.Brainconnexinsindemyelinatingdiseases：therapeuticpotentialofglialtargets[J].BrainRes，2012，1 487：61-68.

[4]ShibataM，OhtaniR，IharaM，etal.Whitematterlesionsandglialactivationinanovelmousemodelofchroniccerebralhypoperfusion[J].Stroke；ajournalofcerebralcirculation，2004，35(11)：2 598-2 603.

[5]KliotM，SmithGM，SiegalJD，etal.Astrocyte-polymerimplantspromoteregenerationofdorsalrootfibersintotheadultmammalianspinalcord[J].ExpNeurol，1990，109(1)：57-69.

[6]MironVE，BoydA，ZhaoJW，etal.M2microgliaandmacrophagesdriveoligodendrocytedifferentiationduringCNSremyelination[J].NatNeurosci，2013，16(9)：1 211-1 218.

[7]XieM，YiC，LuoX，etal.Glialgapjunctionalcommunicationinvolvementinhippocampaldamageaftermiddlecerebralarteryocclusion[J].AnnNeurol，2011，70(1)：121-132.

[8]ButtAM，F(xiàn)ernRF，MatuteC.Neurotransmittersignalinginwhitematter[J].Glia，2014，62(11)：1 762-1 779.

(收稿2016-05-16)

國家自然基金，編號(hào)：81400977

渠文生，男，1982年3月出生，河南南陽市人，目前為同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科主治醫(yī)師，從事腦血管病相關(guān)研究。E-mail：qws0309@163.com

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1673-5110(2016)16-0044-03