王　昊　楊　佳　趙百孝　哈　略　劉耀萌　黃　暢　于夢蕓　惠　鑫　和　蕊　韓　麗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029)

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艾燃燒生成物對ApoE基因敲除小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA的影響

王昊楊佳趙百孝哈略劉耀萌黃暢于夢蕓惠鑫和蕊韓麗

(北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京，100029)

目的：觀察艾燃燒生成物即艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5羥色胺(5-HT)和γ-氨基丁酸(GABA)含量變化的影響。方法：本實(shí)驗(yàn)選用8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同齡相同遺傳背景非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6作為空白對照組。ApoE-/-小鼠隨機(jī)平均分為艾煙組、模型對照組、氯吡格雷組。艾煙組小鼠5～15 mg/m3濃度艾煙干預(yù)，空白對照組和模型對照組小鼠空白抓取，氯吡格雷組口服給予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)，各組干預(yù)6 d/周，16周后犧牲動(dòng)物，使用LC-MS/MS同時(shí)測定腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)GABA、5-HT含量。結(jié)果：艾煙組其腦內(nèi)5-HT、GABA的含量顯著高于模型組(P<0.05)，氯吡格雷組腦內(nèi)5-HT與模型組無明顯差異，GABA的含量顯著高于模型組(P<0.05)，3組間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：適當(dāng)施灸時(shí)，一定濃度范圍之內(nèi)的艾燃燒生成物可以治療性提高ApoE-/-小鼠腦內(nèi)5-HT及GABA的含量。

艾燃燒生成物；ApoE基因敲除小鼠；神經(jīng)遞質(zhì)；5-HT；GABA

艾灸是用艾葉制成灸材，點(diǎn)燃后通過熱輻射刺激體表穴位或特定部位激發(fā)經(jīng)氣和通過呼吸吸入具有芳香氣味的艾煙，共同調(diào)整人體生理功能，從而達(dá)到防病治病目的一種傳統(tǒng)中醫(yī)療法。艾灸療法的作用主要有溫通經(jīng)脈、升陽舉陷、散寒祛濕、消腫散結(jié)、祛瘀通絡(luò)、回陽救逆等作用，其保健強(qiáng)壯、鼓舞正氣的效果較好，故該療法廣泛應(yīng)用于日常養(yǎng)生。艾燃燒生成物即艾煙，可通過呼吸或皮膚吸收等途徑進(jìn)入人體[1]，其成分復(fù)雜，主要作用成分可能為桉油精、龍腦、側(cè)柏酮、β-石竹烯等揮發(fā)油[2-3]，但目前仍尚未探明具體是哪種成分及其作用機(jī)制。

本課題組致力于艾灸及艾燃燒生成物作用機(jī)制的相關(guān)研究。在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)艾煙具有抗氧化、光譜殺菌、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)、減少血小板聚集、改善微循環(huán)[4]、保護(hù)海馬CA3區(qū)、減少Aβ沉淀[5]等作用，從而改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，進(jìn)而起到延緩腦組織衰老，預(yù)防和改善阿茲海默病癥狀的作用。

ApoE載脂蛋白基因敲除(ApoE-/-)小鼠是由美國Rockefeller大學(xué)生化遺傳與代謝實(shí)驗(yàn)室和北卡羅萊那大學(xué)病理遺傳實(shí)驗(yàn)室于1992年采用胚胎干細(xì)胞基因敲除(gene knockout)技術(shù)培育成功，能夠在自然膳食下形成嚴(yán)重的高脂血癥，并自發(fā)形成纖維斑塊和復(fù)合斑塊，病理學(xué)改變與人類極為相似，因此廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究中[6]。隨著ApoE4與阿茲海默病(Alzheimer Disease，AD)間相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)與逐步證實(shí)，ApoE-/-小鼠成為研究ApoE在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)功能以及ApoE基因缺失后可能出現(xiàn)的神經(jīng)功能障礙的最佳動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠在受到缺血性損害后，神經(jīng)細(xì)胞的損害更加嚴(yán)重，而給予植入ApoE基因后，神經(jīng)損害又大大減輕，這進(jìn)一步支持ApoE的神經(jīng)保護(hù)功能[7-8]。ApoE-/-小鼠出現(xiàn)認(rèn)知障礙與膽堿能神經(jīng)功能障礙[9-11]，而這兩者又是AD的主要特征，膽堿能神經(jīng)受損被認(rèn)為是AD認(rèn)知功障礙的主要原因，因此ApoE-/-小鼠已經(jīng)被作為一種新型動(dòng)物模型，應(yīng)用于研究ApoE缺失在乙酰膽堿神經(jīng)損害所致認(rèn)知障礙過程中發(fā)揮的作用[12]。劉鈞天[5]證明了ApoE-/-小鼠可以作為阿茨海默病的動(dòng)物模型,并說明艾煙的確可以降低ApoE-/-小鼠的腦內(nèi)淀粉蛋白沉淀，改善其學(xué)習(xí)記憶功能，進(jìn)而起到延緩腦組織衰老，防治AD的作用。

本實(shí)驗(yàn)選用ApoE基因敲除小鼠，觀察艾煙干預(yù)對小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、GABA含量變化的影響，探討艾煙抗衰老的作用效應(yīng)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)21只，7只同齡相同遺傳背景非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6作為空白對照組。小鼠均購自于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部。ApoE-/-小鼠釆用高脂飼料(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)喂養(yǎng),C57BL/6釆用常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有小鼠均可自由進(jìn)食飲水；飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(22±2)℃，濕度為50%～60%左右。釆用人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照(8：00—20：00)和黑暗(20:00—次日8：00)交替循環(huán)。

1.2主要儀器與試劑Q-Trap 5500型串聯(lián)四級桿-離子阱質(zhì)譜分析儀(美國Applied Biosystems公司)，Sorvall Legend Micro 17R微量離心機(jī)(美國Thermo公司)，超低溫冰箱,日本三洋公司產(chǎn)，XS105S十萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Gilson移液器(法國Gilson公司)。特制細(xì)艾條(φ0.5 cm×20 cm,河南南陽漢醫(yī)艾絨有限公司)；小鼠固定籠(自制,圓柱形,底面直徑5 cm,高10 cm)；帶孔玻璃缸(自制,80 cm×80 cm×60 cm,頂層玻璃正中設(shè)有直徑為5 mm的圓孔；光散射式數(shù)字粉塵測試儀(北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司)。5-HT，GABA均購自美國Sigma公司，甲醇、乙腈為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后，將ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)平均分為艾煙組、模型對照組、氯吡格雷組，每組7只，高脂喂養(yǎng)，空白組選用C57BL/6小鼠作為對照，普通飲食喂養(yǎng)。

空白組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；

模型組：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；

艾煙干預(yù)組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，暴露于10～15 mg/m3艾煙環(huán)境下20 min；

陽性藥組小鼠：釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，不予任何處理，每日抓取固定20 min；口服給予氯吡格雷溶液14 mg/kg(1次/d)；

各組干預(yù)6 d/周，16周后犧牲動(dòng)物，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

2.2干預(yù)方法模型組與空白組小鼠：分別用自制小鼠固定籠固定后放入玻璃缸內(nèi),不做其他處理，20 min后取出。

艾煙干預(yù)組小鼠：將調(diào)試好的粉塵測試儀置于玻璃缸中間,將小鼠用自制小鼠固定籠固定后放于玻璃缸內(nèi)。點(diǎn)燃細(xì)艾條,從玻璃缸上方圓孔中將燃燒的一端插入，令艾煙充滿玻璃缸。用粉塵測試儀測試其濃度達(dá)到預(yù)定范圍10～15 mg/m3后(此過程艾條燃燒約15 s)，將艾條取出,迅速封閉圓孔。此后每隔3 min記錄1次濃度數(shù)值，使數(shù)值保持在10 mg/m3左右。若數(shù)值高于15 mg/m3，可將上方玻璃蓋稍微移動(dòng)，令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回；若數(shù)值低于5 mg/m3，可再將點(diǎn)燃的艾條由圓孔插入,以補(bǔ)充艾煙。每次艾煙干預(yù)結(jié)束后,打開玻璃缸釋放艾煙，并擦拭玻璃缸清除艾燃燒殘留物，以便下次實(shí)驗(yàn)操作。

2.3取材在干預(yù)16周后，將所有小鼠處死，冰臺(tái)上快速取腦。將取得的腦組織放入標(biāo)記的凍存管中，液氮凍存數(shù)分鐘后移入-70 ℃冰箱待檢。

2.4指標(biāo)檢測腦樣品稱重后，徹底剪碎(約100下)；下丘腦中分別加入0.2 mL生理鹽水，然后在冰浴中超聲勻漿得腦勻漿液。取各腦勻漿液0.15 mL，加入0.3 mL冰冷的乙腈，混勻后于4 ℃放置30 min，然后于4 ℃低溫離心(8 000 r/min，3 min)，取上清液200 μL，在其中加入10 μL內(nèi)標(biāo)，然后5 000 g低溫離心10 min后取上清液在LC-MS上測試。

TSKgel Amide-80色譜柱(2.0 mm×15 cm，3 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相乙腈-15 mmol·L-1甲酸銨水溶液(pH5.5)(60∶40)，流速0.4 mL·min-1。質(zhì)譜檢測器采用電噴霧電離方式進(jìn)行離子化，以正離子多反應(yīng)檢測(MRM)模式進(jìn)行掃描，離子源及其他相關(guān)參數(shù)優(yōu)化為噴霧電壓4 500V，加熱溫度500 ℃，Gas1 50Psi，Gas2 70Psi。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4　結(jié)果

各組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和GABA含量比較見表1和圖1、圖2。

與空白對照組對比，模型組小鼠腦內(nèi)5-HT、GABA含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。艾煙組腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和GABA含量介于模型組和空白組之間，顯著高于模型組，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氯吡格雷組小鼠腦內(nèi)5-HT和GABA含量略高于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低于艾煙組，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

表1　各組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和GABA含量比較

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5　討論

中樞系統(tǒng)的5-HT神經(jīng)元胞體主要集中在低位腦干的中線附近，稱為中縫核群，向前投射至前腦，向兩側(cè)投射至新皮質(zhì)的廣泛區(qū)域，5-HT為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其含量占全身總量的1%～2%，而腦內(nèi)5-HT能神經(jīng)遞質(zhì)在記憶功能中起著非常重要的作用，另外同樣重要的還有膽堿能、兒茶酚胺能神經(jīng)遞質(zhì)[13]。5-HT被認(rèn)為可通過與腦內(nèi)乙酰膽堿的交互作用直接與記憶發(fā)生聯(lián)系。

圖1　各組5-HT和GABA含量對比

GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，正常的工作記憶功能取決于背外側(cè)前額皮層適量的GABA的神經(jīng)傳遞，GABA的過少和過多釋放都會(huì)損害記憶[14]。衰老時(shí)GABA含量的下降可進(jìn)一步造成機(jī)體的抗氧化能力減弱，繼而引發(fā)一系列的病理生理變化，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷、凋亡，出現(xiàn)記憶力下降、認(rèn)知障礙、思維遲緩等腦老化的表現(xiàn)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)耗能高、耗氧高的高代謝系統(tǒng)，其本身又含有高濃度易于氧化的物質(zhì)，這導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)極易受到氧化應(yīng)激的損傷，脂質(zhì)過氧化是最早的改變之一。楊秀麗[12]發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠腦內(nèi)的氧化性產(chǎn)物增多，其抗氧化系統(tǒng)受到明顯的損害，這導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，而這可能是最終導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙的根本原因。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，使用艾煙處理小鼠后神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯高于模型組，接近于空白組水平，說明其治療效果良好，艾煙生成物即艾煙作為艾灸作用因素之一可有效提高腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和GABA含量，起到延緩腦組織衰老的作用。本課題組之前的試驗(yàn)已證明艾煙可減少ApoE-/-小鼠的腦內(nèi)Aβ蛋白沉淀[5]，降低GFAP蛋白在海馬的表達(dá)水平[15]，改善學(xué)習(xí)記憶功能，其作用途徑可能是艾煙中有效揮發(fā)油成分，被呼吸系統(tǒng)和皮膚的黏膜吸收，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和脂質(zhì)代謝，增強(qiáng)神經(jīng)系統(tǒng)興奮性，改善腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷和炎性反應(yīng)，從而起到預(yù)防和改善阿茲海默病癥狀的作用。

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(2016-06-28收稿責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effects of Moxa Smoke on Brain 5-HT and GABA in Apolipoprotein E-deficient Mice

Wang Hao, Yang Jia, Zhao Baixiao,Ha Lue,Liu Yaomeng,Huang Chang,Yu Mengyun,Hui Xin,He Rui,Han Li

(SchoolofAcupuncture-MoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of moxa smoke (Artemisia vulgaris) on neurotransmitters 5-HT and GABA in the brain of apolipoprotein E-deficient mice (ApoEKO) and explore the antiaging effect of moxa smoke. Methods: Seven eight-week old C57BL/6 mice were collected as control group, and twenty-one eight-week old ApoEKO mice were randomly divided into 3 groups (n=7/group): model group, moxa smoke group, and clopidogrel group. Mice in the smoke group was exposed to smoke, whose concentration is controlled within 5～15 mg/m3; mice in model group and control group were exposed to normal air. Mice in clopidogrel group were treated with 14 mg/kg clopidogrel orally once/day. After 16 weeks interference, the levels of 5-HT and GABA in the mice brain were measured. Results: Compared with the model group, the brain 5-HT and GABA levels of moxa smoke group were decreased significantly (P<0.05). There is no significant difference between the clopidogrel group and control group in 5-HT concentration, while GABA level was higher in clopidogrel group with significant difference (P<0.05), besides, the differences among the three groups have significant difference (P<0.05). Conclusion: Within appropriate concentration, moxa smoke can obviously increase brain 5-HT and GABA levels in ApoEKO mice.

Moxa smoke; Apolipoprotein E-deficient mice; Neurotransmitter; 5-HT; GABA

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81373730)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81574068)；國家青年自然基金項(xiàng)目(編號(hào)：81403449)；國家國際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2011DFA31370)

王昊(1991.01—)，男，北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級在讀碩士研究生，研究方向：艾灸與艾燃燒生成物的效應(yīng)機(jī)制，E-mail：wh_bucm@126.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.005