羅雅月，尹朝晟，付翔杰，張魏，劉娟，譚潭

1.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院門診部，湖南郴州 423000；2.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423000

*論著*

急性髓系白血病Galectin-1基因甲基化研究

羅雅月1，尹朝晟2，付翔杰2，張魏2，劉娟2，譚潭2

1.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院門診部，湖南郴州 423000；2.南華大學(xué)附屬郴州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州 423000

目的 檢測(cè)急性髓系白血病（AML）中Galectin-1基因的甲基化水平，探討Galectin-1基因表達(dá)水平與啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系。方法 選取2014年1月—2015年12月在該院門診部治療前AML骨髓54例、對(duì)照骨髓35例和治療后完全緩解AML骨髓8例，采用采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法檢測(cè)Galectin-1基因甲基化狀態(tài)。 結(jié)果 Galectin-1基因在AML骨髓中的平均表達(dá)水平明顯低于對(duì)照骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22），在完全緩解AML骨髓中明顯高于治療前骨髓 （0.79±0.21）VS（0.33±0.11）；Galectin-1基因在AML骨髓的甲基化陽性率明顯高于對(duì)照骨髓 (79.6%VS 17.1%)，Galectin-1基因的甲基化陽性率在完全緩解AML骨髓中明顯低于治療前骨髓 (12.5%VS 75.0%)；Galectin-1基因表達(dá)水平與其甲基化呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論Galectin-1基因在AML中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)或缺失，與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。

急性髓系白血病；Galectin-1；甲基化

白血病是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。研究表明，白血病的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟復(fù)雜的過程，涉及到相應(yīng)的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)方面的改變[1]。DNA異常甲基化在人類許多腫瘤中是比較常見的表觀遺傳學(xué)改變，也是導(dǎo)致基因表達(dá)變化主要原因之一[2-3]。通過逆轉(zhuǎn)基因的甲基化狀態(tài)也就是去甲基化，可以恢復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)水平，是臨床上靶向治療的熱點(diǎn)方向。因此，通過研究有關(guān)白血病的甲基化沉默基因，可有助于闡明白血病的發(fā)病分子機(jī)制，在臨床上為白血病的防治提供新的靶標(biāo)和研究思路。

半乳糖凝集素I（Galectin-1）是一種典型的真核細(xì)胞胞漿蛋白，Galectin-1在人體許多組織中均有表，其廣泛分布說明它是一種多功能蛋白質(zhì)，在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-1在糖類識(shí)別、細(xì)胞黏附、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)活動(dòng)中具有重要作用[4]；在許多腫瘤中，Galectin-1的表達(dá)均增高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]。該研究選取2014年1月—2015年12月AML骨髓54例及對(duì)照組骨髓35例及經(jīng)治療后完全緩解的AML骨髓8例，通過檢測(cè)Galectin-1在其中的表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)，探討Galectin-1在AML發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試劑DNA甲基化試劑盒 (EZ DNA Methylation-Gold Kit)。

1.2 骨髓樣本

2014年1月—2015年12月在該院門診部初治AML骨髓標(biāo)本54例（其中男30例，女24例，年齡13～81歲），其中經(jīng)治療后完全緩解的AML骨髓標(biāo)本8例 （其中男5例，女3例，年齡13～52歲），以及對(duì)照組骨髓標(biāo)本35例（貧血及血小板減少病人，其中男20例，女15例，年齡20～56歲）均來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院的門診和住院病人。AML病人診斷均符合FAB診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 骨髓標(biāo)本的制備

取肝素抗凝骨髓液3 mL，用分層液分選單個(gè)核細(xì)胞，每一個(gè)標(biāo)本均分成2份，凍存于-80℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 提取純化DNA

甲基化特異性PCR（MSP-PCR）抽提骨髓細(xì)胞的基因組DNA，采用DNA甲基化檢測(cè)試劑盒對(duì)待測(cè)的DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽修飾并純化。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：94℃5 min，1個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，紫外燈下觀察并掃描圖片。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組均數(shù)之間的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-1基因在AML骨髓中的表達(dá)

Galectin-1基因表達(dá)水平在AML骨髓中明顯低于對(duì)照組骨髓 （0.35±0.09）VS（0.87±0.22）（圖 1，t=11.124，P= 0.000）。Galectin-1基因平均表達(dá)水平在完全緩解AML骨髓中明顯高于治療前骨髓（0.79±0.21）VS（0.33±0.11）（圖1，t=9.512，P=0.000）。

圖1 Galectin-1基因表達(dá)水平

2.2 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化狀態(tài)

AML骨髓 Galectin-1基因甲基化陽性率為79.6%（43/54），對(duì)照組陽性率為17.1%（6/35），AML骨髓甲基化陽性率明顯高于對(duì)照組（χ2=33.510、P=0.000）。Galectin-1甲基化陽性率在治療前AML骨髓為75.0%(6/8)，而在完全緩解AML骨髓為12.5﹪(1/8)，兩者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.349、P=0.012）。

表1 Galectin-1基因在AML骨髓中的甲基化狀態(tài)

3 討論

DNA甲基化修飾是白血病發(fā)生發(fā)展過程中相當(dāng)普遍的一種表觀遺傳學(xué)改變，它在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。尋找白血病的有關(guān)甲基化沉默基因，將有助于闡明白血病的發(fā)病分子機(jī)制以及尋找新的白血病治療靶標(biāo)。半乳糖凝集素(Galectin)是動(dòng)物凝集素家族當(dāng)中的一員，目前已發(fā)現(xiàn)的Galectin家族成員有14個(gè)，在人類中，至少有12種Galectin分子，它具有多種生物學(xué)功能，Galectin-1在在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，臨床上可作為許多腫瘤的分子靶標(biāo)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，參與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-1在胃癌中表達(dá)陽性率為63%，Galectin-1高表達(dá)與腫瘤的大小、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-1主要功能是通過阻斷S/G2細(xì)胞周期，從而可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[9-10]。Galectin-1啟動(dòng)子區(qū)的堿基對(duì)大約有250個(gè)，其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化，是Galectin-1基因表達(dá)沉默的主要原因之一[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在T細(xì)胞白血病細(xì)胞中，檢測(cè)到了Galectin-1基因啟動(dòng)子甲基化[12]。Galectin-1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞株中出現(xiàn)甲基化，與細(xì)胞凋亡有關(guān)[13]。

為了解Galectin-1基因在AML中的表達(dá)水平及基因甲基化之間的關(guān)系，該研究選取初治和完全緩解的AML患者、正常對(duì)照為研究對(duì)象，檢測(cè)Galectin-1基因的甲基化情況。結(jié)果表明，在正常對(duì)照組Galectin-1表達(dá)明顯高于AML患者，經(jīng)過治療完全緩解后其表達(dá)量增加。而該基因甲基化狀態(tài)情況則與之相反，AML中Galectin-1基因甲基化陽性率為81%，正常對(duì)照甲基化陽性率為14%，完全緩解期仍為陽性可能預(yù)示著復(fù)發(fā)。Galectin-1基因表達(dá)水平和甲基化之間存在負(fù)相關(guān)性，與上述研究報(bào)道一致。因此，該研究認(rèn)為Galectin-1基因啟動(dòng)子區(qū)出現(xiàn)甲基化可能是導(dǎo)致該基因沉默的主要原因之一。

綜上所述，在AML中，Galectin-1基因出現(xiàn)高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)，Galectin-1基因作為一個(gè)候選的抑癌基因，其表達(dá)缺失在AML生發(fā)展過程中具有重要的作用。但由于臨床上AML完全緩解的骨髓樣本量較少，有關(guān)Galectin-1甲基化在AML治療過程中的應(yīng)用價(jià)值仍需進(jìn)一步研究，擴(kuò)大樣本量有助于進(jìn)一步明確Galectin-1與AML預(yù)后之間的關(guān)系，可為臨床上提供一種監(jiān)測(cè)AML預(yù)后與復(fù)發(fā)的標(biāo)記物。

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Study of Methylation of Galectin-1 Gene in Patients with Acute Myeloid Leukemia

LUO Ya-yue1,YIN Zhao-sheng2,FU Xiang-jie2,ZHANG Wei2,LIU Juan2,TAN Tan2
1.The Outpatient Department,Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University to South China,Chenzhou,Hunan Province, 413000 China；2.Center for Laboratory Medicine of Chenzhou First People's Hospital Affiliated to University of South China,Chenzhou Hunan Province,423000 China

Objective To detect acute myeloid leukemia (AML)methylation status of Galectin-1 gene,to investigate the expression and promoter methylation.Methods Our out-patient department,54 patients during January 2014 to December 2015 with AML before the treatment of bone marrow,bone marrow of 35 cases of the control and 8 cases of complete remission after treatment of AML bone marrow samples by methylation specific PCR (MS-PCR)to detect the methylation status of Galectin-1 gene.Results Galectin-1 gene expression levels in bone marrow in average AML was significantly lower than the control of bone marrow(0.35±0.09)VS(0.87±0.22)in complete remission,average expression level of AML in bone marrow was significantly higher than that before treatment of bone marrow(0.79±0.21)VS (0.33±0.11);Galectin-1 gene in bone marrow of methyl AML positive rate was significantly higher in the bone marrow(79.6%VS 17.1%),in complete remission in the bone marrow of methyl AML positive rate was significantly lower than before treatment(12.5%VS 75%);the expression level of Galectin-1 gene and its methylation negative correlation.Conclusion Galectin-1 gene in AML table Up to down or missing,and its promoter methylation related.

Acute Myeloid Leukemia；Galectin-1；Methylation

R733.71

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.02.01

2016-03-27；

2016-04-13

湖南省衛(wèi)生廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（B2010-127）。

羅雅月（1982.10-），女，湖南郴州人，主治醫(yī)師，在讀研究生，研究方向：腫瘤學(xué)，白血病發(fā)病機(jī)制。

譚潭（1980.1-），男，湖南祁陽人，碩士，主管檢驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：白血病發(fā)病機(jī)制，E-mail:tantan1413@126.com。