李琦，成莉鳳，段盛文，馮湘沅，彭源德*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

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三個(gè)苧麻脫膠高效菌種的生長(zhǎng)條件優(yōu)化

李琦1，2，成莉鳳1，段盛文1，馮湘沅1，彭源德1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長(zhǎng)沙 410205；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

研究3個(gè)苧麻脫膠高效菌種的最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)條件。利用分光光度計(jì)，以菌液濁度OD600為指標(biāo)，對(duì)苧麻脫膠高效菌種活化條件的主要參數(shù)(起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間)進(jìn)行研究。通過單因素和正交試驗(yàn)，獲得3個(gè)苧麻脫膠高效菌種活化條件的最優(yōu)組合。結(jié)果表明：Hn1-1菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間8 h；Hn2-2菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間7 h；Hn6-2菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，3個(gè)菌種的種子液生物量提高到1.5～2.0倍，為其在苧麻脫膠的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

脫膠菌種；生長(zhǎng)條件；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)

苧麻原麻除含有大量纖維素外，還含有果膠(4%-8%)、半纖維素(12%-18%)等“膠質(zhì)”成分[1]。無(wú)論利用麻纖維開發(fā)何種紡織產(chǎn)品，都必須經(jīng)過“脫膠”，除去這些鍵合型非纖維素物質(zhì)。傳統(tǒng)的漚麻方法存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)環(huán)境惡劣、不利于工業(yè)化生產(chǎn)等缺陷。化學(xué)脫膠方法存在成本高、能耗大、纖維制成率低、纖維品質(zhì)受到損傷和環(huán)境污染重等突出問題。生物脫膠方法具有“高效、清潔、低成本”等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)代麻類纖維提取的發(fā)展趨勢(shì)[2]。

麻類生物脫膠有菌脫膠和酶脫膠。與酶法脫膠相比，菌脫膠以成本低廉的優(yōu)勢(shì)，獲得了廣泛的工業(yè)化應(yīng)用[3-5]。已有研究顯示：菌脫膠過程中，菌種的最終脫膠能力與前期的活化狀態(tài)(生物量)密切相關(guān)[6-7]。本團(tuán)隊(duì)前期從特殊生境中采集土壤樣品，通過苧麻原麻富集培養(yǎng)后，用選擇培養(yǎng)基篩選到3個(gè)苧麻脫膠高效菌種。本研究擬對(duì)3個(gè)菌種的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高前期菌種活化的種子液生物量，為進(jìn)一步提高麻類生物脫膠效率提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌種

Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所農(nóng)產(chǎn)品加工微生物遺傳改良與應(yīng)用團(tuán)隊(duì)選育，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工微生物菌種保藏庫(kù)保存。

1.2培養(yǎng)基

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：改良營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配方[8]，其pH根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)調(diào)整。

固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、蛋白胨0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、瓊脂粉2%。

保藏斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、營(yíng)養(yǎng)瓊脂3.5%。

1.3主要儀器

分光光度計(jì)(DR-5000)購(gòu)自美國(guó)HACH 公司；pH計(jì)(HI9025)購(gòu)自意大利HANN公司；氣浴搖床(RH-Q)、水浴搖床(THZ-82)購(gòu)自中國(guó)榮華儀器公司；生化恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.4菌種活化流程

菌種活化流程參考文獻(xiàn)[9]。根據(jù)各單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)接種100 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在相應(yīng)培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，到合適的培養(yǎng)時(shí)間取樣(菌懸液)，測(cè)定OD600。

1.5生長(zhǎng)培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.5.1單因素試驗(yàn)

分別以培養(yǎng)溫度(28、30、35、37和40℃)、起始pH(5.0-9.0，間隔0.5)、接種量(1%-9%，間隔2%)和培養(yǎng)時(shí)間(4-10 h)為變量，固定其他生長(zhǎng)培養(yǎng)條件，每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以培養(yǎng)第8 h的菌液測(cè)得OD600為指標(biāo)選擇最優(yōu)水平[10]。

1.5.2正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)培養(yǎng)溫度、起始pH、接種量和培養(yǎng)時(shí)間設(shè)計(jì)四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)L9(34)(表1)[11]。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以O(shè)D600為衡量指標(biāo)，結(jié)合極差分析和方差分析選擇最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)條件組合。

表1生長(zhǎng)培養(yǎng)條件L9(34)正交試驗(yàn)因素及水平

Tab.1Factors and levels for orthogonal array design L9(34)

組號(hào)因素A因素B因素C因素D111112122231333421235223162312731328321393321

注：因素A，起始pH；因素B，接種量；因素C，培養(yǎng)溫度；因素D，培養(yǎng)時(shí)間。

1.6數(shù)據(jù)處理方法

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SAS 9.0進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1起始pH對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖1結(jié)果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種生長(zhǎng)的適宜pH分別為6.5、7.5和6.0。

圖1　起始pH對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.1.2接種量對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖2結(jié)果表明：Hn1-1和Hn2-2菌種生長(zhǎng)的適宜接種量均為5%；Hn6-2菌種生長(zhǎng)的適宜接種量為6%。

圖2　接種量對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.1.3培養(yǎng)溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖3結(jié)果表明：Hn1-1和Hn6-2菌種生長(zhǎng)的適宜溫度均為35℃；Hn2-2菌種生長(zhǎng)的適宜溫度為30℃。

圖3　培養(yǎng)溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.1.4培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

圖4結(jié)果表明：Hn1-1、Hn2-2和Hn6-2菌種在培養(yǎng)8 h后，均達(dá)到穩(wěn)定期。

圖4　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

2.2正交試驗(yàn)

2.2.1Hn1-1菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。表2和表3的結(jié)果表明：①影響Hn1-1菌種生長(zhǎng)的主次順序?yàn)椋篋>C>B>A，即培養(yǎng)時(shí)間>培養(yǎng)溫度>接種量>起始pH；②在選定條件下，最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)組合為A1B2C3D3，即：起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間8 h。

通過進(jìn)一步驗(yàn)證，Hn1-1菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，可達(dá)0.886，是最低設(shè)計(jì)組(OD600為0.496)的1.79倍。

表2Hn1-1菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的極差分析

Tab.2Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

組號(hào)因素A因素B因素C因素D平均OD60016.043360.49626.053570.65636.063780.81246.543580.75556.553760.61366.563370.55977.043770.57887.053380.73997.063560.520k10.6550.6100.5980.543k20.6420.6700.6440.598k30.6120.6300.6680.769R0.0420.0600.0700.226影響因素大小:D>C>B>A最優(yōu)組合:A1B2C3D3

表3Hn1-1菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的方差分析

Tab.3Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn1-1 strain

變異來(lái)源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.002820.0014F0.01(2,6)=10.925因素20.005520.0028F0.05(2,6)=5.143因素30.007520.00382.013F0.1(2,6)=3.463*因素40.083220.041622.277F0.25(2,6)=1.762***誤差e0.002820.0014修正誤差e0.011260.0019總和0.102

2.2.2Hn2-2菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。表4和表5的結(jié)果表明：①影響Hn2-2菌種生長(zhǎng)的主次順序?yàn)椋篊>D>B>A，即培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時(shí)間>接種量>起始pH；②在選定條件下，最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)組合為A3B3C2D3，即：起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間7 h。

通過進(jìn)一步驗(yàn)證，Hn2-2菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，達(dá)0.923，是最低設(shè)計(jì)組(OD600為0.471)的1.96倍。

表4Hn2-2菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的極差分析

Tab.4Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

組號(hào)因素A因素B因素C因素D平均OD60017.042850.47127.053060.76837.063270.78747.543070.84457.553250.53767.562860.65578.043260.70088.052870.73698.063050.809k10.6750.6720.6210.606k20.6790.6800.8070.708k30.7480.7500.6750.789R0.0730.0790.1860.183影響因素大小:C>D>B>A最優(yōu)組合:A3B3C2D3

表5Hn2-2菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的方差分析

Tab.5Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2 strain

變異來(lái)源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.010220.0051F0.01(2,6)=10.925因素20.011220.0056F0.05(2,6)=5.143因素30.055120.02765.244F0.1(2,6)=3.463**因素40.050620.02534.814F0.25(2,6)=1.762*誤差e0.010220.0051修正誤差e0.031660.0053總和0.137

2.2.3Hn6-2菌種的最佳培養(yǎng)條件組合

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)起始pH、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。表6和表7的結(jié)果表明：①影響Hn6-2菌種生長(zhǎng)的主次順序?yàn)椋築>C>A>D，即接種量>培養(yǎng)溫度>起始pH>培養(yǎng)時(shí)間；②在選定條件下，最佳生長(zhǎng)培養(yǎng)組合為A2B3C2D1，即：起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h。

通過進(jìn)一步驗(yàn)證，Hn6-2菌種在最佳條件下培養(yǎng)，生物量OD600最高，達(dá)0.953，是最低設(shè)計(jì)組(OD600為0.570)的1.67倍。

表6Hn6-2菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的極差分析

Tab.6Range analysis on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn6-2 strain

組號(hào)因素A因素B因素C因素D平均OD60016.053360.62826.063570.70036.073780.66346.553580.65156.563760.65966.573370.70277.053770.57087.063380.68497.073560.717k10.6640.6160.6710.668k20.6710.6810.6890.656k30.6570.6940.6310.666R0.0140.0780.0590.011影響因素大小:B>C>A>D最優(yōu)組合:A2B3C2D1

表7Hn6-2菌種L9(34)生長(zhǎng)條件正交試驗(yàn)的方差分析

Tab.7Analysis of variance on orthogonal array design L9(34) for growth conditions of Hn2-2

變異來(lái)源偏差平方和自由度方差F值Fa顯著水平因素10.000320.0001F0.01(2,6)=10.925因素20.010420.005246.897F0.05(2,6)=5.143***因素30.005420.002724.478F0.1(2,6)=3.463***因素40.000220.0001F0.25(2,6)=1.762誤差e0.000220.0001修正誤差e0.000760.0001總和0.016

3　討論

微生物的生長(zhǎng)繁殖除了取決于自身種屬外，還與生態(tài)環(huán)境條件(營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、pH等)有密切關(guān)系。溫度是影響苧麻脫膠菌種生長(zhǎng)最重要的因素之一。本研究的脫膠菌在溫度為30-40℃下的生長(zhǎng)量最大，與前人的研究結(jié)果一致[12-13]。從pH影響研究結(jié)果來(lái)看，3株苧麻脫膠菌對(duì)環(huán)境酸堿度都比較敏感，pH為中性或略微偏酸或偏堿的條件下生長(zhǎng)最好，pH過高或過低都不利于脫膠菌的生長(zhǎng)[14]。

4　結(jié)論

以菌懸液OD600值為指標(biāo)，優(yōu)化了3個(gè)苧麻脫膠高效菌種的生長(zhǎng)培養(yǎng)條件，即：(1)Hn1-1菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 6.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間8 h；(2)Hn2-2菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 8.0、接種量6%、培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時(shí)間7 h；(3)Hn6-2菌種的最佳生長(zhǎng)條件為起始pH 6.0、接種量7%、培養(yǎng)溫度35℃、培養(yǎng)時(shí)間6 h。

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Optimization of the Culture Conditions for Three Efficient Strains Used in Ramie Bio-degumming

LI Qi1，2, CHENG Lifeng1, DUAN Shengwen1, FENG Xiangyuan1, PENG Yuande1*

(1. Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, China;2. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The optimal culture conditions of three efficient strains used in ramie bio-degumming were researched. Cell suspension turbidity (optical density at 600 nm,OD600) was measured using spectrophotometer to investigate the optimal initial pH, inoculation amount, culture temperature and time of the activation conditions for efficient strain used in ramie bio-degumming. Using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method, optimal combination of the activation conditions for the three aimed efficient strains were found. Results showed that Hn1-1 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 5% in 8 h of incubation at initial pH 6.0 and 35.5℃, Hn2-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 6% in 7 h of incubation at initial pH 8.0 and 30℃, and Hn6-2 strain achieved the highest biomass with inoculation amount 7% in 6 h of incubation at initial pH 6.0 and 35℃ in the given conditions. Therefore, it can provide scientific basis for further application in ramie degumming as for the three improved liquid biomass (as 1.5～2.0 folds as that of originalOD600) by optimizing the culture conditions.

bio-degumming strain; growth condition; one-factor-at-a-time test; orthogonal test

1671-3532(2016)04-0181-07

2016-07-03

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程(No. ASTIP-IBFC)；湖南省自然科學(xué)基金(No. 2016jj3126)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) (No. CARS-19)

李琦(1983-)，男，博士研究生，研究方向：微生物及酶工程。E-mail：15007302343@139.com。

彭源德(1965-)，男，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工微生物遺傳改良與應(yīng)用。E-mail：ibfcpyd313@126.com。

S563.1

A