陳克志

摘要：通過實驗研究、文獻查閱等方式，對蛋白質鹽析與變性內(nèi)涵及霍夫梅斯特（Hofmeister）效應進行深入解讀，對蛋白質溶液中加入KSCN溶液時出現(xiàn)沉淀的意外現(xiàn)象展開了實證研究。結果表明，KSCN可以促進蛋白質變性，而沉淀的主因在于SCN-對蛋白質分子的影響，即除重金屬陽離子外的某些鹽的陰離子也能使蛋白質變性。因此，時下課堂教學中出現(xiàn)的一些關于蛋白質鹽析與變性的經(jīng)驗性結論還值得商榷，建議教師在教學處理時不應簡單地讓學生教條式記憶，而要為學生后續(xù)發(fā)展留足螺旋上升的空間。

關鍵詞：蛋白質；KSCN溶液；霍夫梅斯特（Hofmeister）效應 ；實驗探究

文章編號：1005–6629（2016）8–0052–03 中圖分類號：G633.8 文獻標識碼：B

1 問題背景

在現(xiàn)行高中化學教材介紹和討論蛋白質時，鹽析和變性等特性的學習與研究通常是中學教學的重點。眾所周知，向蛋白質溶液中加入飽和（NH4）2SO4、Na2SO4等濃的無機鹽溶液，能夠破壞蛋白質溶解形成的膠體結構而降低其溶解性并轉變?yōu)槌恋砦龀?，這種作用稱為鹽析；蛋白質遇到重金屬鹽、強酸、強堿等物質時會生成沉淀并不能在水中重新溶解，從而失去原有活性，這種變化叫做變性。實際教學時，為增加學生的真實性體驗，充分認識不同種類的鹽溶液對蛋白質鹽析和變性過程的影響，筆者在教材內(nèi)容基礎上對學生實驗所用的鹽類試劑進行了重新取舍，結果發(fā)現(xiàn)蛋白質在KSCN溶液中也會出現(xiàn)類似于重金屬鹽溶液的實驗現(xiàn)象。

為此，對蛋白質與KSCN溶液作用的沉淀現(xiàn)象展開研究，下面簡要回顧自己的探索與發(fā)現(xiàn)歷程，希望能與廣大同行對此問題作進一步深入探討。

2 實證研究

實驗1 取兩支小試管，試管A中加入4mL蛋白質溶液，逐滴滴加飽和（NH4）2SO4溶液，直至出現(xiàn)沉淀。用試管B取適量上述濁液，加入蒸餾水并不斷振蕩，然后與試管A作對照。

實驗2 按照實驗1中的步驟，改用下列鹽溶液與蛋白質作用，觀察蛋白質的析出與溶解情況。①飽和Na2SO4溶液；②飽和NaCl溶液；③飽和KSCN溶液；④飽和NH4Cl溶液；⑤AgNO3溶液；⑥PbAc2溶液；⑦CuSO4溶液

具體現(xiàn)象見表1。重復以上實驗1、2操作多次，結果保持一致。

為什么蛋白質在KSCN溶液中出現(xiàn)的沉淀加蒸餾水后不能重新溶解，蛋白質與KSCN的作用究竟是鹽析還是變性……大家對此困惑不已。

是否可能是試劑中重金屬離子濃度過高所致呢？查閱所用KSCN試劑商品標簽顯示，由上海譜振生物有限公司生產(chǎn)，化學純（C.P.），KSCN含量≧98.0%，銅的含量≦0.001%，鉛的含量≦0.001%。根據(jù)20℃下的溶解度數(shù)據(jù)（217g）不難計算出，KSCN飽和溶液中Cu2+、Pb2+的極大值濃度約為3.4×10-4 mol·L-1和1.0×10-4 mol·L-1。

實驗3 分別配制0.10 mol·L-1的CuCl2、PbAc2溶液。取3個小燒杯，分別加入45mL蒸餾水，依次用普通滴管（1mL試劑約為20滴）向燒杯A中滴加3滴CuCl2溶液，燒杯B中滴加1滴PbAc2溶液，燒杯C中同時滴加3滴CuCl2溶液和1滴PbAc2溶液，振蕩均勻后將上述所得鹽溶液分別與蛋白質溶液作用，均未出現(xiàn)渾濁或白色沉淀。

為進一步排除重金屬離子作用的可能性，筆者又購買了市場上其他幾種品牌的重金屬含量更低的分析純級試劑（KSCN含量≧98.5%，銅的含量≦0.0005%，鉛的含量≦0.0005%），生產(chǎn)商分別有上海展云化工有限公司、上海國藥集團化學試劑有限公司、山東濟寧恒泰化工有限公司、宜興市輝煌化學試劑廠等。配得相應飽和KSCN溶液后，再重復實驗2，結果與表1相同。可見，KSCN中重金屬離子濃度過高導致蛋白質出現(xiàn)沉淀的猜測不合理。

實驗4 取3支小試管，分別加入4mL蛋白質溶液，向試管A和B中分別逐滴滴加飽和K2SO4溶液、飽和KCl溶液，試管C作對照。試管A中略有渾濁，試管B約半小時后略有渾濁，若繼續(xù)向以上兩試管中加入蒸餾水并不斷振蕩，重新恢復澄清。

實驗5 取3支小試管，分別加入4mL蛋白質溶液，向試管A和B中分別逐滴滴加飽和NH4SCN溶液、飽和NaSCN溶液，試管C作對照。試管A出現(xiàn)明顯的沉淀，試管B放置10分鐘后也逐漸出現(xiàn)渾濁、沉淀，若繼續(xù)向以上兩試管中加入蒸餾水并不斷振蕩，渾濁現(xiàn)象不消失。

實驗6 將KSCN、NH4SCN和NaSCN的飽和溶液與蒸餾水分別按體積比1：1，1：3，1：5等稀釋后再與蛋白質溶液作用，等待一定時間后也均會出現(xiàn)不同程度的渾濁，若繼續(xù)加入蒸餾水并振蕩，也未見渾濁明顯減少。

綜合以上實驗4、5和6現(xiàn)象說明，促使蛋白質溶液出現(xiàn)沉淀的根源在于SCN-，SCN-濃度越大時沉淀效果越明顯，且后續(xù)加水并不能使之重新溶解。

3 理論分析

3.1 蛋白質的鹽析與變性

查閱文獻[1]獲知，目前科學界普遍認為，鹽類對蛋白質的沉淀作用，除了影響蛋白質的表面電荷外，更主要是通過離子與水分子的影響，改變了水分子與蛋白質分子的相互作用，造成沉淀，即其作用主要是通過水分子間接實現(xiàn)的。

形成蛋白質的多肽是由多個氨基酸脫水而成，在多肽鏈的兩端必然存在著自由的氨基與羧基，而在側鏈中也存在酸性或堿性基團。整個蛋白質分子的外表面大多數(shù)為親水性的氨基酸殘基（如羧基、羥基、氨基等），而分子內(nèi)部則主要是疏水性的氨基酸殘基。蛋白質含有的這些親水性基團能與極性的水分子通過靜電相互作用形成水化膜，當?shù)鞍踪|分子表面親水基團越多時，水化膜層越厚，蛋白質分子與溶劑分子間的親和力越大，相應溶解度也就越大。因此，蛋白質顆粒是一種親水膠體。當向蛋白質膠體分散系中加入鹽類時，由于后者在水中電離生成的陽離子或陰離子的親水性大于蛋白質分子的親水性，故而會奪走蛋白質周圍的水分子，破壞了水化膜，暴露出蛋白質的疏水區(qū)域，同時中和了蛋白質所帶電荷，使蛋白質膠粒相互碰撞增多而凝聚析出[2]。這就是蛋白質鹽析的基本原理。

至于蛋白質的變性，一般認為，蛋白質具有生理活性，不論通過何種方法（如溫度、壓力、變性劑等物理、化學方法），只要能使其失去活性，即可稱作變性。蛋白質分子之所以具有特殊的生理活性，是因為其具有一個嚴密卷曲的空間結構。蛋白質的空間結構可分為四級[3]。一級結構是指蛋白質中的氨基酸單元按一定順序排列的化學結構；二級結構指多肽鏈通過氫鍵自身繞曲折疊成的特有的結構單元；三級結構是多肽鏈在二級結構基礎上進一步繞曲折疊成特定的空間結構；四級結構是多條多肽鏈在三級結構基礎上相互間通過一些副鍵締合而成完整的蛋白質分子。蛋白質的變性就是蛋白質在特定條件下，其特定結構被破壞（即四級、三級、二級結構發(fā)生變化），從而失去生物活性的過程。

3.2 霍夫梅斯特（Hofmeister）效應

迄今為止，主要有兩種理論來解釋霍夫梅斯特效應，第一種理論認為是由離子對水的氫鍵網(wǎng)絡結構的影響造成的，離子對水結構的影響改變了水分子與蛋白質分子的相互作用，從而導致蛋白質的沉淀，即鹽類通過對水分子的影響，進而對蛋白質的穩(wěn)定性和活性等生化過程產(chǎn)生影響，這種理論已被多數(shù)科學家認可；另一種理論認為分散力是影響各種離子霍夫梅斯特效應的主要因素，這種理論是通過理論計算的方法得到的，由于缺乏實驗數(shù)據(jù)的支持而缺乏說服力，只被少數(shù)人所接受。

3.3 KSCN對蛋白質溶液的作用分析

當不同種類的鹽溶液加入到蛋白質溶液中時，其離子對蛋白質的結構影響能力是有差別的。雖然Cu2+、Ag+等重金屬陽離子對蛋白質的四級結構、三級結構甚至二級結構會快速地破壞而使之失活，但并不代表鹽中的陰離子就不會引起蛋白質的變性。根據(jù)霍夫梅斯特效應對蛋白質沉淀能力的序列可知，SCN-屬于陰離子中促其變性能力最強的chaotrope，并且常溫下KSCN的溶解度又非常大（20℃時為217g），在起到中和蛋白質表面電性的同時會對溶劑水的氫鍵網(wǎng)絡結構造成嚴重破壞，進而影響蛋白質的多級結構并促其變性，蛋白質也因溶解性的不斷下降而凝聚析出。

因此，如同加入Cu2+、Ag+等變性劑，當向蛋白質溶液中加入含SCN-的鹽溶液時，首先會對溶劑水規(guī)則的網(wǎng)絡結構造成影響，減弱溶劑水的有序性。開始階段SCN-只破壞了蛋白質的四級結構，使包藏在蛋白質分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基等更多地暴露出來；經(jīng)過一段時間，蛋白質維持空間結構的各種副鍵（如疏水鍵、氫鍵、二硫鍵等）也進而逐步被破壞，傷及到蛋白質的三級和二級結構，使整個分子變得松散。變化后的蛋白質具有許多特性，如溶解度顯著減小、不溶于水等，不再如鹽析般具有可逆性。

4 結論和啟示

向蛋白質溶液中加入較高濃度的KSCN溶液，所含離子在起到中和蛋白質表面電性作用的同時，SCN-還會對溶劑水的氫鍵網(wǎng)絡造成嚴重破壞，使水的構造變得無序，進而影響到蛋白質的多級結構并促其變性，導致蛋白質的溶解性不斷下降而凝聚析出。可見，KSCN也可促進蛋白質的變性而沉淀，根源主要在于SCN-的影響。為此，基于學生發(fā)展的角度審視，時下課堂中存在的一些有關蛋白質鹽析與變性的經(jīng)驗性結論還存在值得商榷之處，教師在教學處理時不能簡單地讓學生進行教條式記憶，應該為學生后續(xù)的學習留足螺旋上升的空間。

參考文獻：

[1][4]李偉，歐陽藩. Hofmeister效應與包含體的變性與復性[J].生物技術通報，2004，（4）：37～40.

[2]楊光弟，楊忠金，靳林.水溶性蛋白鹽析結晶的動力學過程分析[J].中國醫(yī)學物理學雜志，2012，29（2）：3293～3321.

[3]郭超騰. CuSO4溶液使蛋白質凝聚后為什么可再溶解[J].化學教學，2001，（11）：45～46.

[5]黃芳，馬驍，沈青. Hofmeister效應對生物和化學體系的影響[J].廣州化學，2010，35（4）：50～60.