李少暉　關(guān)亞風(fēng)　耿旭輝　陳士恒　謝云峰　楊永壇*

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室,北京 102209;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023)

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一種新型黃曲霉毒素專用檢測器與市售商品化進口熒光檢測器的應(yīng)用性能對比

李少暉1關(guān)亞風(fēng)2耿旭輝2陳士恒1謝云峰1楊永壇1*

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室,北京 102209;2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023)

對比了一種自制LED熒光檢測器與市售商品化進口熒光檢測器檢測黃曲霉毒素的性能差異，利用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示：自制LED熒光檢測器的檢出限和信噪比優(yōu)于市售商品化進口熒光檢測器，重復(fù)性不遜于市售商品化進口熒光檢測器，是一種理想的黃曲霉毒素專用檢測器，適合在基層實驗室推廣。

黃曲霉毒素專用檢測器商品化檢測器儀器比對統(tǒng)計分析

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長過程中分泌產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，其他真菌如毛霉、青霉、鐮孢曲霉等也能產(chǎn)生黃曲霉毒素[1,2]。黃曲霉毒素是一類結(jié)構(gòu)相似的化合物的總稱，其存在著多種異構(gòu)體和衍生物。常見的黃曲霉毒素主要包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2)等[3]，黃曲霉毒素具有很強的毒性、致癌性、致突變性和致畸毒性,其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大[4]，短期接觸大量黃曲霉毒素能夠引起急性毒性反應(yīng)，包括發(fā)熱、腹痛、嘔吐等，嚴(yán)重者會出現(xiàn)肝脾腫大、肝區(qū)疼痛、皮膚黏膜黃染、腹水、下肢浮腫及肝功能異常等中毒性肝病癥狀[5]；同時黃曲霉毒素還是潛在的致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)人類肝癌的發(fā)生和發(fā)展。實驗表明:黃曲霉毒素B1的毒性為氰化鉀的10倍,砒霜的68倍；且其致癌性是二甲基亞硝胺的70倍，基于以上數(shù)據(jù)，黃曲霉毒素已被國際癌癥研究組織(international agency for research on cancer,IARC)確定為I類致癌物[6,7]。

食物中的黃曲霉毒素主要來源于因儲存不當(dāng)?shù)仍蚨l(fā)生霉變的糧食和谷物，特別是霉變后的花生和玉米中的黃曲霉毒素含量較高，使用霉變的花生和玉米所制成的糧油制品中同樣存在著較為嚴(yán)重的黃曲霉毒素污染[8]。隨著多起黃曲霉毒素污染事件的發(fā)生,世界各國相關(guān)機構(gòu)和廣大消費者對食品安全愈發(fā)關(guān)切。我國對食品中黃曲霉毒素B1也采取了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 2761-2011):花生、玉米及其制品中的黃曲霉毒素B1含量≤20 ng/g;大米及其他食用油的黃曲霉毒素B1含量≤10 ng/g,糧食、豆類、發(fā)酵食品及調(diào)味品中的黃曲霉毒素B1含量≤5 ng/g,乳制品及嬰兒配方食品中黃曲霉毒素B1、M1≤10 ng/g[9]。

目前國內(nèi)外的黃曲霉毒素檢測方法主要包括(超)高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法等[10]；薄層色譜法操作簡單，檢測成本低，但是在檢測過程中需要接觸大量有毒有害有機試劑，故此方法已逐漸被淘汰[11]；質(zhì)譜法具有高通量、高靈敏度、快速、無需衍生化等優(yōu)點[7]，但是儀器成本及維護費用較高，儀器操作較為復(fù)雜，目前在基層實驗室還未得到廣泛的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附測定法具有檢測速度快、特異性高、前處理簡單、成本低等優(yōu)點[12]，但其存在嚴(yán)重的假陽和假陰性等問題[13]，而且其結(jié)果的穩(wěn)定性和基質(zhì)適應(yīng)性仍未得到有效地改善，故此方法多用于樣品快速篩查和現(xiàn)場檢測。高效液相色譜-熒光檢測器法檢測黃曲霉毒素是實驗室日常進行黃曲霉毒素檢測的主要方法[14]，由于黃曲霉毒素B1和G1遇水會發(fā)生熒光淬滅，故須用衍生劑對其進行柱前或者柱后衍生，該方法重復(fù)性好、檢出限低、靈敏度高，儀器及維護成本適中，現(xiàn)已在基層實驗室得到了非常廣泛的應(yīng)用[15]。

但是，基層實驗室，特別是依托于生產(chǎn)環(huán)節(jié)的質(zhì)控實驗室的日常檢測項目相對集中，關(guān)注的風(fēng)險指標(biāo)種類范圍較窄，通用型檢測器(熒光檢測器，二極管陣列檢測器等)在實際應(yīng)用中的使用效率較為低下，應(yīng)用性價比不高。針對食品行業(yè)重點關(guān)注的風(fēng)險指標(biāo)制造有針對性的，廉價的專用型檢測器能夠在保證日常檢測要求的前提下為基層實驗室降低儀器購置和維護成本，提高儀器使用效率。專用型檢測器一般針對某一種或者某一類物質(zhì)的檢測而設(shè)計，將與待測物檢測有關(guān)的控制設(shè)備模塊化、檢測參數(shù)固定化，從而舍去或者簡化了通用型檢測器中一些不必要的部件，特別是一些易耗部件和高價部件，進而大大降低了檢測器的造價和維護成本。

本研究對比了一種自主研發(fā)制造的黃曲霉毒素專用LED-熒光檢測器(DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器，以下簡稱DICP-AF01檢測器，DICP-AF01 Detector)與市售商品化進口熒光檢測器(以下簡稱商品化檢測器，Commercial FLD)的性能差異，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品檢測數(shù)據(jù)、實際樣品檢測數(shù)據(jù)，使用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較兩種檢測器各方面性能的差異。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

某品牌市售商品化進口高效液相色譜儀-熒光檢測器系統(tǒng)；Millipore Advantage超純水機(美國Millipore公司);Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)；TTL DC 氮吹儀(中國同泰聯(lián)科技)；玻璃纖維濾紙(英國Whatman公司)。黃曲霉毒素總量免疫親和柱(Romer Labs,COIAC1004)；甲醇(色譜純，迪馬公司);黃曲霉毒素(B1、B2、G1、G2)標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)；實驗用水為Millipore超純水機制備的超純水。

統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS 19.0(Statistical Product and Service Solutions 19.0，IBM公司)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，使用成對樣本t檢驗比較檢出限和重復(fù)性，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器

DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器為中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所研制。該檢測器采用正交光學(xué)結(jié)構(gòu)，以發(fā)光二極管(LED)為激發(fā)光源，自研制的AccuOpt光電放大組件為熒光接收器件，采用光線追跡法對檢測器全光路進行模擬優(yōu)化，使用LED、濾光片、透鏡，形成大體積、小峰展寬流通池和高信噪比熒光檢測池，適用于液相色譜儀。

DICP-AF01檢測器整機采用模塊化設(shè)計，能適用于HPLC、FIA等不同系統(tǒng)；且該檢測器功耗小(<300 mW)，光源穩(wěn)定、故障率低，可用于基層實驗室檢測食品和飼料中的黃曲霉毒素殘留。

1.3色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18(5μm，150mm×4.6mm)；柱溫：30℃；進樣量：20μL；流動相：甲醇:水=45∶55(等度洗脫)，流速：0.8mL/min；碘衍生反應(yīng)條件：衍生溶液為0.05%碘溶液，衍生液流速為0.2mL/min，衍生反應(yīng)管溫度：70℃。

商品化檢測器條件：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm。

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)：DICP-AF01黃曲霉毒素專用檢測器采用浙大N2000色譜工作站，市售商品化進口熒光檢測器采用儀器自帶的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，其中通過液相色譜儀的觸發(fā)器連接N2000色譜工作站的數(shù)據(jù)采集信號開關(guān)，實現(xiàn)兩個數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的同步和數(shù)據(jù)的自動存儲，儀器連接方式見圖1。

圖1　實驗裝置儀器連接示意圖

1.4樣品前處理方法

稱取5g研磨后的花生樣品至50mL離心管，加入1g氯化鈉和25mL提取液(甲醇∶水=7∶3)，混勻。高速渦旋10min，離心，取提取液用定量濾紙過濾。移取15mL濾液并加入45mL水稀釋，混勻。用玻璃纖維濾紙過濾至澄清。取20mL澄清的濾液通過免疫親和柱，調(diào)節(jié)壓力，使液體以約3mL/min的流速通過親和柱，直至空氣進入親和柱中。分別用10mL水淋洗親和柱兩次并抽干。再先后用1mL甲醇和1mL水分別洗脫親和柱并收集全部洗脫液，混勻后HPLC分析測定。

2　實驗結(jié)果與討論

2.1兩種檢測器檢測標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢出限和重復(fù)性對比

對專用型檢測器的性能的評價主要包括信噪比、重復(fù)性、易耗部件壽命、能耗、工作環(huán)境耐受度等。本研究主要從實驗室應(yīng)用和方法學(xué)適應(yīng)性的角度考察了檢測器的信噪比和重復(fù)性。信噪比能夠衡量待測物在儀器上所產(chǎn)生的信號相比較于背景噪音和雜質(zhì)產(chǎn)生的無效信號的明顯程度，從而決定待測物質(zhì)的檢出限和定量限。重復(fù)性能夠反映儀器信號產(chǎn)生的穩(wěn)定性，從而體現(xiàn)出儀器在檢測過程中產(chǎn)生的偶然誤差的大小。

本實驗首先利用標(biāo)準(zhǔn)品溶液對DICP-AF01檢測器與商品化檢測器的檢出限和重復(fù)性進行對比，從而比較背景噪音、電噪音等儀器固有背景信號對4種黃曲霉毒素的檢出限和重復(fù)性的影響。

使用流動相逐級稀釋配制黃曲霉毒素B1、G1濃度相當(dāng)于0.05ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中黃曲霉毒素B2、G2的濃度為0.015ng/mL、0.075ng/mL、0.15ng/mL、0.3ng/mL、0.75ng/mL、1.5ng/mL、3ng/mL、6ng/mL。使標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)過DICP-AF01檢測器上的在線柱后衍生模塊后依次流入DICP-AF01檢測器和商品化熒光檢測器(圖1)，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進樣5次，利用工作站采集處理信息，計算信噪比、檢出限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

以含黃曲霉毒素B1、G1濃度為0.05 ng/mL，黃曲霉毒素B2、G2濃度為0.015 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣獲得色譜圖見圖2。

從圖2中可以看出，商品化檢測器產(chǎn)生的信號中黃曲霉毒素G2、G1、B2的信噪比均小于3，可以判定為未檢出；黃曲霉毒素B1的信噪比稍高，基本達(dá)到檢出限(S/N=3.896)。而DICP-AF01檢測器產(chǎn)生的信號中4種黃曲霉毒素均達(dá)到檢出限，信噪比分別為：3.568、5.362、3.856、6.331。可以看出DICP-AF01檢測器的檢出限明顯低于商品化熒光檢測器。

利用SPSS統(tǒng)計分析軟件比較兩種檢測器的檢出限和重復(fù)性，對每種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的5次平行測定計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；計算低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.05ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL)的檢測結(jié)果的信噪比。利用SPSS統(tǒng)計分析軟件對經(jīng)過兩種檢測器采集處理后得到的峰面積和峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以及信噪比進行成對樣本t檢驗，觀察其顯著性，結(jié)果見表1和表2。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖(a).DICP-AF01檢測器;(b).商品化熒光檢測器AFB1、AFG1=0.05ng/mL；AFB2、AFG2=0.015ng/mL

黃曲霉毒素樣本容量(N)自由度(df)t值p值(雙側(cè))黃曲霉毒素B12019-6.7160.003**黃曲霉毒素B22019-7.5450.003**黃曲霉毒素G12019-13.2330.001**黃曲霉毒素G22019-16.4440.005**

*差異顯著**差異極顯著

從表1中可以看出，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度在0.05ng/mL～1ng/mL范圍時，兩種檢測器檢測4種黃曲霉毒素的信噪比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義且差異極為顯著，p<0.01。表1中4種黃曲霉毒素的t值均為負(fù)，可以判定在低濃度時DICP-AF01檢測器的信噪比、檢出限明顯優(yōu)于商品化熒光檢測器。

表2　兩種兩種檢測器檢測4種黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比較(n=8)

*差異顯著**差異極顯著

從表2中可以看出，黃曲霉毒素G1在兩種檢測器上連續(xù)進樣5次所產(chǎn)生信號信號(峰面積、峰高)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差具有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.05，且t>0，而黃曲霉毒素B1、B2、G2在兩種檢測器上連續(xù)進樣5次所產(chǎn)生信號信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差沒有統(tǒng)計學(xué)意義?？梢耘卸?，DICP-AF01檢測器的檢測黃曲霉毒素G1的重復(fù)性優(yōu)于商品化熒光檢測器，使用兩種檢測器其他的3種黃曲霉毒素的重復(fù)性無差別。

2.3兩種檢測器檢測實際樣品檢出限和重復(fù)性對比

在實際樣品檢測中，除了儀器的固有噪音和波動會對檢測信號有所影響之外，樣品中未被凈化完全的雜質(zhì)和基質(zhì)物質(zhì)也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾。

有機溶劑萃取-免疫親和柱凈化是食品中黃曲霉毒素檢測最常用的前處理手段[16]，免疫親和柱上載有能夠特異性吸附黃曲霉毒素的抗體，樣品提取液經(jīng)過親和柱后待測物被吸附保留在抗體上，雜質(zhì)隨提取液和淋洗液流出。最終使用含有高濃度有機溶劑的洗脫液破壞抗體，使得待測組分隨洗脫液流出，用于檢測。由于黃曲霉毒素G1和B1遇水會發(fā)生熒光淬滅，所以在使用高效液相色譜-熒光檢測器是需要使用衍生劑對其進行柱前或者柱后衍生。

本實驗利用花生為基質(zhì)制備加標(biāo)陽性樣品，加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為0.5ng/g、5ng/g、20ng/g，對樣品進行前處理后利用DICP-AF01檢測器和商品化熒光檢測器先后對上機溶液進行測定。使上機溶液經(jīng)過DICP-AF01檢測器上的在線柱后衍生模塊后依次流入DICP-AF01檢測器和商品化熒光檢測器(如圖1)，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進樣3次，利用工作站采集處理信息，計算信噪比和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS統(tǒng)計分析軟件對經(jīng)過兩種檢測器采集處理后得到的峰面積和峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差以及信噪比進行成對樣本t檢驗，觀察其顯著性，結(jié)果見表3和表4。

表3　兩種檢測器檢測花生中4種黃曲霉毒素(0.5ng/g)的信噪比比較(n=6)

*差異顯著**差異極顯著

從表3中可以看出，在低濃度(0.5ng/g)花生加標(biāo)樣品上機溶液的檢測結(jié)果中兩種檢測器檢測4種黃曲霉毒素的信噪比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，p(AFB2)<0.05，p(AFB1、G1、G2)<0.01。表中4種黃曲霉毒素的t值均為負(fù)，可以判定在花生基質(zhì)的作用下，DICP-AF01檢測器的信噪比、檢出限仍明顯優(yōu)于商品化熒光檢測器。

表4　兩種檢測器檢測花生中4種黃曲霉毒素的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差比較(n=6)

續(xù)表4

*差異顯著**差異極顯著

從表4中可以看出，4種黃曲霉毒素在兩種檢測器上產(chǎn)生信號的重復(fù)性沒有統(tǒng)計學(xué)意義，p>0.05，故可認(rèn)為DICP-AF01檢測器的檢測花生樣品中的4種黃曲霉毒素與商品化熒光檢測器的重復(fù)性無差別。

3　結(jié)論

本實驗對比了自行開發(fā)研制的DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器與市售商品化熒光檢測器的性能，并將所得數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計檢驗。結(jié)果顯示，DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器的靈敏度和檢出限明顯優(yōu)于市售熒光檢測器，重復(fù)性不遜于市售商品化熒光檢測器，是一種理想的專用型黃曲霉毒素在線柱后衍生-熒光檢測器。

DICP-AF01黃曲霉毒素專用熒光檢測器能夠針對性地對黃曲霉毒素進行在線柱后衍生和檢測，且操作簡單；其光源采用LED發(fā)光二極管，成本低，壽命長，非常適合基層實驗室展開黃曲霉毒素的專項檢測，以應(yīng)對日益嚴(yán)峻的黃曲霉毒素污染風(fēng)險的挑戰(zhàn)，保障國民糧食安全和身體健康。

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Comparison of a self-developed dedicated detector for aflatoxin with a commercially available imported fluorescence detector.

Li Shaohui1,Guan Yafeng2,Geng Xuhui2,Chen Shiheng1,Xie Yunfeng1,Yang Yongtan1*

(1.Beijing Key Laboratory of Nutrition Health and Food Safety,Nutrition &Health Research Institute of COFCO Corporation,Beijing 102209,China;2.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China)

All data were processed with SPSS statistical software.The results indicated that the detection limit of self-developed LED fluorescence detector was superior to commercial fluorescence detector,the reproducibility of self-developed LED fluorescence detector was as equal as commercial fluorescence detector.The self-developed LED fluorescence detector is an ideal aflatoxin dedicated detector,especially suitable for the basic laboratory.

aflatoxin;specific detector;commercial detector；detector comparison；statistic analysis

李少暉,男，碩士，研發(fā)專員,主要研究方向為食品質(zhì)量與安全，E-mail:lishaohui@cofco.com。

楊永壇,男，博士，研究員,主要研究方向為食品質(zhì)量與安全，E-mail:yangyongtan@cofco.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.04.018

2016-02-16