萬智巍，李明啟，李姮瑩

(1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所/陸地表層格局與模擬院重點實驗室，北京 100101；2.鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室/江西師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院，江西南昌 330022)

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小麥族植物淀粉粒形態(tài)研究

萬智巍1,2，李明啟1，李姮瑩2

(1.中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所/陸地表層格局與模擬院重點實驗室，北京 100101；2.鄱陽湖濕地與流域研究教育部重點實驗室/江西師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院，江西南昌 330022)

為深入研究小麥族植物的淀粉粒形態(tài)特征，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對收集于中國的16種小麥族植物淀粉粒形態(tài)進行分析。結(jié)果表明，小麥族植物淀粉粒均為單粒淀粉粒，二維形狀上大多為近圓形，部分呈橢圓形。從淀粉粒組合形式上來看，16個樣品均包含有A型(>10 μm)和B型(<10 μm)淀粉粒。其粒徑大小與圓度存在正相關(guān)關(guān)系(R2=0.401 3)，即平均粒徑越大，其圓度越高，在二維形態(tài)上越接近正圓。聚類結(jié)果表明，16個樣品可以分為5類，鵝觀草與黑麥淀粉粒差異最為明顯，各為一類；二棱皮大麥、六棱皮大麥、披堿草、硬粒小麥為第三類；斯卑爾托山羊草、野生大麥、大麥為第四類；二棱裸大麥、新疆大麥、六棱裸大麥、纖毛鵝觀草、春小麥、小麥無芒螞蚱、野生二粒小麥為第五類。根據(jù)多變量分析結(jié)果，提出了小麥族植物淀粉粒鑒定的判別方程式。研究成果充實了小麥族植物淀粉粒數(shù)據(jù)庫和圖譜。

小麥族；淀粉粒；形態(tài)；多變量分析

麥類作物在中國尤其是北方被大面積種植，是人們的主要食物來源。目前普遍認為它們是在一萬年以前的西南亞地區(qū)被馴化[1]，在距今4 500～4 000年間傳入中國。麥類作物的傳入從根本上動搖了中國北方旱作農(nóng)業(yè)的種植傳統(tǒng)，促使當(dāng)?shù)赜梢蕾囁陬愊螓滎愖魑镛D(zhuǎn)化[2]。特別是在文明的早期，人類可能馴化和利用了各種小麥族植物。為了更好地了解小麥族植物的利用過程，很多學(xué)者開始嘗試利用不同分析方法進行各種小麥族植物的鑒定和分類工作。如甯順腙等[3]研究了小麥族11個種的葉綠體psaC基因序列，進行了系統(tǒng)學(xué)和遺傳多樣性分析。還有學(xué)者利用核型分析方法，研究了鵝觀草、賴草等5種小麥族植物的分類和演化關(guān)系[4]。但是以往的研究大多集中于目前人類主要栽培的小麥、大麥等，較少系統(tǒng)研究其他的品種。因此，本研究通過收集中國常見的小麥族植物并對其進行淀粉粒分析，利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡構(gòu)建中國常見小麥族植物淀粉粒數(shù)據(jù)庫和圖譜，以期為小麥族植物研究提供基礎(chǔ)資料和數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

全世界小麥族植物約有20個屬，我國連同栽培種約有170多個種[5-6]。本研究選取了分布于我國的小麥屬(Triticum)、大麥屬(Hordeum)、披堿草屬(Elymus)、黑麥屬(Secale)、山羊草屬(Aegilops)、鵝觀草屬(Roegneria)等6個屬共計16個種的小麥族植物進行淀粉粒分析(表1)。

表1　供試小麥族植物樣品名稱

1.2試驗方法

植物樣品淀粉粒提取及光學(xué)顯微鏡觀察：每種樣品分別取一粒籽粒放入15 mL一次性塑料試管中，加入3 mL超純水，浸泡6～12 h；用玻璃棒輕碾樣品使其充分破碎，靜置30 min后攪拌均勻；取100 μL淀粉懸浮液滴于載玻片上，待稍干后，加入50 μL濃度為20%的甘油，并用無色指甲油封片。在OLYMPUS BX-51生物顯微鏡下放大400倍觀察并用數(shù)碼相機拍照，記錄淀粉粒類型(單粒、復(fù)粒、半復(fù)粒)、大小(長度、寬度)、二維形狀、三維形狀、表面形狀及結(jié)構(gòu)、層紋、裂隙、臍點位置等特征。擠壓蓋玻片，觀察淀粉粒形態(tài)特征變化，并拍照記錄。

植物穎果掃描電子顯微鏡分析：用鑷子夾住穎果兩端，用力使其自然斷裂為兩段；將一段粘附在樣品臺上，使斷裂面朝上，放置于E-1045型離子濺射儀樣品艙中，在15 mA電流下噴金60～90 s；將樣品取出，放入HITACHI S-3400N掃描電子顯微鏡中，在2 000倍放大觀察并拍照。

1～16:樣品編號。圖3和圖6同。　　1-16：Sample No..The same as in Fig.3 and Fig.6.

利用SPSS 20統(tǒng)計分析軟件將定性和定量描述數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為多變量分析數(shù)據(jù)，利用主成分分析、聚類分析等方法對淀粉粒進行歸類和區(qū)分。

2　結(jié)果與分析

2.1淀粉?；咎卣?/p>

根據(jù)16個樣品的光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡圖譜(圖1)可知，被測樣品的淀粉粒均為單粒淀粉粒。二維形狀上大多為近圓形，部分呈橢圓形；三維形態(tài)均與鐵餅或扁狀圓柱體比較接近，其厚度約為3～7 μm，粒徑與厚度的比值約為5∶1。從淀粉粒組合形式上來看，16個樣品的淀粉粒均由A型(>10 μm)和B型(<10 μm)[7-8]淀粉粒構(gòu)成。

電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，小麥族植物淀粉粒有著不同大小的淀粉粒組合形式。以黑麥為例，圖1(12B)、圖2A和圖2B分別為2 000倍、5 000倍和10 000倍的照片。從圖2A可以看出黑麥淀粉粒可以分為大小兩組，一組粒徑為22.30 μm，另一組粒徑為2～6 μm。同時可以觀察到黑麥淀粉粒表面分布有很多小凹坑。通過對10 000倍掃描電鏡放大照片的觀察，可以發(fā)現(xiàn)黑麥淀粉粒中還有些更小的淀粉粒(圖2B)，其粒徑約0.8 μm。

圖2　黑麥淀粉粒掃描電子顯微鏡照片(A:5 000倍;B:10 000倍)

圖3　淀粉粒粒徑箱線圖

2.2淀粉粒粒徑的差異

測定樣品通過淀粉粒中心的直徑，利用Origin 8.0統(tǒng)計軟件繪制16個樣品的粒徑箱線圖(圖3)。從圖3可以看出，被測植物淀粉粒粒徑的分布存在差異。從平均粒徑來看，黑麥的粒徑最大，為25.22 μm，其次是斯卑爾脫山羊草，為17.03 μm，鵝觀草、春小麥、無芒螞蚱小麥、野生二粒小麥及硬粒小麥均小于10 μm，其他幾個樣品的平均粒徑在10～15 μm之間。從最大粒徑來看，除了披堿草和鵝觀草小于20 μm外，其他均大于20 μm，最大值為黑麥，達到43.43 μm，斯卑爾脫山羊草和六棱裸大麥淀粉粒粒徑最大值也都超過了30 μm，其他的介于20～30 μm之間?？紤]到粒徑較小的淀粉粒沒有鑒別特征，在只考慮粒徑大于10 μm的淀粉粒時，黑麥的平均粒徑仍然最大，為30.31 μm，其次是六棱裸大麥(22.68 μm)，第三是斯卑爾脫山羊草(21.00 μm)，鵝觀草最小，僅為12.15 μm。

2.3淀粉粒二維形狀的差異

本研究中16種小麥族植物的淀粉粒在形態(tài)上基本都是圓形和橢圓形，但是樣品的二維形狀之間存在不同程度差異。從圖1可以觀察到，披堿草淀粉粒的形狀較不規(guī)則，而大麥、黑麥的淀粉粒較為規(guī)則，接近正圓形。由淀粉粒圓度的測量結(jié)果(表2)可知，16個樣品的圓度存在差異，其中黑麥淀粉粒圓度為0.917，接近于正圓的圓度值1。而硬粒小麥淀粉粒的圓度則為0.752。

為了對小麥族植物粒徑大小與圓度的關(guān)系做進一步了解，將樣品的平均粒徑值與樣品的圓度值進行相關(guān)分析。根據(jù)SPSS軟件計算的結(jié)果(圖4)可知，粒徑大小與圓度之間存在顯著正相關(guān)(R2=0.401 3)，即平均粒徑越大，其圓度也就越高，在二維形態(tài)上也就越接近正圓形。

2.4多變量分析

利用多變量分析方法，綜合顯微鏡觀察結(jié)果提取出的變量因子，通過SPSS 20軟件構(gòu)建判別方程式并進行主成分分析和聚類分析。

2.4.1變量指標(biāo)體系的選取

在淀粉粒形態(tài)指標(biāo)的選取上，綜合參考相關(guān)學(xué)者提出的方案[9-11]，選取以下10個指標(biāo)作為本次淀粉粒分析的變量(表3)。所選取的指標(biāo)可分為名義變量和幾何變量兩大類。名義變量主要是指示某一現(xiàn)象是否出現(xiàn)，如是否出現(xiàn)層紋、臍點等，統(tǒng)一使用0表示不出現(xiàn)，1表示出現(xiàn)。而幾何變量則是某些可以具體測量的特征，如粒徑值、圓度值等。

表2　淀粉粒圓度

圖4　淀粉粒粒徑與圓度的關(guān)系

表3　小麥族植物淀粉粒的形態(tài)指標(biāo)

2.4.2主成分分析

根據(jù)表3中所列的變量逐項對16個樣品淀粉粒進行數(shù)值標(biāo)定，并輸入SPSS 20統(tǒng)計軟件中。按照主成分分析方法對這10個變量進行主成分轉(zhuǎn)換，提取出載荷量最大的兩個主成分：FAC1和FAC2，并以此繪制出散點圖(圖5)。從圖5可以看出，不同淀粉粒形態(tài)指標(biāo)具有不同的表征特性。如主成分1中的粒徑均值(JZ)、標(biāo)準差(BZC)和主成分2中的擠壓面(JYM)、凹坑(AK)、消光臂(XGB)等指標(biāo)相對較高，這說明利用淀粉粒的大小和表面的關(guān)鍵性特征在進行不同種屬淀粉粒的鑒別中具有重要作用。

圖5　主成分散點圖

2.4.3聚類分析與鑒定結(jié)果

將上一節(jié)所確定的變量值輸入SPSS 20軟件中進行聚類分析，聚類的結(jié)果見圖6。

由圖6A可知，16個樣品可以聚為5大類，第一類：鵝觀草(11)；第二類：黑麥(12)；第三類：二棱皮大麥(5)、六棱皮大麥(9)、披堿草(2)和硬粒小麥(16)；第四類：斯卑爾托山羊草(1)、野生大麥(3)和大麥(6)；第五類：二棱裸大麥(4)、新疆大麥(7)、六棱裸大麥(8)、纖毛鵝觀草(10)、春小麥(13)、小麥無芒螞蚱(14)、野生二粒小麥(15)。

圖6　小麥族植物淀粉粒樣品聚類樹形圖(A)和因子得分散點圖(B)

對樣品進行主成分分析，得出樣品的判別方程為(數(shù)據(jù)后的字母為表3中的變量名)：X=0.205CW+0.152AK-0.096LX+0.112DX+0.32JZ+0.273BZC+0.243YD-0.086QD-0.003JYM-0.052XGB；Y=-0.057CW+0.337AK+0.23LX+0DX+0.103JZ+0.073BZC-0.024YD+0.181QD+0.277JYM-0.269XGB。由此得出5大類樣品的分類圖(圖6B)。由圖6B可知，此圖與聚類分析圖結(jié)果一致。

3　討論與結(jié)論

3.1觀察淀粉粒表面特征和形態(tài)的方法

表面形態(tài)是進行淀粉粒鑒定的關(guān)鍵要素，以往相關(guān)小麥族植物淀粉粒鑒定研究大多通過光學(xué)顯微鏡來進行淀粉粒表面形態(tài)觀察。如Piperno等[1]通過光學(xué)顯微鏡下淀粉粒側(cè)面的橫穿裂隙鑒定小麥族植物。光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡在進行淀粉粒的觀察方面各有優(yōu)缺點，光學(xué)顯微鏡可以較直觀的觀察淀粉粒表面的形貌特征，但是放大倍數(shù)有限，一般都是在400倍下進行觀察。如果要進行1 000倍放大觀察，則需要油鏡。而且由于放大倍數(shù)較大，光線不足，照片拍攝效果也較差。S-3400N掃描電子顯微鏡理論上可以進行5～300 000倍的放大觀察，但當(dāng)觀察倍數(shù)超過10 000倍之后，掃描電子顯微鏡發(fā)射出的電子束會在淀粉粒表面灼燒出深坑，對淀粉粒造成破壞。之所以會出現(xiàn)這種狀況，很可能是因為淀粉粒主要是由C、H、O等元素構(gòu)成的有機質(zhì)，在強大的電流下被氧化所致。

本次研究選擇了2 000倍、5 000倍和10 000倍分別對16個樣品淀粉粒進行掃描電子顯微鏡觀察。結(jié)果表明，全部樣品在淀粉粒形態(tài)上可以分為大小兩組，這與韋存虛等[7]對小麥淀粉粒的研究結(jié)果一致。同時可以在掃描電鏡下觀察到淀粉粒表面分布有很多小凹坑，這也與光學(xué)顯微鏡的觀察結(jié)果相同。更高倍數(shù)的電子顯微鏡觀察表明，有粒徑在0.8 μm左右的淀粉粒存在，這是光學(xué)顯微鏡難以觀察到的。因此，綜合利用這兩種方法可以提高淀粉粒形態(tài)研究的精度。

3.2淀粉粒圓度與粒徑的關(guān)系

以往在進行淀粉粒二維形態(tài)的研究時，往往是進行定性的描述，而缺少具體指標(biāo)的定量測量。近年來很多學(xué)者開始利用一些圖像分析軟件進行系統(tǒng)的形態(tài)分析[12]，如美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)開發(fā)的ImageJ軟件。利用這一軟件可以準確、快速的測量淀粉的粒徑、圓度等指標(biāo)。本次研究的結(jié)果表明，淀粉粒粒徑大小與圓度之間存在一定的正相關(guān)，即平均粒徑越大，其圓度也就越高，在形狀上也就越接近正圓。因此，淀粉粒圓度值的精確測量也為淀粉粒鑒定和判別提供了一個新的指標(biāo)。

3.3淀粉粒的判別

未知淀粉粒的判別既需要觀察者根據(jù)相應(yīng)的經(jīng)驗進行初步判斷，更需要借助必要的計量方法進行判斷。以往研究一般是根據(jù)淀粉粒的形狀和粒徑大小判斷未知淀粉粒的來源，但對其具體的種屬判斷尚有一定難度。本研究根據(jù)多變量分析的結(jié)果，提出利用判別方程式的方法，進一步對植物淀粉粒進行區(qū)分。對未知種屬的小麥族淀粉粒，可以先按照表3中所列變量分別進行屬性賦值和測量，隨后代入判別方程式中計算出相應(yīng)的X和Y值。最后將所得的X和Y值繪圖，根據(jù)其與已知淀粉粒的距離進行判別。

3.4影響淀粉粒分類的因素

本研究將16個樣品分成了5類，鵝觀草和黑麥由于在粒徑和表面特征上的獨特性，與其他樣品差異較明顯，各自單獨歸為一類。二棱皮大麥、六棱皮大麥、披堿草和硬粒小麥歸為一類，其主要特征是淀粉粒粒徑大小居中，表面有凹坑、擠壓面，部分表面有裂隙。斯卑爾托山羊草、野生大麥和大麥等歸為一類，其主要特征是粒徑均值和圓度值居中、部分表面有凹坑，但是三者淀粉粒粒徑的標(biāo)準差較大，說明其淀粉粒組合中同時分布有大小兩組淀粉粒，并且粒徑值較為分散。其余7個樣品淀粉粒歸為一類，其特征主要表現(xiàn)在粒徑均值和標(biāo)準差的值居中、圓度較高、表面較為光滑，這也與人類主要食用和種植的普通小麥淀粉粒的形態(tài)特征接近。該類中的春小麥和小麥無芒螞蚱本身就是現(xiàn)在種植的小麥品種，這也從另一個方面說明了聚類分析結(jié)果的有效性。但是大麥和新疆大麥為同一個品種，卻分為兩類，究其原因可能為不同區(qū)域的環(huán)境條件差異導(dǎo)致淀粉粒粒徑等特征存在一定差異造成的。相關(guān)研究表明麥類作物淀粉粒中大小兩組淀粉粒的比例和蛋白質(zhì)等成分的含量會受到土壤含水量、基因型等因素的影響[13-14]，溫度和CO2濃度、環(huán)境因素的差異[15]也有可能對小麥淀粉粒的形成造成一定的影響，本試驗的結(jié)果也在一定程度上驗證了這一觀點。

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Study on Morphological Characteristics of Starch Granules in the Triticeae

WAN Zhiwei1,2, LI Mingqi1, LI Hengying2

(1.Key Laboratory of Land Surface Pattern and Simulation/Institute of Geographical Sciences and Natural Resources Research, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;2.Key Laboratory of Poyang Lake Wetland and Watershed Research Ministry of Education/School of Geography and Environment, Jiangxi Normal University, Nanchang, Jiangxi 330022, China)

In order to study morphological characteristics of starch granules in the Triticeae, sixteen samples were analyzed by light microscopy and electron microscopy. The results show that starch granules of Triticeae are almost single granule with round shape. But there are still a few starch granules show oval shape. For the composition of starch granules, all of the 16 samples contain two groups of starch granules, designated as group A(>10 μm) and group B(<10 μm). There is a certain positive correlation between starch granule size and roundness(R2=0.401 3), which means the larger average starch granle size usually come with the higher roundness. The result of cluster analysis shows that 16 samples can be divided into five categories.Category 1:Roegnesiakamojiohwi; category 2:Secalecereale; category 3:Hordeumvulgare(two-rowed),Horduemvulgare(six-rowed),ElymusdahuricusandTriticumturgidumvar.durum; category 4:Aegilopsspeltoidestauschii,HordeumagriocrithonandHordeumvulgare; category 5:Hordeumdistichon,Hordeumvulgarefrom Xinjiang,Hordeumvulgare(six-rowed hulless),Roegneriaciliasis,Triticumaestivum(spring wheat),Triticumaestivum(without awn) andTriticumturgidumvar.dicoccoides.According to the results of the multivariate analysis, discriminant equation is proposed for the Triticeae starch granules identification, which provides the appropriate standards and methods for the identification of future work. This research will contribute to the starch granule database of modern Triticeae plants in China.

Triticeae; Starch granule; Morphology; Multivariate analysis

2016-03-07

2016-03-21

國家自然科學(xué)基金項目(41201200)

E-mail：wzw3392008@sina.com

李明啟(E-mail：limq@igsnrr.ac.cn)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)08-1020-08

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-08-01

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160801.1120.014.html