張靜，蔡淑嫻，黃建安，3，4，李娟，3，4，鐘妮，陽(yáng)衡，劉仲華，3，4*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100191；

3.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

茶黃素對(duì)BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)羰基化及其聚集化抑制作用研究

張靜1，蔡淑嫻2，黃建安1，3，4，李娟1，3，4，鐘妮1，陽(yáng)衡1，劉仲華1，3，4*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，北京 100191；

3.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了羰-氨交聯(lián)反應(yīng)形成老年色素的體外反應(yīng)模型，通過(guò)ThT熒光、掃描電子顯微鏡、透射電鏡、SDS-PAGE及 NBT染色等檢測(cè)手段，結(jié)果表明，茶黃素不僅可以抑制此模型中由于蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)生的老年色素，還可以抑制此模型中因蛋白質(zhì)聚集化產(chǎn)生的β-sheet結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果揭示了衰老機(jī)制中的蛋白質(zhì)羰基化與導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的蛋白質(zhì)聚集化之間存在一定的相關(guān)性。

茶黃素；羰-氨交聯(lián)；老年色素；蛋白質(zhì)聚集化

茶黃素是紅茶中決定色香味及品質(zhì)的主要功能成分，是由兒茶素和沒(méi)食子酸等酚類(lèi)物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵、氧化后形成的一類(lèi)能溶于乙酸乙酯，具有苯并卓酚酮的化合物總稱。紅茶茶黃素中一般以茶黃素（Theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G），茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）和茶黃素雙沒(méi)食子酸酯（Theaflavin-3，3'-gallate，TF-DG）4種為主體成分，分子結(jié)構(gòu)如圖1。茶黃素化合物的許多生物活性主要來(lái)源于它們含有的較多酚羥基結(jié)構(gòu)的抗氧化活性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，茶黃素具有調(diào)節(jié)血脂［1］、抗氧化、抗腫瘤［2］及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗菌［3］、神經(jīng)保護(hù)［4］等多方面的藥理作用。

蛋白質(zhì)老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)是脂質(zhì)過(guò)氧化和非酶糖基化過(guò)程中產(chǎn)生的一系列具有毒性的不飽和活性羰基化合物與蛋白質(zhì)氨基酸（主要是賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸）的氨基基團(tuán)反應(yīng)，從而產(chǎn)生的羰-氨交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物［5-6］，隨著年齡增長(zhǎng)這種生物體衰老標(biāo)志物——老年色素也隨之積累。越來(lái)越多的研究表明，蛋白質(zhì)羰基化與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森癥及亨廷頓舞蹈癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［7］，此類(lèi)疾病伴隨著蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，同時(shí)產(chǎn)生富含 β折疊結(jié)構(gòu)的不溶性淀粉樣沉積。有研究表明，阿爾茨海默病患者腦內(nèi)蛋白羰基含量大大提高，羰氨交聯(lián)產(chǎn)生的老年色素的量與癡呆嚴(yán)重程度存在相關(guān)性［8］。大多數(shù)研究表明［4，9-11］，以EGCG為主的綠茶多酚類(lèi)化合物以及紅茶提取物能直接結(jié)合到松散無(wú)折疊的淀粉樣蛋白上，并能促進(jìn)其形成無(wú)毒性單體結(jié)構(gòu)而不是形成具有毒性的β折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)這些功能成分也具有清除羰基化合物的作用［12-14］，兒茶素尤其是酯型兒茶素能顯著抑制MDA誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)類(lèi)老年色素物質(zhì)生成，同時(shí)其抑制作用與其結(jié)構(gòu)的親核性有關(guān)［15］，但目前對(duì)堪稱茶中“軟黃金”的茶黃素單體的相關(guān)研究較為少見(jiàn)。因此，基于以上所述研究結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建羰-氨交聯(lián)反應(yīng)形成老年色素的體外模型，分析紅茶功能活性成分中的4種主要茶黃素單體對(duì)此模型中羰-氨交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中羰基化蛋白及毒性 β折疊結(jié)構(gòu)生成的抑制作用。

注：a：茶黃素；b：茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯；c：茶黃素-3'-沒(méi)食子酸酯；d：茶黃素雙沒(méi)食子酸酯。Note：a：TF，b：TF-3-G，c：TF-3'-G，d：TF-DG.圖1 4種茶黃素分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of theaflavins

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茶黃素單體（TF、TF-3-G、TF-3'-G、TF-DG含量>98%，北京工商大學(xué)提供），1，1，3，3-四甲基氧基丙烷（1，1，3，3-tetranethoxypropane，TMP）購(gòu)自和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）及硫磺素-T（Thioflavin T，ThT）均購(gòu)自Sigma公司，丙烯酰胺、N，N-甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過(guò)硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）、甘氨酸、Tris-Base、考馬斯亮藍(lán) R250、甘油、溴酚藍(lán)購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，即用型蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)marker購(gòu)自Takara公司，彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker、Tris-HCl購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，甲醇、冰乙酸、氫氧化鉀等試劑為分析純級(jí)。

1.2主要儀器

SKY-200B搖床、水浴鍋、Christ ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機(jī)、GS-800掃描儀、PowerPac 2000電泳儀（Bio-Rad）、Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能酶標(biāo)儀、JSM-1230掃描電子顯微鏡、Zeiss 900透射電鏡。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BSA/MDA反應(yīng)體系造模條件優(yōu)化

根據(jù)參考文獻(xiàn)［15］制備10 mmol·L-1MDA 及0.1 mol·L-1PBS磷酸緩沖液，將1 mg·mL-1BSA與不同濃度（0、1、2、3、4、5、8 mmol·L-1）的MDA置于PBS中反應(yīng)，將體系在37℃、180 r·min-1搖床中孵育 3 d，取 0、1、2、3 d不同時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，全過(guò)程無(wú)菌操作。

1.3.2藥物處理BSA/MDA反應(yīng)體系

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（control）、模型組（model）、藥物對(duì)照組（用于排除藥物干預(yù)組茶黃素本身對(duì)體系產(chǎn)生的影響）、藥物干預(yù)組，各組BSA最終質(zhì)量濃度1 mg·mL-1，模型組和藥物干預(yù)組MDA終濃度4 mmol·L-1，藥物對(duì)照組及干預(yù)組分別加入 TF、TF-3-G、TF-3'-G、TF-DG 4種茶黃素，各干預(yù)組濃度設(shè)置分別為60、120、180、240、300 μmol·L-1，用 0.1 mol·L-1PBS配制各組反應(yīng)體系總體積為500 μL，體系置于搖床（37℃，180 r·min-1）中孵育48 h。

1.3.3ThT熒光檢測(cè)蛋白寡聚體形成與老年色素?zé)晒庵禉z測(cè)

ThT是一種苯并咪唑鹽，ThT可以與富含β-sheet結(jié)構(gòu)的分子相結(jié)合發(fā)出熒光，發(fā)射光譜呈現(xiàn)紅移的特點(diǎn)，ThT發(fā)出的熒光強(qiáng)度與被測(cè)分子β-sheet結(jié)構(gòu)的含量呈正相關(guān)，因此在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的研究領(lǐng)域 ThT熒光探針是一種較為理想的檢測(cè)淀粉樣蛋白聚集體的方法。

取反應(yīng)樣品溶液用ThT檢測(cè)反應(yīng)體系中β折疊結(jié)構(gòu)，每孔40 μL樣品與160 μL濃度為40 μmol·L-1ThT（ThT溶液用50 mmol·L-1甘氨酸，NaOH調(diào)pH至8.0的緩沖液配制）混合后用 96孔板于激發(fā)波長(zhǎng)為 440 nm（band pass 5 nm），發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm的全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值。取一定量樣品用 PBS稀釋10倍，于酶標(biāo)儀檢測(cè)老年色素?zé)晒庵?，激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm。

1.3.4掃描電鏡

如 1.3.2制備樣品，經(jīng)冷凍干燥后將固體樣品做掃描電鏡檢測(cè)，觀察各組蛋白質(zhì)形態(tài)。

1.3.5透射電鏡

如1.3.2制備樣品，取control組、model組及TF處理組各10 μL，用雙蒸水稀釋的樣品滴于鍍膜銅網(wǎng)上，10 min后用濾紙沿邊緣吸干，滴加2%雙氧鈾負(fù)染色10 min后再次用濾紙吸干，透射電鏡下觀察蛋白質(zhì)形態(tài)并拍照（電壓100 kV）。

1.3.6SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)

根據(jù) 1.3.2選擇藥物濃度為 240 μmol·L-1的反應(yīng)體系制備樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)。聚丙烯酰胺凝膠（厚度0.75 mm）為10%分離膠，5%濃縮膠。電泳緩沖液為甘氨酸緩沖液。將 5×變性上樣緩沖液與樣品溶液按體積比為1︰4混合，于沸水中煮10 min，取5 μL上樣，全程先施加80 V電壓至溴酚藍(lán)顯色劑跑過(guò)濃縮膠，再調(diào)整電壓至120 V，待溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠邊緣停止電泳，取出凝膠置于水中漂洗數(shù)分鐘后固定45 min（固定液：10 mL冰乙酸、40 mL甲醇、50 mL水），水洗2次，每次10 min，考馬斯亮藍(lán)染色4 h，水洗至背景顏色褪去，用掃描儀成像拍照。

1.3.7電轉(zhuǎn)及NBT染色實(shí)驗(yàn)

電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：將 SDS-PAGE電泳后凝膠切去周邊未點(diǎn)樣部分，剪取與之相同大小的硝酸纖維素膜，并于甲醇中浸泡1 min，將電轉(zhuǎn)裝置于電轉(zhuǎn)液中浸泡10 min，按照負(fù)極板-泡沫-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-三層濾紙-泡沫-正極板的順序放置，疊放時(shí)去除氣泡，合緊電極板后倒?jié)M電轉(zhuǎn)液，電壓定為30 V，轉(zhuǎn)移2.5 h后取出。

NBT染色：配制濃度為2 mol·L-1的甘氨酸-KOH緩沖液（pH10），在避光條件下，稱取 NBT溶于 2 mol·L-1甘氨酸緩沖液（KOH 調(diào)pH至10）中制成0.24 mmol·L-1染色液，將已轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜置于染色液中3 h后用雙蒸水清洗數(shù)分鐘，將膜轉(zhuǎn)移至潔凈玻璃片進(jìn)行拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1BSA/MDA反應(yīng)體系模型建立

由圖2可知，BSA與不同濃度MDA產(chǎn)生羰-氨交聯(lián)反應(yīng)體系，生成老年色素及 β-sheet結(jié)構(gòu)的量隨著MDA濃度增大及時(shí)間的延長(zhǎng)均有所升高，兩者增長(zhǎng)趨勢(shì)相近，表明羰-氨交聯(lián)反應(yīng)中老年色素的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)聚集化存在一定相關(guān)性。綜合老年色素?zé)晒庵导?ThT熒光值兩個(gè)指標(biāo)，可選擇較佳造模反應(yīng)體系條件，即選擇4 mmol·L-1MDA與1 mg·mL-1BSA反應(yīng)體系，37℃、180 r·min-1搖床孵育2 d。

2.2茶黃素對(duì)BSA/MDA體系蛋白質(zhì)羰基化的保護(hù)作用

熒光值檢測(cè)結(jié)果（圖3）表明，model組BSA與MDA孵育之后產(chǎn)生的熒光值與control組相比存在極顯著差異（P<0.01）；而加入不同濃度茶黃素干預(yù)能有效抑制熒光值的增加，各加藥組與 model組相比，差異極顯著（P<0.01），且藥物濃度越高，熒光值越小，存在一定的劑量依賴關(guān)系。整體而言，茶黃素 4種單體對(duì)體系產(chǎn)生的老年色素的抑制效果，大致為 TF-DG>TF-3-G>TF-3'-G>TF。由此可見(jiàn)，MDA能絞殺蛋白質(zhì)，生成老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)，但茶黃素能較好地保護(hù)蛋白，抑制 MDA與活性蛋白發(fā)生羰-氨交聯(lián)反應(yīng)并產(chǎn)生老年色素。

圖2　BSA與不同濃度MDA混合不同時(shí)間后老年色素?zé)晒庵担╝）及ThT熒光值（b）結(jié)果Fig.2 Fluorescence value of age pigment and ThT of the reaction with different concentrations of MDA at different time

2.3茶黃素對(duì)BSA/MDA體系蛋白質(zhì)聚集化的保護(hù)作用

從ThT熒光檢測(cè)結(jié)果（圖4）可以看出，model組MDA與BSA反應(yīng)產(chǎn)生β-sheet結(jié)構(gòu)與control組相比，以及各不同濃度藥物干預(yù)組與model組相比，均存在極顯著差異（P<0.01）。表明此體系中MDA與BSA產(chǎn)生羰-氨交聯(lián)反應(yīng)的同時(shí)發(fā)生蛋白質(zhì)聚集化，并產(chǎn)生大量β-sheet結(jié)構(gòu)，此外，茶黃素能在一定程度上抑制MDA與BSA反應(yīng)體系產(chǎn)生β-sheet結(jié)構(gòu)，并存在一定劑量依賴關(guān)系。通過(guò)比較得出，茶黃素對(duì) MDA/BSA體系蛋白質(zhì)聚集化抑制效果極為顯著，尤以TF-DG效果最佳。

注：##表示空白對(duì)照組與模型組之間在P<0.01水平差異顯著，**表示藥物干預(yù)組與模型組之間在P<0.01水平差異顯著。下同。Note：## indicates significantly different at P<0.01 between control and model group.** indicates significantly different at P<0.01 between drug-mediated group and model group.The same below.圖3 不同濃度茶黃素對(duì)BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應(yīng)老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)生成的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentration of theaflavins on generation of age pigment in the reaction of BSA/MDA

圖4　不同濃度茶黃素對(duì)BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應(yīng)中β-sheet生成的抑制作用Fig.4 Inhibition of different concentration of theaflavins on generation of β-sheet in the reaction of BSA/MDA

2.4掃描電鏡及透射電鏡成像

通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡（圖5）對(duì)處理樣品進(jìn)行觀察分析，未經(jīng)處理的control組（圖5-A、5-G）蛋白質(zhì)呈較規(guī)則的圓形顆粒狀，model組（圖5-B、5-H）蛋白質(zhì)呈現(xiàn)纖維狀，經(jīng)茶黃素處理后（圖5-C、5-D、5-E、5-F、5-J），蛋白質(zhì)形態(tài)變得較為松散，且不同程度出現(xiàn)緊密的顆粒球狀蛋白，表明在BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應(yīng)體系產(chǎn)生老年斑過(guò)程中，茶黃素單體成分使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，在一定程度上抑制了蛋白質(zhì)纖維化及淀粉狀蛋白的生成。

注：A-F：掃描電鏡成像圖，G-J：透射電鏡成像圖。A、G：control；B、H：model；C、J：BSA/MDA+TF；D：BSA/MDA+TF-3-G；E：BSA/MDA+TF-3'-G；F：BSA/MDA+TF-DG。Note：A-F：image map of SEM，G-J：image map of TEM.A，G：control.B，H：model.C，J：BSA/MDA+TF.D：BSA/MDA+TF-3-G.E：BSA/MDA+TF-3'-G.F：BSA/MDA+TF-DG.圖5 茶黃素處理BSA/MDA羰-氨交聯(lián)體系的掃描電鏡和透射電鏡成像圖Fig.5 Scanning electron microscopeand transmission electric microscope graphs of samplesin SEM and TEM treated with theaflavins

2.5茶黃素影響B(tài)SA/MDA體系蛋白質(zhì)聚集化SDS-PAGE及NBT染色結(jié)果

由SDS-PAGE電泳圖（圖6）可知，Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組48 h所對(duì)應(yīng)的條帶濃縮膠出現(xiàn)了大分子聚集體（圖 6黑色箭頭所指），這些聚集體是高分子量蛋白質(zhì)，藥物干預(yù)組經(jīng)茶黃素處理 48 h后主條帶向大分子與小分子彌散開(kāi)且高分子量條帶更加明顯。從電轉(zhuǎn)染色情況來(lái)看，茶黃素組主條帶向高分子量部分彌散并堆積，且這些部分均可在纖維素膜上NBT染色，而control組及model組濃縮膠部分并未出現(xiàn)高分子量蛋白或發(fā)生彌散，且NBT并未染色，說(shuō)明茶黃素可直接結(jié)合于未折疊或預(yù)折疊的蛋白質(zhì)上，從而使結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并擁有醌式結(jié)構(gòu)，這種作用使蛋白質(zhì)在聚集化中變?yōu)闊o(wú)定形大分子量纖維態(tài)沉積，而不是富含 β-sheet結(jié)構(gòu)的毒性中間體（圖 6白色箭頭所指）。

注：Ⅰ：Marker；Ⅱ：Control；Ⅲ：Model；Ⅳ：BSA/MDA+TF；Ⅴ：BSA/MDA+TF-3-G；Ⅵ：BSA/MDA+TF-3'-G；Ⅶ：BSA/MDA+TF-DG。Note：Ⅰ：Marker，Ⅱ：Control，Ⅲ：Model，Ⅳ：BSA/MDA+TF，Ⅴ：BSA/MDA+TF-3-G，Ⅵ：BSA/MDA+TF-3'-G，Ⅶ：BSA/MDA+TF-DG.圖6 BSA/MDA反應(yīng)體系經(jīng)茶黃素處理后的SDS-PAGE電泳圖譜（A）和NBT染色圖譜（B）Fig.6 SDS-PAGE（A）and NBT staining（B）analysis of samples in SEM and TEM treated with theaflavins

3　討論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應(yīng)體系體外模型，篩選出最佳MDA反應(yīng)濃度為 4 mmol·L-1，與 BSA于 37℃、180 r·min-1搖床環(huán)境下孵育 2 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)體系的ThT及老年色素產(chǎn)物熒光值隨MDA濃度及孵育時(shí)間的增加而升高，表明羰-氨交聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中 β-sheet結(jié)構(gòu)與老年色素的生成量在一定程度上呈正相關(guān)。

茶黃素 4種主要單體對(duì)羰-氨交聯(lián)反應(yīng)體系進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)設(shè)置藥物對(duì)照組排除茶黃素自氧化以及顏色背景等自身產(chǎn)生的影響，在此前提下所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶葉中這些功能成分對(duì)體系羰基化產(chǎn)物即老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)的產(chǎn)生均具有一定抑制作用，同時(shí)，也能降低 β-sheet結(jié)構(gòu)生成。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出茶黃素抑制效果較為明顯，且茶黃素4種單體中以TF-DG效果最佳。有研究表明，沒(méi)食子?；且种启?氨交聯(lián)反應(yīng)的核心功能基，在氧化還原活性基團(tuán)的協(xié)同作用下能更有效地清除MDA等毒性羰基化合物，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)羰-氨交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行與惡化［15］，同時(shí)，C6-C6結(jié)構(gòu)可能是抑制淀粉樣蛋白聚集化的有效新型多酚類(lèi)的活性官能團(tuán)［16］，茶黃素不僅具有與兒茶素分子相類(lèi)似的酚羥基結(jié)構(gòu)，并且其分子結(jié)構(gòu)中的苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)共軛體系空間更大，具有更多的酚羥基團(tuán)，TF-DG是茶黃素類(lèi)中酚羥基團(tuán)最多的化合物［17］。由此推測(cè)，茶黃素可能因具有這些優(yōu)勢(shì)結(jié)構(gòu)而對(duì)老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)及 β-sheet結(jié)構(gòu)具有顯著抑制作用，且TF-DG效果最佳，具體哪一個(gè)或哪幾個(gè)功能基團(tuán)產(chǎn)生作用需待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

通過(guò)SDS-PAGE電泳和NBT染色結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了茶黃素能直接結(jié)合蛋白生成醌類(lèi)物質(zhì)，減少蛋白質(zhì)纖維化過(guò)程中產(chǎn)生的富含β-sheet結(jié)構(gòu)的毒性寡聚體，促進(jìn)生成毒性較弱的大分子量蛋白，從 SDS-PAGE電泳圖可知茶黃素加藥組在孵育 48 h后條帶彌散程度以及NBT染色程度均較明顯，由此說(shuō)明茶黃素抑制效果十分顯著，且與 ThT熒光檢測(cè)結(jié)果相符。經(jīng)掃描電子顯微鏡以及透射電鏡對(duì)各組進(jìn)行成像觀察，進(jìn)一步說(shuō)明藥物可直接改變蛋白質(zhì)構(gòu)象從而抑制蛋白質(zhì)纖維化及老年斑的形成。

老年性癡呆發(fā)生發(fā)展的早期分子病因與人體衰老過(guò)程的共性生化過(guò)程一脈相承，占據(jù)衰老生化機(jī)理首要位置的“羰基應(yīng)激”［18］也是與增齡相關(guān)的淀粉樣蛋白形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)、共核蛋白富集、神經(jīng)元自噬導(dǎo)致脂褐素堆積的重要生化基礎(chǔ)，但至今對(duì)兩者相關(guān)性分子機(jī)制研究較為少見(jiàn)。在醫(yī)藥領(lǐng)域，許多防治阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病藥物中的功效成分或功能團(tuán)因子大多都是具有阻抑羰基化合物毒性的生化基團(tuán)，本實(shí)驗(yàn)表明了茶黃素不僅能抑制羰基應(yīng)激產(chǎn)生的老年色素，從而具有潛在的減緩衰老作用，同時(shí)也能抑制蛋白質(zhì)聚集化從而可能具有預(yù)防老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病功效，因此暗示了加強(qiáng)對(duì)生物體抗羰基應(yīng)激可以成為一種頗有功效的抗神經(jīng)退行性等老年疾病的早期防治措施。

［1］Chen N，Bezzina R，Hinch E，et al.Green tea，black tea，and epigallocatechin modify body composition，improve glucose tolerance，and differentially alter metabolic gene expression in rats fed a high-fat diet ［J］.Nutrition Research，2009，29（11）：784-793.

［2］Kundu T，Dey S，Roy M，et al.Induction of apoptosis in human leukemia cells by black tea and its polyphenol theaflavin ［J］.Cancer Letters，2005，230（1）：111-121.

［3］Friedman M，Henika P R，Levin C E，et al.Antimicrobial activities of tea catechins and theaflavins and tea extracts against Bacillus cereus ［J］.Journal of Food Protection，2006，69（2）：354-361.

［4］Bastianetto S，Yao Z X，Papadopoulos V，et al.Neuroprotective effects of green and black teas and their catechin gallate esters against β-amyloid-induced toxicity ［J］.European Journal of Neuroscience，2006，23（1）：55-64.

［5］Yin D.Biochemical basis of lipofuscin，ceroid，and age pigment-like fluorophores ［J］.Free Radical Biology and Medicine，1996，21（6）：871-888.

［6］Yin D.Studies on age pigments evolving into a new theory of biological aging ［J］.Gerontology，1995，41（Supp.2）：159-172.

［7］陳剛領(lǐng)，唐寧，薛永亮.蛋白質(zhì)羰基化與疾病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（7）：58-60.

［8］Roth M，Tomlinson B，Blessed G.The relationship between quantitative measures of dementia and of degenerative changes in the cerebral grey matter of elderly subjects ［J］.Proceedings of the Royal Society of Medicine，1967，60（3）：254.

［9］Ahmad N，Gupta S，Mukhtar H.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate differentially modulates nuclear factor kappaB in cancer cells versus normal cells ［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，376（2）：338-346.

［10］Caruana M，Neuner J，Hogen T，et al.Polyphenolic compounds are novel protective agents against lipid membrane damage by α-synuclein aggregates in vitro ［J］.Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Biomembranes，2012，1818（11）：2502-2510.

［11］Katiyar S K，Bergamo B M，Vyalil P K，et al.Green tea polyphenols：DNA photodamage and photoimmunology ［J］.Journal of Photochemistry and Photobiology B，Biology，2001，65（2/3）：109-114.

［12］Cheng K W，Wong C C，Chao J，et al.Inhibition of mutagenic PhIP formation by epigallocatechin gallate via scavenging of phenylacetaldehyde ［J］.Molecular Nutrition & Food Research，2009，53（6）：716-725.

［13］Sang S，Shao X，Bai N，et al.Tea polyphenol（-）-epigallocatechin-3-gallate：a new trapping agent ofreactive dicarbonyl species ［J］.Chemical Research in Toxicology，2007，20（12）：1862-1870.

［14］Zhu Q，Liang C P，Cheng K W，et al.Trapping effects of green and black tea extracts on peroxidation-derived carbonyl substances of seal blubber oil ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009.57（3）：1065-1069.

［15］蔡淑嫻，劉仲華，黃建安，等.兒茶素抑制蛋白質(zhì)類(lèi)老年色素?zé)晒馕镔|(zhì)生成活性的研究［J］.茶葉科學(xué)，2010，30（1）：1-8.

［16］Riviere C，Richard T，Vitrac X，et al.New polyphenols active on β-amyloid aggregation ［J］.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2008，18（2）：828-831.

［17］江和源，袁新躍，王川丕.茶黃素雙沒(méi)食子酸酯的抗癌活性及其作用機(jī)理研究［J］.茶葉科學(xué)，2007，27（1）：33-38.

［18］李國(guó)林，印大中.蛋白質(zhì)羰基化與衰老［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008，28（20）：2070-2073.

Inhibition of Theaflavins on Protein Carbonylation and Aggregation in the System of BSA/MDA Carbonyl-ammonia Cross Linking Reaction in vitro

ZHANG Jing1，CAI Shuxian2，HUANG Jian'an1，3，4，LI Juan1，3，4，ZHONG Ni1，YANG Heng1，LIU Zhonghua1，3，4*

1.Key Laboratory of Ministry of Education for Tea Science，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；
2.Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China；
3.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha 410128，China；
4.Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals，Changsha 410128，China

A model of age pigment generation was builted by carbonyl-ammonia cross linking reaction in vitro，the datas indicate that theaflavins can not only inhibit the generation of age pigment in protein carbonylation，but also supress β-sheet-rich in aggregate protein in this model by thioflavin T-based fluorometric assay，scanning electron microscope，transmission electric microscope，SDS-PAGE and NBT staining，there are postive relationship between protein carbonylation on mechanism of aging and protein aggregation that lead to neurodegenerative disease.

theaflavin，carbonyl-ammonia cross linking reaction，age pigment，protein aggregation

Q946.84+1；Q51

A

1000-369X（2016）04-363-09

2016-02-28

2016-04-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471590）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX2015B245）、國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-23-11B）。

張靜，女，博士，主要從事茶葉功能成分藥理研究。*通訊作者：larkin-liu@163.com