高澤莉，汪宏云，葉　梅，李　莉，周　麗，郭　峰

(四川省攀枝花學院附屬醫(yī)院血液科　617000)

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淋巴細胞亞群及血細胞抗體檢測在再生障礙性貧血中的臨床意義*

高澤莉，汪宏云，葉梅，李莉，周麗，郭峰

(四川省攀枝花學院附屬醫(yī)院血液科617000)

目的探討再生障礙性貧血患者外周血淋巴細胞亞群及血細胞抗體水平的變化及臨床意義。方法采用流式細胞儀檢測25例再生障礙性貧血患者(重型再生障礙性貧血7例，非重型再生障礙性貧血18例)及20例健康志愿者(對照)外周血淋巴細胞亞群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+)及血細胞抗體(抗血小板抗體、抗紅細胞抗體及抗粒細胞抗體)。結果再生障礙性貧血組患者CD4+T淋巴細胞百分比、CD4/CD8比值，CD56+百分比明顯降低(P<0.05)；血細胞抗體(血小板抗體、紅細胞抗體、粒細胞抗體)陽性率明顯高于對照組(P<0.05)。結論再生障礙性貧血患者細胞免疫功能異常，同時血細胞膜上抗體陽性率高，提示體液免疫也存在異常。

再生障礙性貧血；淋巴細胞亞群；血細胞抗體

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一類主要由T淋巴細胞介導造血組織損傷而導致的骨髓造血衰竭綜合征。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，細胞免疫是其主要發(fā)病機制，包括Th/Ts細胞失衡及CD8+T細胞過度活化、Treg細胞的明顯降低等有關。目前，細胞免疫功能T淋巴細胞亞群的研究較多，但對AA患者血細胞抗體的研究卻很少。本研究應用流式細胞儀對25例AA患者的外周血淋巴細胞亞群及血細胞抗體進行了檢測，旨在觀察二者在AA發(fā)病中的變化及臨床意義，以便指導治療及病情觀察。

1　資料與方法

1.1一般資料全部AA病例均為本院住院或門診患者，根據(jù)血常規(guī)和骨髓檢查及骨髓活檢確診，符合張之南《血液病診斷及療效標準》。將研究對象分為兩組，AA組：男13例，女12例；重型AA 患者7例，非重型AA患者18例；年齡4～68歲，中位年齡35歲；(2)健康志愿者(對照組)：男11例，女9例，中位年齡32歲。主要試劑及儀器：流式細胞儀為美國貝克曼五色流式細胞儀，淋巴細胞亞群試劑盒及血細胞抗體試劑盒(Beckman公司,America)。試劑為鼠抗人單克隆抗體，溶血素為全血溶血試劑，為BEKMAN COULT A11895。

1.2方法

1.2.1淋巴細胞亞群檢測方法采集外周靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝后，流式細胞儀檢測淋巴細胞亞群表達，包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD3-CD19+、CD3-CD16+CD56+等。直接免疫熒光法：熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細胞膜上相應的抗原結合，經(jīng)過熒光標記固定、溶血步驟后，在流式細胞儀上進行分析，從而得到淋巴細胞亞群的百分數(shù)，加入Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。

1.2.2血細胞抗體檢測方法采集外周靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝后，直接免疫熒光法。FITC標記的各型單克隆抗體，加到全血樣本中，與粒細胞膜、血小板膜、紅細胞膜上的相應的IgG-Fc片段結合，經(jīng)過洗滌(和固定)等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，報告百分數(shù)。

2　結　　果

2.1AA組與對照組淋巴細胞亞群的比較AA組CD3+平均值(70.00±12.25)%，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，AA組CD4+T淋巴細胞平均值為(32.50±5.61)%，明顯低于對照組(P<0.05);CD8+平均值為(39.70±5.02)%，明顯高于對照組(P<0.05)，CD4/CD8比值，平均值為(0.90±0.26)%，與對照組比明顯降低(P<0.05)，CD56+平均值(7.94±4.51)%,明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2AA組與對照組外周血血細胞抗體的比較血小板抗體PAIGG平均值(2.30±1.94)%，明顯高于對照組(P<0.05)，

表1　　AA組與對照組淋巴細胞亞群的比較±s)

表2　　AA組與對照組血細胞抗體的比較±s)

血小板抗體PAIGA平均值(2.22±2.09)%，明顯高于對照組(P<0.05),血小板抗體PAIGM平均值(8.27±9.93)%，明顯高于對照組。紅細胞抗體IGG(0.40±0.23)%,明顯高于對照組(P<0.05)，紅細胞抗體IGA(1.17±1.76)%,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，紅細胞抗體IGM平均值(2.25±1.60)%，明顯高于對照組(P<0.05)，粒細胞抗體IGG平均值(1.86±1.20)%，，明顯高于對照組(P<0.05),粒細胞抗體IGA平均值(3.38±5.26)%，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),粒細胞抗體IGM平均值(5.16±6.82)%，明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

3　討　　論

傳統(tǒng)學說認為AA是原發(fā)、繼發(fā)干細胞缺陷、造血微環(huán)境異常及免疫異常3種機制導致的骨髓造血功能衰竭。目前，多數(shù)學者認為AA患者的發(fā)病機制為T細胞功能異常、細胞免疫亢進并以骨髓為靶器官的自身免疫性疾病。其T細胞亞群失衡、CD8比例增高、CD4/CD8比例倒置[1-2]。

本研究表明AA患者總T細胞與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但CD4/CD8比值異常，主要見于重型AA，而非重型AA的CD4/CD8多正常。

CD19是B細胞標志之一，本研究表明，AA中B細胞數(shù)量下降有6個，B淋巴細胞的數(shù)量增加的有3個，B細胞數(shù)量變化與血細胞抗體改變不一致，B細胞數(shù)量增加或減少的患者都有血細胞抗體的高表達。提示AA患者可能存在B細胞功能異常，體液免疫在AA發(fā)病機制中的作用尚無定論。目前，已陸續(xù)有文獻提及體液免疫在AA發(fā)病機制中的作用，可能仍有一定的體液免疫參與。但并不是直接參與，也可能不是原發(fā)因素而是繼發(fā)效應所致。也有研究報道是通過表達協(xié)同刺激分子途徑或調(diào)節(jié)性T細胞途徑影響AA患者T淋巴細胞活化[3]。

CD16+56+是NK細胞的特性標志，參與腫瘤、感染、免疫調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)AA患者NK+減少的有6例，均為重型AA，說明AA患者NK細胞免疫功能明顯受損的。較多文獻提及NK細胞在AA患者中數(shù)量是減低的，NK細胞表面同時存在抑制性受體和活化性受體，但抑制性受體居主導地位，表現(xiàn)為NK細胞對自身正常組織細胞不產(chǎn)生殺傷作用，NK細胞的降低減弱了T淋巴細胞的調(diào)節(jié)作用，導致免疫功能失衡。在Fas缺陷的小鼠模型中，NK細胞在體外可以抑制自身反應性B淋巴細胞，而在體內(nèi)將NK細胞清除后則會加重自身免疫性疾病的程度[4-8]，提示NK細胞減少在AA發(fā)病機制中起一定作用。

本研究同時進行了成熟血細胞抗體的測定。紅、粒細胞抗體包括IGG、IGM、IGA，血小板抗體包括PAIGG、PAIGA、PAIGM。成熟血細胞抗體測定目前較少文獻提及。劉惠等[9]研究較多的為免疫相關性血細胞減少(immuno-related hemocytopenia，IRH)，此病為自身抗體損傷和(或)抑制骨髓不成熟造血細胞導致的造血功能低下，骨髓造血細胞自身抗體是由T淋巴細胞調(diào)控失衡導致B淋巴細胞數(shù)量/亞群/功能異常，進而產(chǎn)生的一類抗體。劉惠等[9]對此病的擬診標準：(1)兩系或全血細胞減少，網(wǎng)織紅細胞比例不低，骨髓中紅系比例正?；蚱?，易見紅系造血島及紅細胞吞噬現(xiàn)象；(2)除外其他原發(fā)或繼發(fā)血細胞減少癥如AA、MDS、PNH相鑒別。其確診標準為FCM檢測到骨髓造血細胞膜自身抗體即可確診(治療前確診)，若未檢測到骨髓未成熟造血細胞膜上自身抗體，但對激素、靜脈用丙球蛋白等免疫抑制劑有效仍可確診[8-9]。

作者沒有檢測干祖細胞抗體，而是檢測外周血成熟血細胞抗體。本研究發(fā)現(xiàn)，AA患者血細胞抗體均為陽性5/25(20%)，紅細胞抗體陽性6/25(24%)，粒細胞抗體陽性9/25(36%)，血小板抗體陽性10/25(40%)。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，尤其以IGM型血細胞抗體為主，提示AA患者也存在體液免疫的異常。自身抗體針對骨髓造血細胞膜上何種抗原，這些抗原如何被遞呈并激活TH2細胞，目前文獻不多，還有待進一步研究。付蓉等[10]發(fā)現(xiàn)部分IRH患者自身抗體可作用于骨髓紅系造血細胞膜上的促紅細胞生成素受體(EPOR)，封閉EPOR信號轉導，導致紅系較早階段增殖和分化受抑，EPOR可能為自身抗體作用的靶點之一。血細胞抗體陽性的AA患者如何與IRH鑒別？AA是一種以骨髓造血組織為靶器官，T細胞免疫功能亢進的自身免疫性疾病，為細胞免疫亢進，血常規(guī)網(wǎng)織紅細胞及中性粒細胞百分比明顯降低，淋巴細胞比例升高，骨髓減低或重度減低。而IRH為體液免疫亢進，B淋巴細胞比例超過正常，而且亞群失衡，特別是CD5+B淋巴細胞明顯多于健康者及AA患者，IGg1及IGg3水平增高，血常規(guī)網(wǎng)織紅細胞及中性粒細胞百分比不低，巨核細胞不少，骨髓易見紅系造血島或嗜血現(xiàn)象，對糖皮質(zhì)激素及靜脈用丙球蛋白療效好，起效快[11]。

淋巴細胞亞群聯(lián)合血細胞抗體的測定，不僅可以幫助探討AA的發(fā)病機制，也可以指導臨床用藥，組內(nèi)2例AA患者，血象及骨髓象恢復后，復查淋巴細胞亞群及血細胞抗體仍異常，因在其他醫(yī)院停藥及減量導致病情復發(fā)，當重

新使用環(huán)孢素后患者血常規(guī)又恢復，故作者根據(jù)此2項結果來決定用藥時間和調(diào)整藥物劑量[12]。當AA患者血象和骨髓象即使恢復正常后，若淋巴細胞亞群及血細胞抗體仍為陽性時，建議適當延長用藥時間。

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Clinical significance of detecting lymphocyte subsets and hematocyte antibody in aplastic anemia

GaoZeli，WangHongyun，YeMei，LiLi，ZhouLi,GuoFeng

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua，Sichuan617000，China)

ObjectiveTo investigate of the change of peripheral blood lymphocyte subsets and blood cell antibodies in aplastic anemia and its clinical significance.MethodsThe lymphocyte subsets CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+，CD3-CD19+，CD3-CD16+CD56+from 25 aplastic anemia(including SAA 7 cases，NSAA18 cases)，and hematocyte antibody detection(granulocyte,erythrocyte,platelet cytomembrane) and 20 controls were examined by flow cytometry.ResultsCD4+T lymphocyte percentage,CD4/CD8 ratio,the percentage of CD56+in aplastic anemia patients significantly decreased(P<0.05).Blood cell antibodies (platelet antibody,erythrocyte antibody,granulocyte antibody) were significantly higher than the control group (P<0.05).ConclusionAplastic anemia cellular immune function in patients is abnormal,and antibody positive rate is high,and it prompt that humoral immunity is also abnormal.

anemia aplastic;lymphocyte subsets;hematocyte antibody

高澤莉(1971-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事臨床再生障礙性貧血研究。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.012

R556.5

A

1671-8348(2016)07-0903-02

2015-09-14

2015-11-19)