胡輔華，劉麗林，季　建

(1.天津港口醫(yī)院眼科　300456；2.天津市第五中心醫(yī)院眼科　300456；3.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院　300070)

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絲裂霉素C-殼聚糖緩釋微球抑制青光眼濾過術(shù)區(qū)瘢痕增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

胡輔華1，劉麗林2，季建3

(1.天津港口醫(yī)院眼科300456；2.天津市第五中心醫(yī)院眼科300456；3.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院300070)

目的研究絲裂霉素C-殼聚糖(MMC-CS)緩釋微球?qū)ν们喙庋蹫V過術(shù)區(qū)瘢痕增殖的療效。方法48只(96眼)新西蘭大白兔分為4組，每組24眼，通過雙眼行鞏膜咬切術(shù)建立青光眼濾過術(shù)兔模型。其中24只兔的右眼術(shù)中植入MMC-CS緩釋微球(A組)，其左眼術(shù)中植入CS空白緩釋微球(B組)；另24只兔右眼術(shù)中應(yīng)用含0.20 mg/mL MMC棉片(C組)，其左眼行單純鞏膜咬切術(shù)(D組)。術(shù)后觀察各組眼壓、濾過泡、前房炎性反應(yīng)、并發(fā)癥、角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)等情況；術(shù)后第7、14、21天分批處死各組兔模型并行病理學(xué)檢查。結(jié)果(1)眼壓：A組能維持較長(zhǎng)時(shí)間的低水平眼壓，C組次之，B組與D組維持時(shí)間最短，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(2)濾過泡情況：A組濾過泡存活時(shí)間較其他各組長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(3)并發(fā)癥：各組中均未出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥。(4)角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)：A組術(shù)前與術(shù)后的計(jì)數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(5)病理結(jié)果：A組結(jié)膜上皮完整性較好，結(jié)膜下成纖維細(xì)胞較其他各組少，濾過口周圍區(qū)無明顯炎癥浸潤(rùn)，新生膠原纖維也較少。結(jié)論MMC-CS緩釋微球能安全有效抑制兔青光眼濾過術(shù)區(qū)的成纖維細(xì)胞及新生膠原纖維的增殖，顯著提高青光眼濾過術(shù)的成功率。

絲裂霉素；殼聚糖；青光眼；緩釋微球；抗瘢痕增殖

青光眼(glaucoma)是在全球排第1位的不可逆性致盲性眼病。目前全球青光眼發(fā)病人數(shù)約6 000萬以上[1-2]。濾過性手術(shù)是目前治療青光眼的最有效手段之一。但是，該手術(shù)常由于術(shù)后Tenon′s囊成纖維細(xì)胞的過度增殖使濾過道瘢痕堵塞而導(dǎo)致手術(shù)失敗[3]。有國(guó)外學(xué)者報(bào)道，在其隨訪觀察的700例青光眼濾過手術(shù)患者中,約有30.0%的病例在術(shù)后6～8周因?yàn)V過道瘢痕堵塞而失敗[4]。近年來，臨床上常在術(shù)中應(yīng)用抗瘢痕化藥物來抑制濾過道的瘢痕增殖，其中得到普遍認(rèn)可的藥物是絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)[5]。但由于術(shù)中所用的0.20 mg/mL MMC棉片較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,部分患者術(shù)后可能產(chǎn)生如濾過泡滲漏、角膜上皮和內(nèi)皮損傷、脈絡(luò)膜脫離、低眼壓等嚴(yán)重并發(fā)癥，且術(shù)后效果無法持久[6-7]。因此，降低術(shù)中MMC的用量和延長(zhǎng)其作用時(shí)間具有重要意義。近年來，以殼聚糖(chitosan,CS)作為藥物載體的緩釋給藥系統(tǒng)由于可生物降解和緩釋、抗組織纖維化等諸多優(yōu)點(diǎn)而成為藥物治療研究的熱點(diǎn)之一[8-9]。為此，作者研制了MMC-CS緩釋微球，并觀察了它抑制青光眼濾過術(shù)區(qū)瘢痕增殖的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1MMC-CS緩釋微球及其制作首先將MMC與海藻酸鈉預(yù)先混合，形成0.45 mg/mL SRL與1.50 mg/mL海藻酸鈉的混合液。在室溫電磁力攪拌條件下，將10.0 mL MMC與海藻酸鈉的混合液通過恒流泵以1 mL/min的速度滴加到10.0 mL(0.30 mg/mL)CaCl2溶液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30 min。同法將5.0 mL 0.60 mg/mL的CS溶液(含0.1%乙酸)滴加到上述混合液中，滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h，自發(fā)形成MMC-CS緩釋微球。同法制備不載MMC的空白CS緩釋微球，另制備3 mm×3 mm的濃度為0.20 mg/mL的MMC小棉片。

1.2方法

1.2.1微球載藥率和藥物包封率的測(cè)定取納米微球制備溶液適量稀釋，滴于銅網(wǎng)自然干燥后以透射電鏡觀察微球表面形態(tài)，在掃描電鏡下，隨機(jī)計(jì)數(shù)500個(gè)微球的直徑，獲得粒徑分布特征的相關(guān)信息。將制備的含納米粒子的混合液以3.0×104r/min超高速離心20 min，取出上清液，并用2.0 mL雙蒸水清洗沉淀3次，將洗滌液與上清液混合后測(cè)BSA濃度，以空白納米粒子同法取得的上清液及沉淀液為空白對(duì)照，沉淀冷凍干燥后稱質(zhì)量。包封率(%)=[(SRL投放總量-上清液及洗液中的SRL量)/(SRL投放總量)]×100%，載藥量(%)=[(SRL投放總量-上清液及洗液中的SRL量)/不載MMC的空白CS緩釋微球總量+SRL投放總量]×100%。體外釋藥率試驗(yàn):將納米緩釋微球適量稀釋，吸取緩釋微球溶液5.0 mL，置入100.0 mL 37 ℃恒溫HBS中,加酸性乙醇4.0 mL,旋渦振蕩5 min,低溫離心3 000 r/min,20 min,取上清液1.0 mL,用熒光分光光度儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度,計(jì)算標(biāo)本中藥物含量。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組健康成年新西蘭大白兔48只(96眼)，分為4組，每組24眼。A組：24只兔的右眼鞏膜咬切術(shù)中植入MMC-CS緩釋膜；B組：左眼鞏膜咬切術(shù)中植入CS空白緩釋膜；C組：另24只兔右眼鞏膜咬切術(shù)中應(yīng)用含0.20 mg/mL的MMC棉片；D組：左眼單純鞏膜咬切術(shù)。

1.2.3手術(shù)方法將48只兔采用鹽酸氯胺酮注射液(50 mg/Kg)和鹽酸氯丙嗪注射液(10 mg/Kg)肌內(nèi)注射全身麻醉下手術(shù)。術(shù)眼點(diǎn)0.5%丁卡因滴眼液3次，開瞼器開瞼，于角膜緣的鼻上方做以彎隆部為基底的結(jié)膜瓣，充分暴露角鞏膜緣，在距角膜緣后2.0 mm處做以角膜緣為基底的板層鞏膜瓣4.0 mm×3.0 mm，選擇24只兔右眼術(shù)中應(yīng)用含0.20 mg/mL MMC棉片3 min(C組)，然后用PBS 200.0 mL沖洗干凈，隨后，在鞏膜瓣的下方角鞏膜緣處切除2.0 mm×1.5 mm深層鞏膜組織，切除對(duì)應(yīng)的周邊虹膜，用10-0絲線縫合鞏膜瓣兩腳及結(jié)膜瓣切口。左眼行單純鞏膜咬切術(shù)，步驟同右眼(D組)。另24只兔雙眼先予行單純鞏膜咬切術(shù)，縫合結(jié)膜瓣后在兔右眼結(jié)膜下注入BSS稀釋的MMC-CS緩釋微球0.5 mL(載MMC 2.00 mg,CS-海藻酸鈣28.75 mg,A組)，另一組注入0.5 mL CS空白緩釋微粒(B組)。術(shù)畢予48只兔雙眼結(jié)膜囊內(nèi)涂妥布霉素地塞米松眼膏。術(shù)后每天給予妥布霉素滴眼液滴眼4次，妥布霉素眼藥膏涂眼每晚1次，至術(shù)后第7天。所有手術(shù)均由同一位熟練手術(shù)者施行。

1.2.4檢查項(xiàng)目

1.2.4.1眼壓應(yīng)用TONO-PEN AVIA眼壓計(jì)分別于術(shù)前及術(shù)后第1、2、3、5、7、10、14、21天每組隨機(jī)選取8只眼，測(cè)量眼壓。0.5%丁卡因滴眼液點(diǎn)被測(cè)眼2～3次，擺正兔子的頭位后，使測(cè)量頭尖輕輕垂直觸碰角膜中央?yún)^(qū)，直至顯示出結(jié)果(置信區(qū)間大于或等于95%時(shí))后進(jìn)行記錄。每眼測(cè)量3次，取其平均值。

1.2.4.2裂隙燈分別于術(shù)后第1、2、3、5、7、10、14、21天應(yīng)用裂隙燈顯微鏡觀察各組術(shù)眼結(jié)膜充血、濾過泡的形態(tài)和存活時(shí)間、角膜水腫、前房反應(yīng)及前房出血、晶體混濁等并發(fā)癥情況。

1.2.4.3角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用角膜內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別于術(shù)前與術(shù)后第21天測(cè)量各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量(每組8眼)，并作拍攝與記錄。

1.2.4.4房水中藥物濃度的測(cè)量分別于術(shù)后第3、7、14、28天，以上述麻醉方法全身麻醉MMC-CS緩釋微球組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，在ZEISS手術(shù)顯微鏡下用1.0 mL注射器行前房穿刺取房水0.2 mL，每次4眼，用HPLC-MS檢測(cè)房水中的藥物濃度。

1.2.4.5組織病理學(xué)檢查 分別于術(shù)后第7、14、21天各隨機(jī)選取8只眼。眼球取出后置于4%的多聚甲醛中固定24～28 h(4 ℃)，切取經(jīng)濾過泡區(qū)域眼球最大周徑結(jié)構(gòu)組織，做石蠟包埋后連續(xù)切片，行Masson染色，觀察濾過泡區(qū)結(jié)膜上皮完整性，結(jié)膜下間隙、成纖維細(xì)胞增生，濾過泡區(qū)周圍組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2　結(jié)　　果

2.1MMC-CS緩釋微球形態(tài)及載藥率電鏡下觀察制備的MMC-CS緩釋微球形態(tài)規(guī)則均質(zhì),無粘連,平均粒徑(879.3 ±185.7)nm,包封率81.7%,載藥量20.6%,在14 d內(nèi)累積釋藥率接近80.0%(圖1)。

圖1　　MMC-CS緩釋微球形態(tài)接近球形(TEM×10 000)

2.2眼壓術(shù)后第1天，4組平均眼壓均較術(shù)前明顯下降；術(shù)后第2天，D組和B組快速升高，第5天以后基本達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定水平；術(shù)后第5天，C組開始升高，術(shù)后第10天時(shí)達(dá)術(shù)前水平；術(shù)后第21天，A組平均眼壓仍保持在較低水平，與術(shù)前比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，術(shù)后第10至21天，A組平均眼壓與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

2.3術(shù)后反應(yīng)及并發(fā)癥術(shù)后前2天，各組結(jié)膜充血情況相近；術(shù)后第3天開始，A組與C組結(jié)膜充血逐漸減輕，而B組與D組在術(shù)后第5天后才逐漸減輕。C組角膜水腫在術(shù)后第1天稍較其他各組重，3 d后逐漸退去，其他各組角膜無明顯水腫。各組術(shù)后第1天均出現(xiàn)輕微前房炎性反應(yīng)，術(shù)后3 d左右均漸消失。各組均未見明顯眼內(nèi)炎、濾過泡滲漏、晶體混濁等并發(fā)癥發(fā)生。

2.4濾過泡的形態(tài)術(shù)后第1天，各組濾過泡均呈現(xiàn)高度彌散隆起，充血明顯。術(shù)后第3天，B組和D組基本趨于扁平，充血仍明顯。C組于術(shù)后第7天左右開始縮小、局限化，充血明顯減輕，第10天趨于扁平。A組于術(shù)后第7天左右開始縮小、局限化，但在術(shù)后第14天以后仍保持在一個(gè)平臺(tái)，第21天時(shí)仍表現(xiàn)為局限隆起的濾過泡。見圖3。

圖2　　4組術(shù)后眼壓的比較

圖3　　4組青光眼濾過術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)濾過泡的形態(tài)變化

2.5角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的變化情況各組術(shù)前與術(shù)后第28天角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量對(duì)比無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可見，手術(shù)用藥及緩釋膜制劑對(duì)角膜內(nèi)皮細(xì)胞無明顯毒副作用，見表1。

2.6房水中藥物濃度MMC-CS緩釋微球組術(shù)后第3天、第7 天、第14 天、第28天房水中的SRL的濃度分別為(17.56 ±0.05)、(16.62 ±0.05)、(14.74 ±0.05)、(8.74 ±0.05)ng/mL。由此可見，術(shù)后房水中的有效藥物濃度維持時(shí)間達(dá)2周以上。

2.7組織病理學(xué)觀察術(shù)后各組結(jié)膜上皮完整，A組術(shù)后第7和第14天術(shù)區(qū)的病理改變，均顯示結(jié)膜上皮完整，結(jié)膜下鞏膜濾過區(qū)周圍輕微炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)膜瓣與鞏膜瓣間隙寬，Tenon′s囊中成纖維細(xì)胞與新生膠原纖維稀少疏松。B組與D組術(shù)后第7天術(shù)區(qū)的病理改變，顯示結(jié)膜上皮完整，結(jié)膜下鞏膜濾過區(qū)周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)膜瓣與鞏膜瓣間隙狹窄，Tenon′s囊中成纖維組織致密，見圖4。

表1　　各組角膜內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的比較±s，/mm2)

A:A組(Masson×100);B:B組(Masson×40)；C:C組(Masson×100);D:D組(Masson×100)。

圖4術(shù)后第7天組織病理學(xué)觀察結(jié)果

3　討　　論

青光眼濾過手術(shù)的主要目的是建立新的房水引流途徑，是目前治療青光眼的主要方法，但有部分患者術(shù)后濾過泡難以形成，手術(shù)失敗[10]。其主要原因是手術(shù)區(qū)球結(jié)膜下和鞏膜之間成纖維細(xì)胞過度增生、纖維化、瘢痕形成致濾過道阻塞[1]。MMC是目前青光眼濾過術(shù)抗增殖的最主要藥物,其常規(guī)用藥方式為術(shù)中將浸有藥物的棉片置于鞏膜瓣上或鞏膜瓣下。由于其較為明顯的細(xì)胞毒性作用，加之不同術(shù)者所采用的棉片的形狀和大小不同，浸泡的時(shí)間亦不同，造成藥物濃度差別很大，術(shù)中、術(shù)后可能產(chǎn)生各種并發(fā)癥[11]。此外，由于僅僅在術(shù)中短暫浸泡棉片，術(shù)后效果無法持久。因此，降低術(shù)中MMC的用量和延長(zhǎng)其作用時(shí)間具有重要意義[12]。

MMC是一種抗代謝藥物，是由頭狀鏈霉菌層分離出的一種抗腫瘤抗菌藥物，其可與DNA的雙螺旋形成交聯(lián)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，抑制增殖期DNA的復(fù)制，對(duì)增殖期中的細(xì)胞均有殺傷作用，同時(shí)也作用于靜止期的細(xì)胞，因而可用來阻止手術(shù)區(qū)的血管再生[13]，抑制青光眼濾過性手術(shù)后濾過道的纖維細(xì)胞增生和瘢痕化，保持濾過道通暢，提高手術(shù)成功率，但較高濃度下其毒副作用及并發(fā)癥也較為明顯。因此，降低術(shù)中MMC的用量和延長(zhǎng)其作用時(shí)間具有重要意義[14]。

CS研制和應(yīng)用是近年來醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域中的重大進(jìn)展[15]，其在體內(nèi)無蓄積、無免疫性和抗原性，對(duì)機(jī)體異物排斥反應(yīng)小，對(duì)周圍鄰近組織及全身無明顯刺激作用及毒副作用[16]，具有良好的生物相容性[16]，改變CS緩釋微球中組分的比例，可以調(diào)整其自身降解的時(shí)間和藥物釋放的速度。其表面不斷降解并形成微孔,暴露其內(nèi)部包封的藥物，可作為可控性釋放藥物的植入性載體[1,17-18]。因此，作者研制了MMC-CS緩釋微球，并觀察了它抑制青光眼濾過術(shù)區(qū)瘢痕增殖的效果。緩釋微球的研制不但有效減少了MMC的使用劑量，減少了并發(fā)癥的產(chǎn)生，而且使MMC能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放，在局部達(dá)到一定的有效濃度，作用時(shí)間也明顯延長(zhǎng)，有望顯著提高青光眼濾過手術(shù)的成功率。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，B組(空白CS緩釋微球)術(shù)后植入部位未見明顯炎性反應(yīng)、組織變性壞死及其他不良反應(yīng)，對(duì)角膜內(nèi)皮及視網(wǎng)膜未見明顯損傷表現(xiàn)，表明CS體內(nèi)生物相溶性良好，且無明顯眼內(nèi)毒性作用。A組(MMC-CS緩釋微球)與C組(MMC棉片)術(shù)后效果均較D組好，維持低水平眼壓時(shí)間較D組(單純鞏膜咬切術(shù))長(zhǎng)，術(shù)后術(shù)區(qū)炎癥浸潤(rùn)輕，對(duì)虹膜、睫狀體、角膜內(nèi)皮細(xì)胞等均無毒性作用。但A組與C組相比，更具有明顯的效果，術(shù)后維持低水平眼壓時(shí)間較C組長(zhǎng)，術(shù)后炎性反應(yīng)更輕，濾過泡維持時(shí)間亦較C組長(zhǎng)，術(shù)后房水中藥物濃度檢測(cè)更進(jìn)一步證明藥物穩(wěn)定持續(xù)地釋放(>14 d)，病理結(jié)果進(jìn)一步表明，A組術(shù)后第7、14、21天結(jié)膜下間隙寬，成纖維細(xì)胞與新生膠原纖維稀少疏松，術(shù)區(qū)周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更輕，而其他各組術(shù)后第21天結(jié)膜下已形成了致密的瘢痕組織。根據(jù)青光眼濾過術(shù)后傷口的愈合過程可知，術(shù)后14 d內(nèi)為成纖維細(xì)胞增生最活躍的時(shí)期，而CS載體能使MMC持續(xù)穩(wěn)定釋放長(zhǎng)達(dá)14 d以上，符合要求。C組(MMC棉片)中雖然顯示未見明顯炎性反應(yīng)及毒副作用，組織耐受性可，但其作用時(shí)間短暫，通過以CS為載體，使其給藥時(shí)間大為延長(zhǎng)(>14 d)，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的目的。

研究結(jié)果表明，MMC-CS緩釋微球能安全、有效地抑制濾過性手術(shù)后的炎性反應(yīng)及成纖維細(xì)胞的增生，防止濾過泡瘢痕化，從而能夠延長(zhǎng)其維持低水平眼壓的時(shí)間，且未見毒性反應(yīng)，可以顯著提高兔眼濾過性手術(shù)的成功率。本研究為今后研制、開發(fā)高效低毒的MMC緩釋制劑用于抗濾過泡瘢痕化奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[20]。

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Experimental study on anti-proliferation of mitomycin C-chitosan microspheres sustained release microspheres during glaucoma filtering surgery in rabbit

HuFuhua1,LiuLilin2,JiJian3

(1.DepartmentofOphthalmology,HospitalinTianjinPort,Tianjin300456,China;2.DepartmentofOphthalmology,theFifthCentralHospitalinTianjin,Tianjin300456,China;3.EyeHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

ObjectiveTo study the effect of mitomycin C(MMC)-chitosan (CS)sustained release microspheres on the scarring prevention of the filtering passage during glaucoma filtering surgery.MethodsFiltering surgery model was established on 96 eyes of 48 healthy adult New Zealand white rabbits which were divided into 4 groups,24 eyes in each group.The right eyes implanted MMC-CS microspheres in 24 rabbits(group A),whereas that of the fellow eyes implanted empty CS microspheres(group B),and in other 24 rabbits which right eyes only used 0.20 mg/mL MMC cotton(group C),on the opposite sides with no adjunctive treatment(group D).Intraocular pressure,filtering bleb,anterior chamber flare,complications and the numbers of corneal endothelial cells were observed after surgery.Rabbits were killed on the 7th,14th and 21th day postoperatively in batch and histopathological examination was carried out.Results(1)the intraocular pressure:group A can maintain the low level of intraocular pressure for a long time,followed by group C,group B and group D,and difference between groups was statistically significant (P<0.01).(2) The filtering blebs:the filtering bleb survival time of group A was longer than other group(P<0.01).(3)Complication:there was not any complication in the 4 groups.(4)The number of corneal endothelial cells:the number of corneal endothelial cells of group A preoperative and postoperative had no statistical significance differences(P>0.05).(5)Histopathologic findings:group A had better conjunctival epithelial integrity,subconjunctival fibroblast less than other groups,filtration had no obvious inflammation infiltration around the mouth area,but also had fewer new collagen fibers.ConclusionMMC-CS sustained release microspheres is a safe and effective treatment to inhibit inflammatory cells activity and fibroblast activity in surgery sites,and can significantly improve outcome of filtration surgery.

mitomycin;chitosan;glaucoma；microspheres;anti-proliferation

R779.6

A

1671-8348(2016)07-0883-05

2015-09-08

2015-11-26)