陳海霞,周業(yè)江,王璐璐,李　華,熊玉霞△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川瀘州 646000)

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·論著·

他莫昔芬對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖和絲氨酸蛋白酶抑制劑9表達(dá)的影響*

陳海霞1,周業(yè)江2,王璐璐1,李華1,熊玉霞1△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川瀘州 646000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，四川瀘州 646000)

目的研究他莫昔芬(TAM)對(duì)胃癌細(xì)胞雌激素受體α、β(ERα和ERβ)的表達(dá)情況及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和絲氨酸蛋白酶抑制劑9(PI9)表達(dá)的影響。方法對(duì)前期篩選出的ERα表達(dá)陽(yáng)性胃癌細(xì)胞株MNK45、SGC7901(PI9表達(dá)陽(yáng)性)和ERβ表達(dá)陽(yáng)性胃癌細(xì)胞株BGC823(PI9表達(dá)陰性)，采用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)TAM對(duì)ERα和ERβ表達(dá)的影響，CCK8法檢測(cè)TAM干預(yù)后胃癌細(xì)胞株的增殖情況，逆轉(zhuǎn)錄PCR觀察TAM干預(yù)后PI9表達(dá)的變化。結(jié)果ERα表達(dá)于MNK45和SGC7901細(xì)胞核上，ERβ 表達(dá)于BGC823細(xì)胞核上，經(jīng)TAM干預(yù)后ERα和ERβ表達(dá)均無(wú)明顯改變；TAM在0.1～100.0 μmol/L時(shí)可明顯抑制SGC7901、MNK45的細(xì)胞增殖，與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)BGC823和MNK28的細(xì)胞增殖無(wú)明顯劑量依賴關(guān)系；TAM干預(yù)后SGC7901的PI9 mRNA的相對(duì)灰度值為(0.402±0.020)，MNK45的PI9 mRNA的相對(duì)灰度值為(0.359±0.048)，較陰性對(duì)照組灰度值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TAM對(duì)ERα和PI9陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)于PI9陰性表達(dá)細(xì)胞，并呈較好的劑量依賴性；TAM對(duì)胃癌的生長(zhǎng)抑制作用可能與改善PI9介導(dǎo)的免疫耐受有關(guān)。

胃腫瘤；受體,雌激素；他莫昔芬；絲氨酸蛋白酶抑制劑 9

胃癌是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，占我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第2位，死亡率的第3位，嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。本課題前期研究顯示雌激素(estradiol)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，與其能內(nèi)源性誘導(dǎo)絲氨酸蛋白酶抑制劑9(serine proteinase inhibitor 9，PI9)mRNA的表達(dá)密切相關(guān)，從而造成胃癌的內(nèi)源性免疫逃逸。雌激素受體(ER)抑制劑他莫昔芬(tamoxifen，TAM)，又名三苯氧胺其是否可以通過(guò)抑制PI9的表達(dá)來(lái)發(fā)揮療效？目前還未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察TAM干預(yù)后4株人胃癌細(xì)胞的增殖情況及對(duì)PI9 mRNA表達(dá)的影響，明確雌激素受體抑制劑能否改善PI9介導(dǎo)的免疫耐受，研究結(jié)果將為改善胃癌的免疫治療效果提供新的策略。

1　材料與方法

1.1材料TAM(Adamas Reagent公司)，DMEM high glucoses培養(yǎng)液(HyClone公司)，免疫熒光化學(xué)試劑主要包括：ERβ兔抗人多克隆抗體、ERα鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)Bioworld公司)，山羊抗兔IgG 為羅丹明標(biāo)記、山羊抗小鼠IgG為FITC標(biāo)記(中杉金橋)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)Kit(美國(guó)Bioworld公司)。倒置相差顯微鏡(Olympus CKX31SF)，生物安全柜(BSG-4珠海L型)，96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)，熒光倒置顯微鏡(S70-Germany)，多功能PCR儀(TC-412，英國(guó)TECHNE)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，熒光凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MNK45、SGC7901、MNK28和BGC823購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，于5%CO2濃度、37 ℃條件下用含10% 胎牛血清、1%雙抗貯存液的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.2免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)ERα和ERβ的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105/mL，均勻接種到內(nèi)鋪有蓋玻片的培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)接近單層時(shí)，用PBS漂洗3次，每次5 min，預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，甲醇-20 ℃細(xì)胞通透15 min，10% 胎牛血清封閉30 min。加入鼠抗人ERα(1∶200稀釋濃度)和兔抗人ERβ(1∶50稀釋濃度)各50 μL，陰性對(duì)照用10% 胎牛血清代替一抗。4 ℃孵育過(guò)夜后，加入羊抗小鼠IgG(FITC標(biāo)記)和羊抗兔IgG(羅丹明標(biāo)記)二抗稀釋液，37 ℃避光孵育30 min后洗滌，晾干、封片拍照觀察。以明確的熒光為陽(yáng)性，僅發(fā)淺熒光且與周圍背景區(qū)別不明顯則判為陰性或弱陽(yáng)性(FITC標(biāo)記顯綠色，羅丹明標(biāo)記顯紅色)。

1.2.3CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞MNK45、SGC7901、MNK28和BGC823，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL，接種于96孔板，90 μL/孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TAM給藥組加入10.00 μmol/L的雌激素后，再將不同濃度的TAM溶液(100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μmol/L)加入96孔板，10 μL/孔，設(shè)陰性對(duì)照組加DMEM 10 μL，空白對(duì)照組加無(wú)血清DMEM 100 μL，溶媒對(duì)照組加 1% 甲醇10 μL，每組3復(fù)孔。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加CCK8溶液10.00 μL，4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值(450 nm處)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(OD對(duì)照組-OD給藥組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)PI9基因表達(dá)水平TAM給藥組先在各細(xì)胞中加入雌激素10.00 μmol/L，再加入TAM 10.00 μmol/L 作用24 h后，按照RNAsimple Total RNA Kit說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定核酸純度OD260/280在1.0～2.0。嚴(yán)格根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)人PI9基因序列設(shè)計(jì)PCR引物(表1)，參照RT-PCR Kit說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以PI9的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 mim，總循環(huán)35個(gè)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物取5 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，最后用Bio-Rad凝膠成像采集系統(tǒng)照相并進(jìn)行分析。

2　結(jié)　　果

2.1胃癌細(xì)胞 ERα 和 ERβ 的表達(dá)MNK45的ERα位于細(xì)胞核呈清晰的綠色顆粒，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；SGC7901的ERα為弱陽(yáng)性表達(dá)；而ERβ僅在BGC823細(xì)胞核上顯淡紅色顆粒，為弱陽(yáng)性表達(dá)。經(jīng)10.00 μmol/L濃度的TAM作用后ERα和ERβ表達(dá)未見明顯改變，結(jié)果表明TAM對(duì)雌激素受體的表達(dá)無(wú)影響，見圖1。

表1　　GAPDH和PI9引物序列

A1:MNK45 ERα;B1:SGC7901 ERα;C1:BGC823 ERβ。A2:MNK45 ERα;B2:SGC7901 ERα;C2:BGC823 ERβ。

a:P<0.05,與陰性對(duì)照組比較。

2.2TAM對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的影響檢測(cè)結(jié)果顯示，MNK45和SGC7901在0.10～100.00 μmol/L，隨藥物濃度增高OD值逐漸降低，與陰性對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。TAM作用MNK45、SGC7901胃癌細(xì)胞24 h后，表現(xiàn)出不同程度的細(xì)胞增殖抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，呈劑量依賴性，在濃度達(dá)到100.00 μmol/L時(shí)存活率明顯下降，抑制率分別達(dá)(93.92±3.77)%、(82.17±0.79)%；不同濃度的TAM對(duì)BGC823和MNK28細(xì)胞生長(zhǎng)抑制無(wú)明顯劑量依賴關(guān)系，在100.00 μmol/L時(shí)對(duì)MNK28產(chǎn)生最大抑制效應(yīng)，達(dá)(31.78±7.38)%，見圖2。

2.3TAM對(duì)胃癌細(xì)胞PI9mRNA表達(dá)的影響經(jīng)TAM藥物處理24 h后，MNK45和SGC7901細(xì)胞PI9 mRNA的相對(duì)灰度值分別為(0.359±0.048)、(0.402±0.020)，較對(duì)照組PI9 mRNA的相對(duì)灰度值分別為(0.540±0.065)、(0.545±0.038)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；MNK45、SGC7901細(xì)胞的GAPDH及PI9電泳結(jié)果與預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小一致，分別在450、217 bp處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，見圖3。

圖2　　TAM對(duì)4株胃癌細(xì)胞的濃度抑制率曲線

A:MNK45細(xì)胞PI9 mRNA電泳條帶圖；1:陰性對(duì)照組；2：TAM給藥組。B:SGC7901細(xì)胞PI9 mRNA電泳條帶圖；1:TAM給藥組；2：陰性對(duì)照組。C:PI9 mRNA灰度相對(duì)值柱狀圖。

圖3TAM對(duì)和胃癌細(xì)胞PI9 mRNA表達(dá)的影響

3　討　　論

胃癌癥狀不明顯，早期診斷困難，患者臨床治療多屬晚期，預(yù)后較差，與日韓等國(guó)相比，我國(guó)胃癌還具有發(fā)病率和病死率高等特點(diǎn)[2]。目前多數(shù)研究[3-4]報(bào)道TAM 治療ER陽(yáng)性消化道腫瘤的療效佳，但對(duì)ER陰性腫瘤不明顯，故TAM作為胃癌的臨床輔助化學(xué)治療存在一定爭(zhēng)議[5]，這與胃癌組織中ER的表達(dá)不具普遍性有關(guān)系。Xie等[6]的研究中指出TAM可通過(guò)抑制蛋白激酶C信號(hào)通路，加速腫瘤相關(guān)蛋白的降解過(guò)程，促進(jìn)ER陽(yáng)性胰腺癌細(xì)胞凋亡。白文坤等[7]研究表明，不同濃度的TAM可通過(guò)影響人肝癌HepG2細(xì)胞ER的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖，并具有時(shí)間-濃度依賴。TAM是最常用的非甾體類雌激素拮抗劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制雌激素與ER結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[8-9]，有研究還表明可抑制雌激素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞中PI9的合成[10]，是ER陽(yáng)性原發(fā)性乳腺癌治療的一線藥物[11]。

目前有關(guān)PI9在腫瘤治療的研究已成為熱點(diǎn)，但其表達(dá)生物學(xué)意義及在腫瘤免疫治療方面尚不明了。本課題前期研究結(jié)果提示雌激素與胃癌細(xì)胞上ER結(jié)合可直接誘導(dǎo)PI9 基因轉(zhuǎn)錄，對(duì)顆粒酶B(granzyme B，GrB)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，而介導(dǎo)胃癌的內(nèi)源性免疫逃逸[12-13]。GrB是絲氨酸蛋白酶家族的重要成員，能迅速引起靶細(xì)胞DNA斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PI9在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中占有重要作用，它對(duì)PFP/GrB路徑和Fas/Fas-L路徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有抑制作用[15]。Fas是細(xì)胞膜上腫瘤壞死因子受體，和Fas-L結(jié)合可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故Fas/Fas-L表達(dá)異常對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、免疫逃逸有著很大影響[16]。在腫瘤形成的過(guò)程中，PI9合成增加可能導(dǎo)致Fas 表達(dá)下調(diào)或缺失，腫瘤細(xì)胞從而獲得抵抗 Fas 介導(dǎo)凋亡的免疫性逃逸機(jī)會(huì)。前期研究亦發(fā)現(xiàn)PI9在胃癌中的表達(dá)不是全陽(yáng)性，在癌組織中PI9陽(yáng)性率約為41.0%，在癌細(xì)胞株中為50.0%。因此，本課題以前期研究篩選出的ERα表達(dá)陽(yáng)性胃癌細(xì)胞株MNK45、SGC7901(PI9陽(yáng)性)和ERβ表達(dá)弱陽(yáng)性胃癌細(xì)胞株BGC823(PI9陰性)作為研究對(duì)象，探討TAM作用于胃癌細(xì)胞與PI9表達(dá)的關(guān)系。若能根據(jù)胃癌患者PI9表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果，制訂個(gè)體化的TAM輔助化學(xué)治療方案，可能會(huì)收到更好的療效。

本研究結(jié)果顯示不同濃度的TAM作用MNK45、SGC7901胃癌細(xì)胞24 h后，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，且呈劑量依賴性；TAM可減弱胃癌細(xì)胞MNK45、SGC7901的PI9 基因表達(dá)水平，較陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明TAM具有明顯的PI9抑制效應(yīng)，在一定程度上改善了PI9介導(dǎo)的免疫耐受。這一結(jié)果提示以PI9為靶標(biāo)的免疫治療將成為胃癌治療的新方向，為臨床上治療消化道腫瘤提供了一定的理論基礎(chǔ)，為雌激素受體抑制劑的臨床應(yīng)用提供有力的證據(jù)。

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論著·基礎(chǔ)研究

doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.005

Effects of Tamoxifen on proliferation and expression of serine proteinase inhibitor 9 in human gastric cancer cells*

ChenHaixia1,ZhouYejiang2,WangLulu1,LiHua1,XiongYuxia1△

(1.DepartmentofPharmacology,CollegeofPharmacy,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo observe the expression of estrogen receptors (ERα and ERβ) on gastric cancer cells and evaluate the effect of Tamoxifen(TAM) on the cell proliferation and expression of serine proteinase inhibitor 9(PI9) of gastric cancer cells.MethodsPI9 positive expression(MNK45,SGC7901)and negative expression (BGC823)of gastric cancer cell lines were from preliminary screened,the expression of ERα and ERβ detected by immunofluorescence chemical method,the cell proliferation and expression of PI9 were tested by CCK8 assay and reverse transcription-PCR after intervention of TAM.ResultsERα protein expression was noted in MNK45 and SGC7901,ERβ was noted in BGC823,but the expression of ERα and ERβ were not appear to be obvious after the intervention of TAM.Tamoxifen could obviously inhibited cell proliferation of MNK45 and SGC7901 at concentration of 0.1-100.0 μmol/L,the differences were statistically significant compared with negative control group (P<0.05),but showed no dose-dependent to the proliferation of BGC823 and MNK28.After treating with TAM,the expression of PI9 mRNA of SGC7901(0.402±0.020) and MNK45(0.359±0.048) were obviously lower than that in the negatwe control group(P<0.05).ConclusionTamoxifen could significantly inhibit the proliferation of PI9 positive expression than PI9 negative expression of gastric cancer cell lines,and showed obviously dose-dependent,its role in inhibiting proliferation might closely related to immune tolerance improved by PI9.

gastric neoplasms；receptor,estrogen；Tamoxifen；serine proteinase inhibitor 9

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30672058)；瀘州醫(yī)學(xué)院科研基金資助項(xiàng)目(2009246)。作者簡(jiǎn)介：陳海霞(1982-)，講師，碩士，主要從事抗炎免疫和腫瘤藥理學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:xyx_cell@163.com。

R735.2

A

1671-8348(2016)07-0873-03

2015-09-08

2015-11-26)