張　娟，李明勇，賀　元，白　懷，范　平

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院/西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，成都 610041)

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·論著·

微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)MMPs/TIMPs表達(dá)的影響*

張娟1，李明勇1，賀元1，白懷2，范平2

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院/西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，成都 610041)

目的探討生理性微電場(chǎng)對(duì)體外培養(yǎng)的人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)分子金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)/組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)表達(dá)的影響。方法用150 mV/mm的直流微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)定其遷移情況并觀察形態(tài)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)刺激前后MMP2、MMP9和TIMP1、TIMP2基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果未加電刺激的滋養(yǎng)細(xì)胞，其運(yùn)動(dòng)緩慢，遷移方向隨機(jī)；在含有10%小牛血清的培養(yǎng)基中，150 mV/mm電場(chǎng)刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞向負(fù)極遷移，遷移速度和距離明顯增加(P<0.01)，胞體拉長(zhǎng)，垂直于電場(chǎng)方向排列。電場(chǎng)刺激后，胞內(nèi)MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，MMP9、TIMP1和TIMP2表達(dá)水平無(wú)明顯變化。結(jié)論生理性直流微電場(chǎng)可介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞定向遷移和排列，MMP2表達(dá)水平的上調(diào)可能與微電場(chǎng)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能有關(guān)。

滋養(yǎng)細(xì)胞；金屬基質(zhì)蛋白酶;組織抑制因子;遷移;侵襲；電場(chǎng)

人類(lèi)滋養(yǎng)細(xì)胞是一群特殊的細(xì)胞，源于胚胎期的胚外層。在受精卵種植的7～8 d，胚外層細(xì)胞分化，形成原始滋養(yǎng)細(xì)胞，于受精后2周左右該群細(xì)胞形成絨毛的初始結(jié)構(gòu)。此后，滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)一步分化為無(wú)侵襲能力的絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞(villous trophoblasts,VTs)和有侵襲能力的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblasts，EVTs) 兩部分。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的破壞會(huì)引起胎盤(pán)功能障礙，導(dǎo)致多種產(chǎn)科疾病如流產(chǎn)、子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等。

滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)主要由以下過(guò)程組成：蛋白酶水解、周?chē)|(zhì)降解、組織重建等，這個(gè)過(guò)程具有嚴(yán)格的時(shí)間和空間調(diào)控特性[1]。金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) 是胚胎植入過(guò)程中降解細(xì)胞外基質(zhì)主要的蛋白酶，MMPs按其作用底物的不同分為4類(lèi)：膠原酶、明膠酶(MMP2、MMP9)、基質(zhì)分解素和膜型MMPs。其中，MMP2是所有MMPs中分布最廣的成員，由多種細(xì)胞以無(wú)活性的酶原形式分泌，可被蛋白酶和有機(jī)汞制劑等激活，也可被同時(shí)活化的MMPs活化[2]。MMP9的分子量在MMPs家族中最大，由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。MMP2和 MMP9的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原和明膠，是迄今報(bào)道最多的兩種與滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能相關(guān)的MMPs。

MMPs是胚胎植入過(guò)程中降解細(xì)胞外基質(zhì)主要的蛋白酶，該酶的生物學(xué)活性受到其組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的抑制[2-3]。目前，控制絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)的分子機(jī)制目前還不清楚，迄今報(bào)道較多的主要是化學(xué)因子的作用，如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白以及多種轉(zhuǎn)錄因子等。這些因子可通過(guò)調(diào)控MMPs/TIMPs表達(dá)而促進(jìn)妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能，但微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響是否與MMPs/TIMPs的表達(dá)有關(guān)仍不清楚。

生物電現(xiàn)象是生命活動(dòng)的基本屬性，在機(jī)體的一切生命活動(dòng)中都伴隨著生物電的產(chǎn)生[4]。作者前期的研究工作發(fā)現(xiàn)[5-6]，微電場(chǎng)中培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞能產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng)的應(yīng)答反應(yīng)，提示微電場(chǎng)可能作為一種重要信號(hào)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移等功能。因此，推測(cè)微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響可能通過(guò)對(duì)遷移/侵襲相關(guān)的重要蛋白酶MMPs及其抑制分子TIMPs的表達(dá)的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)MMPs/TIMPs表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo由四川大學(xué)華西第二醫(yī)院彭冰教授惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO)，加入青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100μg /mL)，臨用前加入終濃度為10%的胎牛血清(GIBCO)。MMP2抗體、MMP9(G657) 抗體、TIMP2 (H-140)抗體、TIMP1 (N1C3) 抗體均購(gòu)自Cell Signaling公司， Paxillin (N-term) 抗體、Paxillin Phospho (pY118) 抗體購(gòu)自博士德公司。FITC-Phalloidin和DAPI均購(gòu)自Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)及加電滋養(yǎng)細(xì)胞以RPMI-1640在5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有20%的小牛血清、0.04 mmol/L的谷氨酰胺、青霉素104 U/L、鏈霉素100 mg/L。每次實(shí)驗(yàn)前24 h將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后以5×103個(gè)細(xì)胞/cm的密度接種于預(yù)制的細(xì)胞培養(yǎng)槽中，該培養(yǎng)槽由2片24 mm×22 mm、平行放置、相距10 mm的蓋玻片通過(guò)硅酮膠(Dow Corning)固定于100 mm×20 mm的組織培養(yǎng)皿的底面而形成一個(gè)兩端開(kāi)放的細(xì)胞培養(yǎng)小室。對(duì)培養(yǎng)小室內(nèi)細(xì)胞電場(chǎng)刺激后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解，提取蛋白，常規(guī)Western blot方法檢測(cè)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的活化水平。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR總RNA的提取加電完成后取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄培養(yǎng)基，冷PBS清洗，加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打，將裂解液轉(zhuǎn)入DEPC處理過(guò)的Eppendorf管，室溫靜置10 min；加入氯仿(200 mL/1 mL Trizol)，劇烈震蕩15 s，室溫靜置5 min；4 ℃離心，12 000 g×15 min，小心移取上層水相(0.45 mL)至另一1.5 mL Eppendorf管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，4 ℃離心，12 000 g×10 min，棄上清，加入DEPC水配制的75%乙醇1 mL洗滌沉淀，4 ℃離心，12 000 g×10 min，棄上清，離心后的沉淀置于室溫干燥5 min，加入30 μL DEPC水，必要時(shí)55 ℃孵育10 min以利于RNA沉淀的溶解，核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA含量與純度。測(cè)得A260/280在1.8～2.0，含量大于 0.4 g/L，電泳28 S/18 S≥2，示RNA樣本達(dá)到要求。再根據(jù)Fermentas實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說(shuō)明操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增MMP2、TIMP2、MMP9、TIMP1、GAPDH的引物,見(jiàn)表1。

1.2.3Western blotWestern blot檢測(cè)采用常規(guī)方法，收集細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度，確定上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。分別與MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、p-FAK、FAK、p-Paxillin、Paxillin、GAPDH蛋白抗體及二抗反應(yīng)后化學(xué)發(fā)光顯色，陽(yáng)性條帶以凝膠吸光度分析軟件測(cè)定積分吸光度值為其蛋白量。

表1　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2　結(jié)　　果

2.1微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移行為的影響研究結(jié)果顯示，在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在150 mV/mm的直流電場(chǎng)刺激下，滋養(yǎng)細(xì)胞向負(fù)極定向遷移，電刺激10 h后，滋養(yǎng)細(xì)胞胞體拉伸，胞內(nèi)骨架蛋白F-actin垂直于電場(chǎng)方向排列如圖1(10 h) 所示，未加電場(chǎng)刺激的細(xì)胞未發(fā)生上述反應(yīng)，如圖1(0 h) 所示。滋養(yǎng)細(xì)胞在電場(chǎng)作用下向負(fù)極定向遷移，且遷移距離和遷移速度明顯高于未加電場(chǎng)刺激的對(duì)照組[5](P=0.021)。

A：0 h;B:10 h。

圖1滋養(yǎng)細(xì)胞在電場(chǎng)中向負(fù)極定向遷移，垂直于電場(chǎng)方向排列

2.2微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞MMPs/TIMPs表達(dá)的影響

2.2.1微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP2/TIMP2表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，150 mV/mm微電場(chǎng)刺激5、10 h，與未加電場(chǎng)刺激的細(xì)胞(0 h)相比較，MMP2 mRNA表達(dá)水平逐漸增加，分別為0 h的1.16倍和1.35倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)，見(jiàn)圖2A；MMP2 蛋白表達(dá)水平逐漸增加，分別為0 h的1.46倍和1.77倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039;P=0.026)，見(jiàn)圖2B。TIMP2是MMP2的生理性抑制劑。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，150 mV/mm微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞5、10 h，與未加電場(chǎng)刺激的細(xì)胞(0 h)相比較，TIMP2 mRNA表達(dá)水平降低，分別為0 h的0.81倍和0.85倍，見(jiàn)圖3A；TIMP2 蛋白表達(dá)水平變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3B。

2.2.2微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP9/TIMP1表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，150 mV/mm微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞5、10 h，與未加電場(chǎng)刺激的細(xì)胞(0 h)相比較，MMP9 mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖4A；MMP9 蛋白表達(dá)水平也無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖4B。TIMP1是MMP9的生理性抑制劑。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，150 mV/mm微電場(chǎng)刺激5、10 h，與未加電場(chǎng)刺激的細(xì)胞(0 h)相比較，TIMP1 mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖5A；TIMP1蛋白表達(dá)水平降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5B。

圖2　微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP2基因和 蛋白的表達(dá)的影響

圖3　微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞TIMP2基因 和蛋白表達(dá)的影響

圖4　微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP9基因和 蛋白表達(dá)的影響

圖5　微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞TIMP1基因和 蛋白表達(dá)的影響

2.3微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)遷移相關(guān)FAK分子及下游Paxillin磷酸化的影響

2.3.1微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞FAK磷酸化活性的影響[6]在150 mV/mm微電場(chǎng)作用下，F(xiàn)AK Tyr397位點(diǎn)于5 min內(nèi)就已開(kāi)始出現(xiàn)明顯磷酸化水平，10 min繼續(xù)加強(qiáng)(P=0.030)，30 min達(dá)到較高磷酸化水平(P=0.020)，60 min仍維持在較高水平(P=0.001)?？偟腇AK水平無(wú)明顯改變，結(jié)果見(jiàn)圖6。對(duì)FAK Tyr576/577位點(diǎn)磷酸化水平影響不如FAK Tyr397位點(diǎn)明顯(結(jié)果未顯示)。

圖6　　微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞FAK Tyr397位點(diǎn)磷酸化

2.3.2微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞Paxillin磷酸化的影響在相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路中，Paxillin位于FAK分子的下游，受FAK活化信號(hào)的激活。Western blot結(jié)果顯示，Paxillin在150 mV/mm微電場(chǎng)刺激細(xì)胞5 min和10 min出現(xiàn)磷酸化，30 min后磷酸化水平進(jìn)一步升高(P=0.03)，60 min達(dá)較高水平(P=0.02)，Paxillin總蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7　　微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞Paxillin 磷酸化

3　討　　論

生理狀態(tài)下，妊娠胚胎植入早期，EVTs侵入蛻膜組織和子宮螺旋動(dòng)脈，并使后者發(fā)生改建變成低阻、高容量血管，維持足夠的母體血液流入絨毛間支持胎盤(pán)的功能。EVTs適度地侵入子宮內(nèi)膜是維持妊娠和胎兒發(fā)育的前提條件。EVTs侵入不足所致的胎盤(pán)缺血缺氧，可導(dǎo)致異常產(chǎn)科結(jié)局如流產(chǎn)、子癇前期和胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限等的發(fā)生。研究顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞適度侵入與MMPs/TIMPs的表達(dá)以及妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病 (gestational trophoblastic disease，GTD)密切相關(guān)[7]。

滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜由黏附、定植、降解細(xì)胞外基質(zhì)等環(huán)節(jié)構(gòu)成。其中蛋白酶的降解是滋養(yǎng)細(xì)胞侵入的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。MMPs是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶類(lèi)。其中MMP2和MMP9是其最重要成員，它們通過(guò)降解細(xì)胞基底膜Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、層粘連蛋白(laminin,LN)、彈性蛋白(elastin,EN)、蛋白聚糖(proteoglycans)和明膠(gelatin)等，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能。研究報(bào)道顯示，一系列的化學(xué)因子可以調(diào)控MMPs的表達(dá)，并且能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的重要功能[8-13]，如白血病抑制因子(LIF)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、白介素1和6(IL-1和IL-6)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子以及滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的人絨毛膜促性腺激素和leptin等，均能顯著影響MMP2和MMP9的分泌和(或)活性。這些細(xì)胞因子主要是通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化水平的作用而對(duì)細(xì)胞的行為產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，微電場(chǎng)可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的定向遷移和垂直于電場(chǎng)方向排列，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP2 mRNA和蛋白的表達(dá)，表明微電場(chǎng)可通過(guò)作用于滋養(yǎng)細(xì)胞使其活性增加，從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)，改善由于浸潤(rùn)不足導(dǎo)致的各種產(chǎn)科疾病。本研究結(jié)果提示，微電場(chǎng)可能是調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞MMP2表達(dá)的又一重要因素，為改善由于浸潤(rùn)不足所致的妊娠相關(guān)疾病提供了又一重要的理論依據(jù)和實(shí)踐方法。

生理情況下，滋養(yǎng)細(xì)胞MMPs的表達(dá)依賴于其抑制因子TIMPs的調(diào)控。組織抑制因子是一類(lèi)具有多種生理功能的多肽，能以非共價(jià)鍵的形式與MMPs結(jié)合，從而對(duì)MMPs的活性產(chǎn)生特異性抑制。TIMPs在減慢細(xì)胞外基質(zhì)降解、維持細(xì)胞外基質(zhì)成分的更新與自穩(wěn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中，TIMP1(28.5×103)廣泛存在于組織和體液中，能被多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，是MMP9的特異抑制因子[2-3]；TIMP2(21.0×103)常隨MMP2的表達(dá)而表達(dá)，受細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用較小，是MMP2的特異抑制因子[2-3]。本研究未發(fā)現(xiàn)微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞TIMP 2的表達(dá)有明顯的影響，提示微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能相關(guān)蛋白酶的作用主要與上調(diào)MMP2表達(dá)有關(guān)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)150 mV/mm直流微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP9及其抑制因子TIMP1的表達(dá)水平有明顯影響。這可能是因?yàn)镸MP2是胚胎植入較早期滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的蛋白酶，妊娠11周以后，MMP2的表達(dá)水平才開(kāi)始降低[2-3]，而MMP9在胚胎植入較晚期胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)才增加。微電場(chǎng)顯著影響滋養(yǎng)細(xì)胞MMP2的表達(dá)水平，提示微電場(chǎng)可能對(duì)胚胎植入早期滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲起到重要的影響作用，為胚胎植入早期應(yīng)用微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞功能，防治胎盤(pán)缺血缺氧性疾病的發(fā)生奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

滋養(yǎng)細(xì)胞接受胞外信號(hào)的刺激發(fā)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)，具有復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞機(jī)制。迄今從化學(xué)分子如細(xì)胞外基質(zhì)分子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和激素等作用于滋養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)其遷移作用的研究結(jié)果表明，有多條信號(hào)通路參與滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移功能的調(diào)控，包括FAK、MAPK、PI3K/AKT和STAT3等信號(hào)通路的活化[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞能使胞內(nèi)FAK及其下游Paxillin分子發(fā)生磷酸化而激活胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路[6，15]，提示微電場(chǎng)刺激可能是通過(guò)活化與細(xì)胞遷移/侵襲功能相關(guān)的蛋白激酶FAK及其下游Paxillin分子從而上調(diào)MMP2的表達(dá)水平，活化胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能。關(guān)于其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。

本研究獲得的成果對(duì)微電場(chǎng)作為一種可能的生理性信號(hào)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的功能及其機(jī)制的探索以及將微電場(chǎng)用于促進(jìn)胎盤(pán)功能，防治胎盤(pán)缺血缺氧性疾病的發(fā)生奠定了理論基礎(chǔ)，具有實(shí)際意義和應(yīng)用前景。

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Effect of small direct-current electrical stimulation on migration and invasion related MMPs/TIMPs expression of trophoblast cells*

ZhangJuan1,LiMingyong1,HeYuan1,BaiHuai2,FanPing2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanAcademyofMedicalScience/SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China;2.WestChinaSecondHospitalofSichuanUniversity/WesternWomen′sandChildren′sMedicalResearchInstitute,Chengdu,Sichuan610041,China)

ObjectiveTo investigate the effect of small direct-current electrical stimulation on migration and invasion related MMPs/TIMPs expression of trophoblast cells.MethodsThe trophoblast cells were exposed to the direct current electrical field at 150 mV/mm for 5 and 10 hours.Cell images were recorded with continuous photographing and analyzed by image analyzer.The expression levels of MMP2,MMP9,TIMP1 and TIMP2 were measured using quantitative RT-PCR and Western blot.ResultsIn non-electrical field culture trophoblast cells migrated slowly with random directions.Trophoblast cells cultured in media containing 10% calf serum with the application of 150 mV/mm direct current electrical stimulation,showed marked cathodal migration (P<0.01),the cell body stretched,perpendicular to the direction of the electric field.Compared with the non-electrical field stimulation controls,trophoblasts under the electrical field stimulation had the increased MMP2 mRNA and protein expression (P<0.05)，while MMP9,TIMP1 and TIMP2 had no obvious changes of mRNA or protein expressions.ConclusionPhysiological direct-current electrical fields might induce directed migration and perpendicular orientation of trophoblast cells.The enhanced MMP2 expression may play an important role in the migration and invasive activity of trophoblast cells in small electrical field.

trophoblasts cells;matrix metalloproteinases;tissue inhibitor of metalloproteinase;migration;invasion;electrical field

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30872774/H0418)；四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)基金資助項(xiàng)目(140071)。作者簡(jiǎn)介：張娟(1982-)，主管技師，博士，主要從事妊娠相關(guān)疾病機(jī)制研究及臨床血液和生化檢驗(yàn)工作。

R714.21

A

1671-8348(2016)07-0869-04

2015-09-08

2015-11-28)