徐　維，曾振靈，權(quán)　丹，周雨卉，王　佩，王嘉鵬，韓可可，陳　紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，廣東廣州 510642)

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磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶在肉雞體內(nèi)的殘留消除

徐維，曾振靈，權(quán)丹，周雨卉，王佩，王嘉鵬，韓可可，陳紅*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室，廣東廣州 510642)

采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究磺胺對甲氧嘧啶(SMD)和二甲氧芐啶(DVD)預(yù)混劑在白羽肉雞體內(nèi)各組織中的殘留消除規(guī)律。對48只健康白羽肉雞連續(xù)飼喂添加1 000 mg/kg磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑(含SMD 200 mg，DVD 40 mg)的全價飼料10 d，在停藥后4 h，1、3、6、9、12、15 d分別宰殺6只雞，采集各組織進(jìn)行藥物殘留測定。通過空白樣品添加回收試驗，所有基質(zhì)中SMD和DVD的定量限分別為10 μg/kg和5 μg/kg，SMD和DVD分別在50、100、200 μg/kg和25、50、100 μg/kg 3個添加水平下的平均回收率為71.7%～102.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～11.9%。結(jié)果表明，磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑在腎臟中殘留量最高，肝臟其次；肌肉和皮脂中的殘留量顯著低于肝臟和腎臟，停藥9 d時，殘留量低于藥物殘留限量。綜合各組織中總殘留量和最高殘留限量規(guī)定，建議磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑在雞的休藥期為7 d。

磺胺對甲氧嘧啶二甲氧芐啶預(yù)混劑；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；白羽肉雞；殘留；消除

磺胺類藥物常用于畜禽疾病的治療和預(yù)防,其中磺胺對甲氧嘧啶(sulfametoxydiazine，SMD) 用于控制畜禽細(xì)菌性疾病和雞球蟲病[1]，但它有一定的毒性，對人類的健康具有潛在的危害性，因此該化合物在肉類等食品中殘留問題受到關(guān)注[2-4]。敵菌凈(diaveridine，DVD)屬于二氨基嘧啶類藥物，為動物專用抗菌增效劑，主要與磺胺類藥物等抗菌藥物組成復(fù)方制劑，使抗菌譜擴(kuò)大、抗菌活性增強(qiáng)，從抑菌作用變?yōu)闅⒕饔?，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛[5]。DVD以1∶5比例與SMD合用制成預(yù)混劑，主要用于防治畜禽胃腸道細(xì)菌性感染及球蟲病。目前，該預(yù)混劑在白羽肉雞可食組織內(nèi)藥物殘留消除規(guī)律研究尚未見報道。為了保證白羽肉雞的食用安全，維護(hù)消費者利益，通過研究磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑在白羽肉雞組織內(nèi)的殘留消除規(guī)律，對指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器液相質(zhì)譜儀，Agilent6430型串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜，美國Agilent公司產(chǎn)品；配備Agilent1200液相色譜儀、可調(diào)微量移液器，法國Gilson公司產(chǎn)品；超純水器，美國Milli2Q公司產(chǎn)品；臺式高速離心機(jī)、Centrifuge5804，Eppendorf公司產(chǎn)品；FJ-200漩渦混懸器，上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。

1.1.2藥品與主要試劑乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，Merck公司產(chǎn)品；正己烷(分析純)，國產(chǎn)；磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑(規(guī)格：100 g：含磺胺對甲氧嘧啶20 g與二甲氧芐啶4 g)，河北地邦動物保健科技有限公司產(chǎn)品；磺胺對甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品(含量99.0%)，購于Dr．Ehrenstorfer GmbH；磺胺對甲氧嘧啶貯備液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取10.10 mg磺胺對甲氧嘧啶對照品于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃條件下貯存，根據(jù)需要再用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液；二甲氧芐啶(含量100%)，購于中國藥品生物制品檢定所；二甲氧芐啶貯備液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取10.00 mg二甲氧芐啶對照品于10 mL棕色容量瓶中，少量0.1 mol/L鹽酸溶解后用乙腈定容，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20℃條件下貯存，根據(jù)需要再用乙腈稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.1.3試驗用動物與分組供試雞為白羽肉雞，購自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城正大肉雞發(fā)展中心，35日齡，體重在2.0 kg～2.5 kg之間，公母各半，籠養(yǎng)，自由飲水，采食飼料不含抗菌藥物。供試雞50只，試驗前臨床觀察1周，健康者進(jìn)入動物試驗，編號并隨機(jī)分為8組，其中1組為空白對照組。

1.2方法

1.2.1給藥與采樣按最高劑量給藥：連續(xù)飼喂添加1 000 mg/kg磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑(即每kg飼料添加SMD 200 mg和DVD 40 mg)的全價飼料10 d，然后改喂不含藥物的飼料?？瞻捉M飼喂不含該預(yù)混劑的全價飼料。停藥后的4 h(零休藥期)、1 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d，分別宰殺1組雞，每只雞分別取皮脂、肌肉、肝臟和腎臟等組織。樣品采集后，將組織勻漿，置-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2樣品處理將試驗雞肝臟、皮脂、腎臟和肌肉用剪刀剪碎，于15 000 r/min下勻漿3 min，準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品(雞肉、皮脂、肝、腎)于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，渦旋1 min，超聲10 min，于水平振蕩器300 mot/min振蕩20 min，8 000 r/min離心10 min，將乙腈層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。再用4 mL乙腈重復(fù)提取殘渣一次，合并提取液，用乙腈定容至10 mL。準(zhǔn)確移取1 mL提取液加1 mL乙腈飽和正己烷除脂兩次后，于35℃水浴中氮吹濃縮至干后，用1 mL的1 mL/L甲酸水與乙腈(95∶5)混合溶液溶解殘渣，渦旋混勻，15 000 r/min離心10 min，樣品過0.22 μm濾膜后移入棕色進(jìn)樣瓶中，供HPLC-MS/MS分析。

1.2.3檢測條件

1.2.3.1液相條件色譜柱：C18柱(150 mm×2 mm，5 μm，Phenomenex)；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：溶液A：1 mL/L甲酸水；溶液B：乙腈。采用梯度洗脫程序：0 min～1 min,95.0% A；1 min～5 min,95.0% A～5.0% A；5 min～6 min,95.0% A；6 min～8 min,5.0 A～95.0% A；8 min～16 min,95.0% A。

1.2.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描(Positive)；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣：N2；干燥氣溫度：350℃；正模式毛細(xì)管電壓：3 500 V。1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法制得各個組織相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取1.00 g空白組織于50 mL離心管中，按照1.2.2所示方法處理樣品，用各組織的空白提取液分別稀釋SMD、DVD的儲備液，分別使SMD的線性范圍為1 ng/mL～200 ng/mL、DVD的線性范圍為0.5 ng/mL～100 ng/mL，并按1.2.3液質(zhì)條件進(jìn)行測定。將測得的SMD和DVD的色譜峰面積(y)與相對應(yīng)的藥物濃度(x)作直線回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。1.2.5定量限(LOQ)和檢測限(LOD)準(zhǔn)確稱取空白組織1.0 g，依次加入100 μL SMD和DVD不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻，使得樣品中SMD和DVD的濃度分別為2、3、4、5、10 μg/kg，每個濃度做5個平行，按照1.2.2方法處理樣品，按1.2.3液質(zhì)條件進(jìn)行分析檢測。以信噪比(S/N)≥3確定方法檢測限，以(S/N)≥10確定方法定量限。

1.2.6回收率及變異系數(shù)空白組織制成勻漿后，將一定量的SMD和DVD的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到1.00 g 組織中，制得1/2MRL、MRL、2MRL 3個添加水平樣品，渦旋混勻，靜置30 min，按組織樣品提取凈化方法處理并進(jìn)行HPLC-MS/MS測定。1 d內(nèi)每個濃度設(shè)置5個平行樣品，計算回收率和日內(nèi)變異系數(shù)。

1.2.7各組織中磺胺對甲氧嘧啶與二甲氧芐啶的濃度測定各時間點所采雞組織按 “1.2.2” 方法處理，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析處理，求得磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的峰面積，按各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶濃度，進(jìn)而得到各時間點雞各組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的殘留含量。

2　結(jié)果

2.1色譜行為

在此色譜條件下，目標(biāo)組分得到了很好的分離，峰形尖銳、對稱，藥物峰附近未發(fā)現(xiàn)干擾峰，檢測結(jié)果定性準(zhǔn)確性高。DVD及SMD的保留時間分別在7.6 min及8.2 min左右。所得雞空白組織、空白組織添加、實測樣品色譜圖見圖1～圖12。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

SMD在1 ng/mL～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，其線性方程為：y=116.6x+134.2,R2=0.999 6。DVD在0.5 ng/mL～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，其線性方程為：y=868.7x+1234.1,R2=0.998 6,若分析樣品時，濃度超出此范圍，則稀釋樣品即可。

2.3定量限和檢測限

根據(jù)5個空白添加樣品的基線噪音值求其平均值，按信噪比(S/N)≥3為檢測限，(S/N)≥10為定量限，求得各組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶的LOD為2 μg/kg，LOQ分別為10 μg/kg和5 μg/kg。

2.4回收率及變異系數(shù)

樣品的低、中、高3個濃度的添加回收率和精密度見表1和表2。從表1和表2中可知，SMD在50、100、200 μg/kg添加范圍內(nèi)，平均回收率在肌肉為85.6%～98.0%，皮脂為98.7%～102.3%，肝臟為86.3%～98.0%，腎臟為74.2%～96.5%，變異系數(shù)范圍在2.0～11.9 (n=5) 之間。DVD在25、50、100 μg/kg添加范圍內(nèi)，平均回收率在肌肉為86.4%～91.9%，皮脂為79.5%～94.7%，肝臟為93.6%～96.1%，腎臟為71.7%～91.3%，變異系數(shù)范圍在1.0～10.2 (n=5) 之間?？梢姡幬锘厥章识急容^高，變異系數(shù)符合要求，該方法能夠滿足檢測組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶殘留的條件，快速、方便，穩(wěn)定可靠。

2.5停藥后雞各組織中磺胺對甲氧嘧啶與二甲氧芐啶的殘留測定

雞各組織中磺胺對甲氧嘧啶及二甲氧芐啶的的平均殘留量見表3。從表3可以看出停藥后4 h磺胺對甲氧嘧啶在肌肉、皮脂、肝臟、腎臟的殘留量分別為157、147、344、564μg/kg，停藥1 d磺胺對甲氧嘧啶在肌肉的殘留量已低于檢測限，而在皮脂、肝臟和腎臟的殘留量則分別降至為39、48、51 μg/kg，到停藥后第6天，3種組織中磺胺對甲氧嘧啶的殘留量均已低于檢測限，表明磺胺對甲氧嘧啶殘留量以腎臟最高，肝臟其次，肌肉最低。停藥后4 h二甲氧芐啶在肌肉、皮脂、肝臟和腎臟的殘留量分別為188、124、700、1451 μg/kg，停藥1 d二甲氧芐啶在肌肉、皮脂、肝臟和腎臟的殘留量則分別降至為23、37、67、366 μg/kg，停藥后第3天在肌肉及肝臟的殘留量均低于檢測限，在皮脂及腎臟的殘留量則分別為8 μg/kg、23 μg/kg，到停藥后第9天，在皮脂及腎臟中均未檢出二甲氧芐啶，結(jié)果表明，二甲氧芐啶在腎臟和肝臟的殘留量明顯高于肌肉和皮脂。

圖1　空白肌肉色譜圖

圖2　空白肌肉添加DVD ( 100 μg/kg ) 和SMD ( 200 μg/kg )色譜圖

圖3　停藥后4 h時肌肉樣品色譜圖

圖4　空白皮脂色譜圖

圖5　空白皮脂添加DVD (100 μg/kg ) 和SMD(200 μg/kg)色譜圖

圖6　停藥后4 h時皮脂樣品色譜圖

圖7　空白肝臟色譜圖

圖8　空白肝臟添加DVD ( 100 μg/kg ) 和SMD(200 μg/kg)色譜圖

圖9　停藥后4 h時肝臟樣品色譜圖

圖10　空白腎臟色譜圖

圖11　空白腎臟添加DVD (100 μg/kg ) 和SMD(200 μg/kg)色譜圖

圖12　停藥后4 h時腎臟樣品色譜圖

樣品Samples添加量/(μg·kg-1)Spikedlevel平均回收率/%Recovey變異系數(shù)/%RSD5085.62.6肌肉Muscle10091.57.620098.04.050102.311.9皮脂Skin+fat10098.77.020099.03.05098.04.7肝臟Liver10086.32.020094.77.05074.24.7腎臟Kidney10092.411.720096.56.2

表2　二甲氧芐啶的添加回收率和精密度(n=5)

表3　不同采樣時間雞組織中磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶平均殘留量(n=6)

注： 表中所有數(shù)值均以平均值表示；ND:表示未檢出。

Note:All the data in the table are average values; ND:Not Detectable.

3　討論

3.1磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶在雞組織的殘留檢測

鑒于磺胺類藥物可能導(dǎo)致的毒性，目前中國、歐盟、美國、日本等均將磺胺類藥物列為動物飼養(yǎng)過程中限制使用的藥物，歐盟規(guī)定牛奶和肉類食品磺胺類藥物總量 ≤ 100 μg/kg[6-7]，我國農(nóng)業(yè)部公告235號文《動物性食品中獸藥的最高殘留限量》中規(guī)定磺胺類藥物在雞所有組織中的MRL均為0.1 mg/kg，而日本規(guī)定食品中不得檢出SAs[8]。我國已批準(zhǔn)二甲氧芐啶(DVD)的生產(chǎn)與使用，涉及的制劑主要是與磺胺類藥物聯(lián)合用于家禽球蟲病的防治[9]。美國、歐盟及日本等國亦均有DVD與磺胺類藥物合用的注冊制劑產(chǎn)品，但美國、歐盟及日本等國均無明確的使用規(guī)定和安全標(biāo)準(zhǔn)，食品殘留專家委員會(JECFA)和歐洲藥品局(EMEA)等國際組織迄今未對DVD進(jìn)行過任何評價[10]。二甲氧芐啶目前尚未制定殘留限量，我們按照歐洲規(guī)定的甲氧芐啶(TMP)在組織中的最大殘留濃度小于50 μg/kg為參考[11]。

3.2磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶在雞組織中的殘留規(guī)律

磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶預(yù)混劑防治畜禽胃腸道細(xì)菌性感染，球蟲病臨床推薦用法與用量為：混飼：每1 000 kg飼料1 000 g(以預(yù)混劑計)連續(xù)飼喂不超過10 d[12]。在殘留消除研究中，試驗按最大推薦劑量(每1 000 kg飼料1 000 g預(yù)混劑)連續(xù)給藥10 d。試驗結(jié)果表明：磺胺對甲氧嘧啶和二甲氧芐啶在腎臟中殘留量最高，在停藥4 h時，磺胺對甲氧嘧啶的平均殘留量為564 μg/kg，二甲氧芐啶的平均殘留量為1 451 μg/kg，在停藥9 d時，腎臟中均未檢測出藥物；肝臟其次，在停藥3 d時，肝臟中未檢測出二甲氧芐啶，停藥6 d時，磺胺對甲氧嘧啶殘留量也降至定量限以下；肌肉和皮脂中的殘留量顯著低于腎臟和肝臟，停藥3 d時，肌肉中均未檢測出藥物，停藥9 d時，皮脂中的殘留量均低于定量限。

本研究中磺胺對甲氧嘧啶在雞各組織中的殘留消除規(guī)律與劉明生等[13]報道的在艾維茵肉雞各組織中殘留消除的趨勢是一致的，不同的是，文獻(xiàn)中報道磺胺對甲氧嘧啶在雞肝臟中的殘留量最高，腎臟其次，停藥10 d后，組織中的殘留量均低于檢測限，筆者認(rèn)為存在這種差異可能跟雞的品種有關(guān)。郝增坤[14]通過磺胺氯吡嗪鈉、二甲氧芐啶溶液在雞體內(nèi)的殘留消除試驗表明，二甲氧芐啶濃度在停藥4 h時各組織以腎臟中二甲氧芐啶濃度最高，達(dá)到1.57 μg/g，其他組織殘留依次為皮脂和肝臟，肌肉中殘留量最低，為0.31 μg/g。本研究中，二甲氧芐啶在雞腎臟和肝臟中的濃度明顯高于其他組織，與上述文獻(xiàn)結(jié)果類似。

3.3磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑休藥期的確定

停藥后磺胺對甲氧嘧啶在雞體內(nèi)各組織中的殘留消除速率由快到慢依次為肌肉、皮脂、肝臟、腎臟；二甲氧芐啶的消除速率由快到慢依次為肝臟、肌肉、皮脂、腎臟。磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑在腎臟中消除最慢且殘留濃度高于其他組織，說明磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑在雞體內(nèi)的分布是不均勻的，主要經(jīng)腎臟消除，提示腎臟為磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑在雞體內(nèi)殘留的靶組織。

按照磺胺類藥的最高殘留限量和休藥期計算的相關(guān)規(guī)定，實測數(shù)據(jù)經(jīng)WT1.4[15]休藥期計算軟件計算結(jié)果表明，磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑按最大劑量給雞混飼給藥后，磺胺對甲氧嘧啶在皮脂、肝臟和腎臟的休藥期分別約為1.86、3.33、3.98 d。我國尚未制定二甲氧芐啶的最高殘留限量(MRL)，參照國際食品法典委員會(CAC) 和歐盟等大多數(shù)國家規(guī)定的動物性食品中TMP的最高殘留限量(MRL)為50 μg/kg，二甲氧芐啶在皮脂、和腎臟的休藥期分別約為4.11 d和6.70 d。依據(jù)靶動物雞體內(nèi)的消除規(guī)律研究數(shù)據(jù),結(jié)合WT1.4軟件計算的休藥期結(jié)果，建議磺胺對甲氧嘧啶、二甲氧芐啶預(yù)混劑按推薦劑量給雞混飼給藥，連用10 d時，在雞的休藥期為7 d。

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Study on Residue Depletions of Sulfametoxydiazine and Diaveridine in Chickens

XU Wei,ZENG Zhen-ling,QUAN Dan,ZHOU Yu-hui,WANG Pei,WANG Jia-peng,HAN Ke-ke,CHEN Hong

(National Reference Laboratory of Veterinary Residues,College of Veterinary Medicine,South ChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong，510642,China)

To develop high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry method of sulfametoxydiazine (SMD) and diaveridine (DVD) premix residue in chicken tissues,and to explore elimination rule on its residues in the chicken tissues. Forty-eight healthy white feather broiler chickens which were feeded with added level of SMD and DVD premix (1 000 mg/kg) for 10 d. Six chickens were slaughtered at 4 h,1,3,6,9,12,15 d after the last feeding,respectively.Tissues including kidney,liver,muscle and fat of each chicken were collected,and SMD and DVD of tissues were determined by high performance liquid chromatographic tandem mass spectrometry.The quantitative limits of the method for SMD and DVD were 10 μg/kg and 5 μg/kg respectively for all matrices,and the recoveries were in the range of 71.7%-102.3% with RSDs of 1.0%-11.9% while blank samples were spiked with SMD and DVD at 50，100，200 μg/kg and 25，50，100 μg/kg respectively. Results showed that the residues of SMD and DVD in kidney was the highest,and lower in liver.The residues of SMD and DVD in muscle and fat were much lower than that in liver and kidney,and was declined below the LOQ at 9 day. According to the residues in all tissues and the rule of Maximum Residue Limit, the withdrawal periods for all chicken tissues were 7 day.

sulfametoxydiazine and diaveridine premix; HPLC-MS/MS; white feather broiler chicken; residue; depletion

2015-05-07

農(nóng)業(yè)部獸藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂項目[農(nóng)財發(fā)(2013)46號-32]

徐維(1990-)，女，江西宜春人，碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)研究。*通訊作者

S859.796

A

1007-5038(2016)08-0049-08