曹艷杰，何怡寧，李和鳴，謝智文，戴錦龍，磨美蘭

(廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005)

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三黃雞STING基因的克隆與序列分析

曹艷杰，何怡寧，李和鳴，謝智文，戴錦龍，磨美蘭*

(廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530005)

為探究雞干擾素基因刺激蛋白(STING)的結(jié)構(gòu)及功能，采用RT-PCR方法從三黃雞外周血淋巴細胞中擴增出全長STING基因編碼區(qū)序列并進行克隆測序。序列分析顯示，該基因編碼區(qū)全長1 140 bp，編碼379個氨基酸。核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)，三黃雞STING基因與原雞和火雞的同源性較高，分別為100%和92.3%，與其他物種STING基因的親緣關(guān)系依次為其他禽類>哺乳動物>魚類。預測STING的分子質(zhì)量為42.63 ku，理論等電點為6.67，有較好的親水性與抗原性。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中折疊占7.4%，無規(guī)則卷曲占51.2%，螺旋占41.4%。該蛋白由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)組成，跨膜結(jié)構(gòu)域僅有1個且位于N端，無信號肽。本研究首次成功克隆了三黃雞STING基因，并對其進行了生物信息學分析，可以為全面解析雞STING的分子結(jié)構(gòu)及功能提供參考。

STING基因；三黃雞；克??；序列分析

干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)也被稱為MITA、ERIS或MPYS，是天然免疫Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)生成通路中的一個銜接蛋白。STING在細菌、病毒等病原微生物引起的天然免疫反應中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。

STING是RNA病毒和DNA病毒誘導Ⅰ型干擾素表達和抗病毒天然免疫中的重要接頭蛋白，多種DNA和RNA病毒入侵能激活以STING為中心蛋白的相關(guān)通路[2]。病毒感染后，STING與MAVS相互作用招募TBK1，自身寡聚化形成MAVS-STING-TBK1-IRF3復合物，促進TBK1對IRF3的

磷酸化激活，從而介導Ⅰ型干擾素的表達[1,3]。利用STING基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)，STING基因缺失小鼠對細菌DNA、病毒DNA、哺乳動物DNA及各種DNA病毒，如單純皰疹病毒1(HSV-1)等感染的應答顯著降低，Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生受到顯著抑制[4]。STING也可以激活NF-κB介導的轉(zhuǎn)錄途徑，誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。STING不是DNA受體，不能結(jié)合DNA，但對DNA病毒受體研究發(fā)現(xiàn)，目前被鑒定的多個DNA受體IFI16、DDX41、cGAS、DNA-PK和環(huán)狀GMP-AMP合成酶等都以STING依賴方式參與Ⅰ型干擾素通路的活化[5]。STING是細菌來源的環(huán)二核苷酸(CDNs)的直接受體，免疫第二信使cGAS蛋白(即CDNs合成酶)的發(fā)現(xiàn)，加深了我們對STING介導的DNA免疫應答的認識[6]。Sun W等[1]研究推斷STING通過二聚化激活天然免疫反應，二聚化是其自身激活及下游信號傳遞必需的。Jin 等[7]發(fā)現(xiàn)STING還與MHC-II類分子似相關(guān)，并介導死亡信號的轉(zhuǎn)導。

近幾年來，人和豬等哺乳動物STING基因研究取得了重大進展[9-10]。相比于哺乳動物，禽類STING基因研究的發(fā)展較為緩慢滯后。本試驗對三黃雞STING基因進行克隆、生物信息學分析及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預測，旨在為進一步揭示禽類相關(guān)傳染病的發(fā)生、傳播機制及天然免疫的調(diào)節(jié)機理奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

DH5α,康為世紀科技(北京)有限公司產(chǎn)品；pMD20-T、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2000 、DNA Marker DL 1 000、總RNA抽提試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA純化回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；淋巴細胞分離液,索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。三黃雞購自廣西富鳳農(nóng)牧有限公司。

1.2方法

1.2.1雞外周血淋巴細胞的分離采集三黃雞新鮮抗凝血5 mL，使用外周血淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞。

1.2.2總RNA提取參照總RNA抽提試劑盒說明提取三黃雞外周血淋巴細胞總RNA，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.3引物設(shè)計與合成參照NCBI上的原雞跨膜蛋白173即STING mRNA基因序列(NM-001305152.1)，利用primer 6.0和Oligo 7設(shè)計擴增三黃雞STING基因全長序列的1對引物。上游引物P1:5′-TAGGAATTCATGCCCCAGGACCCGTCAA- CCAGGAG(EcoRⅠ)-3′；下游引物P2:5′- TAAAG- CTTTCAGGGGCAGTCACTGCG(HindⅢ)-3′。引物由廣州華大基因有限公司合成。1.2.4STING基因的RT-PCR擴增將抽提的外周血淋巴細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行PCR擴增。為了提高擴增特異性，使用降落PCR進行擴增。循環(huán)參數(shù)為：98℃ 5 min;98 ℃ 10 s,63℃ 15 s,68℃ 20 s,5個循環(huán)；98℃ 10 s,59℃ 15 s,68℃ 20 s,5個循環(huán)；98℃ 10 s,57℃ 15 s,68℃ 20 s,5個循環(huán)；98℃ 10 s,55℃ 15 s,68℃ 20 s,20個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.5克隆與鑒定對PCR產(chǎn)物進行回收純化并與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。通過藍白斑篩選挑取單個白色菌落，增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行單、雙酶切鑒定。選取3個陽性樣品送廣州華大基因有限公司測序。

1.2.6STING基因序列分析及結(jié)構(gòu)預測應用DNA Star軟件和Expasy在線軟件(hitp://web.expasy.org/protpa)對STING基因進行序列相似性分析和對其編碼產(chǎn)物的親水性、疏水性、柔韌性和抗原性進行預測；利用MEGA 5.0軟件分析其遺傳演化關(guān)系。同時分別應用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務(wù)器PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)、TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM/)和SignalP 4.1 Server軟件(http://www.cbs.dtu.Dk/servces/SignalP/)對其二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和信號肽進行分析。

2　結(jié)果

2.1三黃雞STING基因RT-PCR擴增結(jié)果

以三黃雞外周血淋巴細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。結(jié)果顯示，擴增得到1條大小約為1 140 bp的特異性條帶，與預期結(jié)果符合(圖1)。

2.2三黃雞STING基因的克隆鑒定

將RT-PCR擴增產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取白色菌落，培養(yǎng)提取重組質(zhì)粒進行酶切鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ單酶切和EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切后均得到與預計大小相符的片段(圖2)。將篩選得到的陽性克隆命名為pT-STING。

M.DNA標準DL 2 000；1.雞STING基因的RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-PCR product of STING gene from Sanhuang chicken ; 2.Negative control

圖1三黃雞STING基因的RT-PCR擴增

Fig.1RT-PCR amplification of STING gene from Sanhuang chicken

M.DNA標準DL 1 000；1.pT-STING的EcoR Ⅰ +HindⅢ雙酶切；2.pT-STING的EcoRⅠ單酶切

M.DNA Marker DL 1 000; 1 Products from pT-STING digested byEcoRⅠ andHindⅢ; 2.Products from pT-STING digested byEcoRⅠ

圖2重組質(zhì)粒pT-STING的酶切鑒定

Fig.2Restriction enzymatic digestion analysis of recombinant plasmid pT-STING

2.3三黃雞STING基因序列測定及分析

將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序，將獲得的測序結(jié)果與GenBank中登錄的STING相關(guān)序列進行Blast比較，與引物源原雞STING基因(NM001305152.1)核苷酸同源性最高(100%)，確定其為三黃雞STING基因編碼區(qū)序列。該基因含1個完整的開放閱讀框(ORF)，共編碼379個氨基酸。

2.4三黃雞STING基因序列的同源性和遺傳演化關(guān)系分析

將克隆的三黃雞STING基因與GenBank中公布的14個其他物種的STING基因序列進行核苷酸同源性比較。結(jié)果顯示，三黃雞STING基因與原雞的同源性最高，達100%；火雞的次之，為92.3%；與斑馬魚和鯉魚的同源性最低，分別為46.1%和44.6%；與白領(lǐng)姬鹟、沙雞屬、綠頭鴨等禽類動物的同源性為74.6%～78.7%；與人、小家鼠、野豬等哺乳動物的同源性為51.9%～56.0%。

進一步對三黃雞和以上14個物種的STING基因序列進行系統(tǒng)遺傳進化分析。結(jié)果表明，三黃雞與原雞、火雞、白領(lǐng)姬鹟、沙雞屬、綠頭鴨等禽類的形成1個分支，其中與原雞親緣關(guān)系最近；小家鼠、牛、野豬等哺乳動物的形成1個分支，與三黃雞的遺傳距離較近；斑馬魚和鯉魚形成1個與三黃雞的遺傳距離較遠的分支(圖3)。

圖3　三黃雞和其他物種的STING基因核苷酸的進化關(guān)系樹

2.5三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物基本理化性質(zhì)分析

通過DNA Star軟件和Expasy在線軟件對擴增得到的三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物進行理化性質(zhì)分析。結(jié)果該基因編碼379個氨基酸，對應蛋白的分子式為C1897H3032N530O541S22，原子個數(shù)為6 022，分子質(zhì)量為42.63 ku，推導的理論等電點為6.67。氨基酸組成中，堿性氨基酸殘基為40個，酸性氨基酸殘基為42個，疏水性氨基酸殘基143個，極性氨基酸殘基94個。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為69.26，提示該蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白。脂溶性指數(shù)為105.01，總平均親水性值(GRAVY)為-0.041，表現(xiàn)出較好的親水性。

2.6三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物的親水性、疏水性、柔韌性及抗原性預測

應用DNA Star軟件子程序Prostean對三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物的親、疏水性，柔韌性及抗原性進行預測。結(jié)果顯示，三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物親水性殘基所占比例大于疏水性殘基，因此推測其編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性，但在28-50位之間有較高疏水性，可能為跨膜區(qū)域；柔韌性區(qū)域在N端分布較稀疏，中間段與C端分布相對均勻。抗原表位區(qū)域較大，中段與C端相對較為密集，N端次之；與柔韌性區(qū)域出現(xiàn)較多重疊區(qū)，這些區(qū)域易于變性，便于抗原、抗體自由結(jié)合，可能是抗原位點的結(jié)合區(qū)(圖4)。

2.7三黃雞STING二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)及信號肽預測

將推測的三黃雞STING氨基酸序列輸入到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測服務(wù)器PSIPRED中，對其進行二級結(jié)構(gòu)預測。結(jié)果顯示，STING蛋白肽鏈中折疊占7.4%，無規(guī)則卷曲占51.2%，螺旋占41.4%。無規(guī)則卷曲和螺旋交替出現(xiàn)，折疊主要穿插于無規(guī)則卷曲之間(圖5)。應用TMHMM Serverv.2.0分析其跨膜區(qū)，該蛋白由胞內(nèi)區(qū)(1-27 aa)、跨膜區(qū)(28-50 aa)和胞外區(qū)(51-379 aa)3部分組成，且僅有1個跨膜結(jié)構(gòu)域(圖6)。用SignalP 4.1 Server軟件預測其信號肽，結(jié)果顯示，該蛋白無信號肽(圖7)。

圖4　三黃雞STING基因編碼產(chǎn)物的親水性、疏水性、柔韌性及抗原性預測

圖5　三黃雞STING基因編碼氨基酸序列二級結(jié)構(gòu)預測圖

圖6　 三黃雞STING跨膜區(qū)預測

圖7　三黃雞STING信號肽位置預測

3　討論

天然免疫是宿主抵御病原體感染的第一道防線，在特異性免疫應答的啟動、類型和強度方面發(fā)揮重要的作用。STING是天然免疫Ⅰ型干擾素生成通路中的一個重要銜接蛋白，因此對其結(jié)構(gòu)和功能的了解非常必要。

本研究首次克隆了三黃雞STING基因。核苷酸序列相似性分析顯示，三黃雞STING基因與原雞親緣關(guān)系最近，與火雞、綠頭鴨、白領(lǐng)姬鹟、沙雞屬的親緣關(guān)系次之，并同屬于禽類分支上；與野豬、牛、綿羊、人、黑猩猩、小家鼠親緣關(guān)系漸遠；與斑馬魚和鯉魚親緣關(guān)系最遠。利用生物信息學相關(guān)軟件對其進行序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示，三黃雞STING整體表現(xiàn)為親水性，有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，大部分蛋白在膜外，因此推測其為一次跨膜蛋白。三黃雞STING為跨膜蛋白，這一點與目前已知的關(guān)于人、豬等哺乳動物的相一致。而關(guān)于跨膜次數(shù)，則與哺乳動物不同。相關(guān)研究表明，人和豬等哺乳動物STING的N端有4個或5個跨膜結(jié)構(gòu)域[9-10]，而三黃雞STING僅有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。另外，三黃雞STING無信號肽，表明該蛋白不是分泌蛋白。但是，已預測的哺乳動物的STING為分泌蛋白，N端有信號肽[10]。由此推測，三黃雞STING與哺乳類STING在結(jié)構(gòu)和功能上可能存在一定的種屬差異性。

信號肽不僅決定一個蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，而且和蛋白質(zhì)或其新生肽鏈在細胞內(nèi)的定位有關(guān)。目前，關(guān)于STING的定位仍然存在一定爭議，Zhong B等[10]發(fā)現(xiàn)STING定位于線粒體外膜，并與同樣定位于線粒體的膜蛋白MAVS相互作用，因此，他們認為STING可能起到連接MAVS信號復合物與TBKI-IRF3調(diào)控路徑的作用。而Ishikawa H等[11]認為STING主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且通過胞內(nèi)位置的變化發(fā)揮作用。謝立蘭[9]研究發(fā)現(xiàn)豬源STING同時分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，但主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Cheng Y等[12]利用激光共聚焦技術(shù)在DF-1細胞中進行STING亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)雞STING主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也有部分定位于線粒體。由此可知，在禽類和哺乳類動物上，已出現(xiàn)STING同時存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的相關(guān)報道。但在其他動物上還未見此類報道。因此，對STING的定位仍有待更加深入地研究。

本研究首次克隆了三黃雞STING基因并利用生物信息學技術(shù)對該基因序列進行了分析和蛋白結(jié)構(gòu)預測，初步了解了該基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、親水性、抗原性、二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)及信號肽等信息，為進一步研究家禽STING的結(jié)構(gòu)功能和揭示病毒入侵宿主的致病機制奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of STING Gene in Sanhuang Chicken

CAO Yan-jie,HE Yi-ning,LI He-ming,XIE Zhi-wen,DAI Jin-long,MO Mei-lan

(College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

To know the structure and function of STING gene in chicken,the coding region of STING gene was amplified from peripheral blood mononuclear cells of Sanhuang chicken by RT-PCR and cloned,then sequenced.Sequence analysis showed that the coding region of STING gene was 1 140 bp in length and encoded a protein of 379 amino acids.Similarity analysis of nucleotide sequence showed that Sanhuang chicken shared high nucleotide similarity withGallusgallusand turkey in STING gene (100% and 92.3%,respectively).The descending nucleotide similarity orders among Sanhuang chicken and other species were other avian types>mammals>fish.The predicted molecular weight and isoelectric point of STING were about 42.63 ku and 6.67,respectively.And the predicted STING protein had high hydrophilicity and antigenicity.The protein structure study indicated that beta-turn,random coil and alpha-helix were 7.4%,51.2% and 41.4%,respectively.The protein was composed of intracellular domain,transmembrane domain and extracellular domain and just had a transmembrane domain in its N terminal.The protein contained no signal peptide.The STING gene of Sanhuang chicken was cloned successfully for the first time in our study and the bioinformatics analysis was conducted,which provided references for the analysis of molecular structure and function of STING in chickens.

STING gene; Sanhuang chicken; cloning; sequence analysis

2015-12-30

國家自然科學基金項目(31360611)；廣西自然科學基金項目(2014GXNSFDA118011,2013GXNSFCA019010)

曹艷杰(1991-)，女，河南開封人，碩士研究生，主要從事禽病學研究。*通訊作者

S852.23

A

1007-5038(2016)08-0030-06