孫彩霞，李　明，喬瑞敏，韓雪蕾，李新建（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州　450002）

豬EGFL6基因生物信息學(xué)分析

孫彩霞，李明，喬瑞敏，韓雪蕾，李新建*
（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002）

為了解豬EGFL6基因基本特性，克隆該基因CDS區(qū)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析其氨基酸理化性質(zhì)、同源性、蛋白功能及二三級(jí)結(jié)構(gòu)等。結(jié)果表明，豬EGFL6基因CDS區(qū)全長(zhǎng)1 665 bp，編碼554個(gè)氨基酸，與人、馬、小鼠、綿羊等氨基酸相似性均在75%以上，親緣關(guān)系較近，該蛋白具有親水性和不穩(wěn)定性，是分泌蛋白，有12個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，無(wú)規(guī)則卷曲是二三級(jí)結(jié)構(gòu)中最主要結(jié)構(gòu)元件。該研究為進(jìn)一步揭示豬EGFL6基因功能奠定基礎(chǔ)。

EGFL6；生物信息學(xué)；豬

孫彩霞,李明,喬瑞敏,等.豬EGFL6基因生物信息學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(4):16-23.

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-4-22 10:01:11[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1001.010.html

表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域蛋白6（Epidermal growth factor-like domain 6，EGFL6）是類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子超家族蛋白成員之一，Yeung等首次發(fā)現(xiàn)，證實(shí)其位于人的Xp22染色體，因具有MAM結(jié)構(gòu)域，故又命名為MAM[1-2]。人EGFL6蛋白含有553個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為6.1×104，包含5個(gè)類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域和一個(gè)羧基端MAM結(jié)構(gòu)域。小鼠、狗、豬的EGFL6基因均有12個(gè)外顯子組成，位于X染色體；雞EGFL6基因有12個(gè)外顯子組成，位于1號(hào)染色體，而斑馬魚(yú)EGFL6基因有13個(gè)外顯子組成，位于9號(hào)染色體。研究表明，EGFL6基因在一些腫瘤組織如乳腺癌、肺癌、腦脊膜瘤、黑色素瘤和卵巢癌等腫瘤組織呈高表達(dá)趨勢(shì)，尤其是卵巢癌TEC中表達(dá)量較高[3-4]。

亢中奎等首次開(kāi)展人EGFL6基因?qū)δ[瘤細(xì)胞株A375和SKOV3增殖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)人EGFL6促進(jìn)A375和SKOV3增殖，但增殖作用機(jī)制有待研究[5]；呂成定等表明，沉默EGFL6基因表達(dá)抑制人黑素瘤A375細(xì)胞增殖和侵襲能力，有可能成為黑素瘤治療潛在靶標(biāo)[6]；EGFL6基因在癌癥發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為潛在腫瘤分子標(biāo)記物，為診斷和治療提供依據(jù)。EGFL6基因表達(dá)于小鼠毛囊和顱面區(qū)間質(zhì)[7]，通過(guò)旁分泌途徑對(duì)肥胖人群脂肪組織具有上調(diào)作用，成熟脂肪組織是EGFL6主要來(lái)源，促進(jìn)脂肪組織衍生的基質(zhì)血管細(xì)胞（ADSVC）增殖[8]。EGFL6基因在成骨樣細(xì)胞上表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和移植[9]，表明EGFL6參與系列生理過(guò)程對(duì)血管生成和細(xì)胞移植具有重要作用。楊晶等制備較高效價(jià)EGFL6多克隆抗體，不僅可與原核表達(dá)EGFL6全長(zhǎng)及片段蛋白特異性結(jié)合，也能識(shí)別細(xì)胞株中天然EGFL6蛋白，為進(jìn)一步研究EGFL6相關(guān)性質(zhì)與功能提供基礎(chǔ)[10]。

目前，豬EGFL6基因相關(guān)研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過(guò)前期高通量測(cè)序篩選，發(fā)現(xiàn)EGFL6基因在不同品種豬群中表達(dá)差異顯著，可為預(yù)測(cè)其生物信息學(xué)功能，深入了解EGFL6基因及后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1EGFL6基因序列獲取

1.1.1試驗(yàn)樣品

采集豬腎臟組織，液氮保存，以備后用。

1.1.2主要試驗(yàn)步驟

① TRlzon提取總RNA，PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser（Taraka）試劑盒反轉(zhuǎn)錄，獲得全基因組cDNA；

②以NCBI上XM_005673431.2為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增；

③將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，獲得EGFL6基因編碼區(qū)序列。

1.2同源性分析

從NCBI-Blastp對(duì)比結(jié)果中選擇幾種具有代表性物種，如人、馬、犬、貓、大鼠、小鼠、綿羊等，并下載其氨基酸序列，利用MEGA6.0進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.3EGFL6生物信息學(xué)分析

利用NCBI、ExPASy、ProtFun等公共數(shù)據(jù)庫(kù)及在線軟件包分析EGFL6基因生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)功能、信號(hào)肽、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及疏水性/親水性、亞細(xì)胞定位、激酶磷酸化修飾位點(diǎn)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。主要軟件或在線網(wǎng)站相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1　預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)用的網(wǎng)站和軟件Table 1　Webs and software for predicting the gene structure and function

2　結(jié)果與分析

2.1EGFL6基因序列信息

通過(guò)PCR擴(kuò)增，并測(cè)序，結(jié)果表明，EGFL6基因CDS（Coding sequence）區(qū)長(zhǎng) 1 665 bp，對(duì) ORF （Open reading frame）閱讀框預(yù)測(cè)，編碼554個(gè)氨基酸（見(jiàn)圖1）。

2.2同源性分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blastp程序，將EGFL6氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，數(shù)據(jù)顯示，豬與人、馬、犬、貓、牛、小鼠、大鼠、綿羊、雞、鴨、斑馬魚(yú)氨基酸序列相似性分別為79%、83%、81%、80%、76%、76%、75%、81%、59%、60% 和48%；利用Mega 6.0軟件對(duì)12個(gè)物種EGFL6基因氨基酸序列多重比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖2）

2.3EGFL6氨基酸一級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

通過(guò)ExPASy ProtParam在線預(yù)測(cè)EGFL6基因編碼氨基酸序列組成成分和理化性質(zhì)。結(jié)果顯示，554個(gè)氨基酸原子組成式為C2645H4205N779O798S45，共8 472個(gè)原子，相對(duì)分子質(zhì)量為61 128.9。帶正電荷氨基酸數(shù)目（77）大于帶負(fù)電荷氨基酸數(shù)目（64），等電點(diǎn)（PI）為8.56，偏堿性。EGFL6在280 nm波長(zhǎng)下消光系數(shù)為63 225m-1·cm-1（假設(shè)所有半胱氨酸均來(lái)自胱氨酸）和60 850m-1·cm-1（假設(shè)無(wú)半胱氨酸殘基存在），半衰期為30 h。不穩(wěn)定系數(shù)<40表示蛋白質(zhì)穩(wěn)定，>40表示蛋白質(zhì)不穩(wěn)定[11]，預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)分值為44.02，表示EGFL6蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪系數(shù)為70.04，預(yù)測(cè)總平均親水系數(shù)為-0.462。蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)是根據(jù)GRAVY預(yù)測(cè)，GRAVY值范圍2～-2，正值表明此蛋白為疏水性蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白。因此，該蛋白為親水蛋白。

圖1　EGFL6基因CDS序列及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1　CDS and predicted amino acid sequence of EGFL6

2.4EGFL6蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)

Protfun 2.2預(yù)測(cè)EGFL6蛋白細(xì)胞水平功能、酶類(lèi)別及基因本體論范疇，結(jié)果見(jiàn)表2。該蛋白細(xì)胞水平功能是細(xì)胞膜組成（0.790），可能參與氨基酸生物合成、運(yùn)輸和綁定；屬于酶類(lèi)可能性為0.456，最可能是水解酶；在基因本體范疇預(yù)測(cè)中應(yīng)激反應(yīng)可能性為0.136，機(jī)率最大為1.550，其對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有重要作用。

圖2　不同物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree of different species

表2　EGFL6蛋白功能預(yù)測(cè)Table 2　Function prediction of EGFL6 protein

2.5EGFL6信號(hào)肽預(yù)測(cè)

Signal P-4.1 Server軟件預(yù)測(cè)EGFL6信號(hào)肽，結(jié)果見(jiàn)表3。C（C-score）代表原始信號(hào)肽裂解位點(diǎn)記分，C值越大表示該點(diǎn)出現(xiàn)裂解位點(diǎn)可能性越大；S（S-score）代表信號(hào)肽評(píng)分，評(píng)分越大表示該氨基酸位于信號(hào)肽區(qū)域概率越大，評(píng)分越低表示相應(yīng)氨基酸不含信號(hào)肽或位于成熟蛋白部分；Y（Y-score）是最有可能的信號(hào)肽裂解位點(diǎn)，基于C值和S值的斜率得出幾何平均數(shù)，在Y值最大處具有最大C值和陡峭S斜率。D（D-score）是S均值和最大Y值加權(quán)平均值，用于區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽。D=0.450是區(qū)分信號(hào)肽和非信號(hào)肽臨界值，EGFL6蛋白預(yù)測(cè)D=0.813，因此根據(jù)信號(hào)肽假說(shuō)推測(cè)EGFL6蛋白含有信號(hào)肽，屬于分泌蛋白，且剪切位點(diǎn)位于18～19個(gè)堿基VAG-GG（見(jiàn)圖3）。

表3　EGFL6保守結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)Table 3　Site of EGFL6 conserved domain

2.6EGFL6保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

通過(guò)NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（Conserved Do?main Database,CDD）分析EGFL6序列保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見(jiàn)圖4。

EGFL6基因氨基酸序列有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于EGF_CA和MAM超家族兩個(gè)超家族，5個(gè)結(jié)構(gòu)域依次是EGF_C、cE、EGF_CA、EGF_CA、MAM。EGF_CA超家族具有鈣離子結(jié)合功能，主要存在于膜結(jié)合蛋白和動(dòng)物胞外蛋白上；MAM超家族是胞外結(jié)構(gòu)域，主要介導(dǎo)蛋白間相互關(guān)系，具有細(xì)胞粘附功能。EGFL6基因與兩個(gè)家族具有共同結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明其具有類(lèi)似功能。預(yù)測(cè)5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域相應(yīng)具體位點(diǎn)如表3所示。

2.7EGFL6跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用TMHMM Server version 2.0預(yù)測(cè)EGFL6蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖3　EGFL6信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3　Signal peptide prediction of EGFL6

圖4　EGFL6保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.4　Conserved domain of EGFL6

圖5　EGFL6跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5　Transmembrance prediction of EGFL6

由圖5可知，該氨基酸無(wú)跨膜螺旋（TMHs），即無(wú)跨膜區(qū)；非跨膜螺旋區(qū)（ExpAA）預(yù)測(cè)值為0.74291，該值>18時(shí)說(shuō)明預(yù)測(cè)蛋白為跨膜蛋白，蛋白N端位于膜內(nèi)一側(cè)可能性是0.03527，總體該序列位于膜外，EGFL6基因所編碼蛋白為非跨膜蛋白。

2.8EGFL6亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

運(yùn)用PSORTⅡ工具預(yù)測(cè)EGFL6亞細(xì)胞定位，根據(jù)k-NN算法預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。EGFL6位于細(xì)胞核概率最大，占整體的52.2%，其次是線粒體，預(yù)測(cè)概率為26.1%，位于細(xì)胞外基質(zhì)（包括細(xì)胞壁）和細(xì)胞質(zhì)概率分別是13.0%和8.7%。

2.9EGFL6親水性/疏水性

利用ExPASY ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)EGFL6氨基酸序列親水性/疏水性，分值代表其疏水性大小。負(fù)值越大（絕對(duì)值）表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，整條鏈在第537處甘氨酸，具有最大疏水值（2.422），在第344處谷氨酸，具有最小疏水值（-3.667）。EGFL6蛋白N末端疏水，C末端親水，整條鏈中親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基。因此，可推測(cè)EGFL6是可溶性蛋白（見(jiàn)圖6）。

表4　EGFL6亞細(xì)胞定位Table 4　Subcellular location of EGFL6

圖6　EGFL6疏水性分析Fig.6　Hydrophilia/hydrophobicity analysis of EGFL6

2.10EGFL6激酶磷酸化修飾位點(diǎn)分析

蛋白質(zhì)磷酸化是基因序列翻譯后修飾一種重要機(jī)制，對(duì)代謝、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、分化、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞進(jìn)程具有重要影響。磷酸化修飾與多種因素有關(guān)，通常發(fā)生在絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、或酪氨酸（Y）3個(gè)殘基上，被各種蛋白激酶催化。KinasePhos網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EGFL6有7個(gè)絲氨酸激酶（氨基酸位點(diǎn)：57，92，180，323，335，486，497）、4個(gè)蘇氨酸激酶（290，306，388， 389）和1個(gè)酪氨酸激酶（145）潛在磷酸化位點(diǎn)。其中3個(gè)磷酸化位點(diǎn)較為活躍，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　EGFL6活躍磷酸化位點(diǎn)Table 5　Active phosphorylation sites of EGFL6

2.11EGFL6二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SOPMA程序預(yù)測(cè)EGFL6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)由259個(gè)氨基酸殘基組成的無(wú)規(guī)則卷曲，占整個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的46.75%，是EGFL6二級(jí)結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成；β-轉(zhuǎn)角由65個(gè)氨基酸構(gòu)成，占整體11.73%；α-螺旋、延伸鏈分別由102、128個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，在整體中所占比例分別為18.41%和23.10%。如圖7所示。

2.12EGFL6三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

EGFL6蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8。將豬三維結(jié)構(gòu)和小鼠、大鼠、貓、人空間結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，貓和人、小鼠及大鼠三維結(jié)構(gòu)差異較大。

圖7　EGFL6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7　Secondary structure of EGFL6

圖8　三級(jí)分子結(jié)構(gòu)Fig.8　3Dmolecular structures

3　討論

3.1豬EGFL6基因基本生物信息學(xué)分析

豬EGFL6基因位于X染色體上，12個(gè)外顯子，基因序列全長(zhǎng)165 641 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)1 665 bp，ORF預(yù)測(cè)最長(zhǎng)編碼554個(gè)氨基酸；相對(duì)分子質(zhì)量為61 128.9，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（不穩(wěn)定系數(shù)分值為44.02），帶正電荷，偏堿性，為親水性蛋白。氨基酸同源性分析表明，豬與馬、人、小鼠、牛氨基酸序列相似性較高，分別為83%、79%、76%和76%，與雞、鴨同源性?xún)H59%和60%，與運(yùn)用MEGA6.0軟件進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致，豬EGFL6基因和馬親緣關(guān)系更近，與雞、鴨親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3.2豬EGFL6基因功能預(yù)測(cè)

運(yùn)用NCBI的CDD對(duì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別屬于MAM和EGF_CA兩個(gè)超家族。KinasePhos預(yù)測(cè)12個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，其中3個(gè)較活躍磷酸化位點(diǎn)分別位于第323、325和497個(gè)氨基酸，第323和497個(gè)絲氨基酸磷酸化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)激酶為CⅡ，第325個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)對(duì)應(yīng)激酶為PKG，說(shuō)明EGFL6蛋白活性被改變可能性變大。蛋白功能預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位主要運(yùn)用ProtFun和PSORT在線軟件，結(jié)果表明EGFL6蛋白主要功能是細(xì)胞膜組成、氨基酸生物合成，位于細(xì)胞核可能性為52.2%[12-13]。Signal P信號(hào)肽預(yù)測(cè)和TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，EGFL6為非跨膜分泌蛋白，與周宇等研究方法[14]一致。

3.3豬EGFL6基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

SOPMA預(yù)測(cè)EGFL6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲是主要構(gòu)件，占整個(gè)結(jié)構(gòu)46.75%。無(wú)規(guī)則卷曲（Coil），又稱(chēng)為環(huán)區(qū)（Loop），柔性大，經(jīng)常出現(xiàn)在活躍點(diǎn)和對(duì)接點(diǎn)，可用于分子識(shí)別，在蛋白質(zhì)特征和功能中起關(guān)鍵作用[15]。對(duì)于EGFL6蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)建模服務(wù)器使用廣泛[16-17]。一般同源性超過(guò)30%蛋白質(zhì)序列均可建立精確結(jié)構(gòu)模型，序列同源性越高則建立模型結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性越高[18-20]；比較三級(jí)結(jié)構(gòu)可知，豬與人EGFL6基因空間構(gòu)型差別較大，說(shuō)明盡管氨基酸序列極其相似，但蛋白質(zhì)翻譯加工過(guò)程復(fù)雜。

4　結(jié)論

通過(guò)豬EGFL6基因基本生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)編碼氨基酸序列功能，預(yù)測(cè)軟件經(jīng)大量模型和算法驗(yàn)證，可信性高，可為研究豬EGFL6基因功能提供參考。

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Bioinformatics analysis ofEGFL6 gene in pig

SUN Caixia,LIming,QIAO Ruimin, HAN Xuelei,LI Xinjian(School of Animal Science and Veterinarymedicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To explore the specific character ofEFGL6 gene,CDS region was cloned and some characters ofEGFL6 gene were analyzed by bioinformaticsmethod,including the physical and chemical properties,the homology of encoding amino acid,protein function,secondary and tertiary structure and so on.The results showed that the CDS region ofEGFL6 gene was 1 665 bp,and encoded 554 amino acids. The similarity of amino acid sequence was over 75%with human,horse,rat,sheep.EGFL6 was hydrophilic and unstable.It was secretory protein and it had 12 potential phosphorylation sites and five conserved domains,but had no transmembrane domain,and coil was the primarily component of the corresponding secondary structure and tertiary structure.These results would provide theoretical foundations for the future study.

EGFL6;bioinformatics;pig

S858.28；Q78

A

1005-9369（2016）04-0016-08

2016-02-03

河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（S2012-06）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（142102110047）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U150 4322）

孫彩霞（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種。E-mail:836353527@qq.com

李新建，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail:lxjlongfei@163.com