王希彪，童縣偉，崔世泉，狄生偉，李富榮，劉志然，宋　斌（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱　150030）

多聚免疫球蛋白受體（pIgR）基因多態(tài)性及其與仔豬腹瀉關(guān)系

王希彪，童縣偉，崔世泉，狄生偉，李富榮，劉志然，宋斌
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030）

采用PCR-SSCP結(jié)合測(cè)序方法，在民豬、長白豬兩群體中檢測(cè)pIgR基因外顯子1多態(tài)性，研究母豬基因多態(tài)性與仔豬腹瀉關(guān)系。結(jié)果表明，pIgR基因外顯子1存在兩個(gè)錯(cuò)義突變，第373位C→T導(dǎo)致丙氨酸→纈氨酸變異，第394位A→G導(dǎo)致天冬氨酸→絲氨酸變異。民豬群體有AA、AB和BB三種基因型，長白豬群體有AA和AB兩種基因型，兩群體基因型分布差異極顯著（P<0.01）。民豬群體，不同基因型母豬仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉致死率均存在顯著差異（P<0.05），但長白豬群體，僅腹瀉指數(shù)表現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。

民豬；pIgR基因；多態(tài)性；腹瀉；SSCP

王希彪，童縣偉，崔世泉,等.多聚免疫球蛋白受體（pIgR）基因多態(tài)性及其與仔豬腹瀉關(guān)系[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47 (4):10-15.

Wang Xibiao,Tong Xianwei,Cui Shiquan,et al.Polymorphism ofpIgRgene and its relation with piglet diarrhea[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(4):10-15.(in Chinese with English abstract)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-4-22 10:00:48[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160422.1000.002.html

多聚免疫球蛋白受體（Polymeric immunoglobu?lin receptor，pIgR）為免疫球蛋白超家族中Ⅰ型跨膜蛋白，是多聚免疫球蛋白A（Polymeric IgA，pIgA）和多聚免疫球蛋白M（Polymeric IgM，pIgM）特異性受體[1]，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。乳腺黏膜上皮細(xì)胞中，pIgR胞外部分與黏膜固有層中的pIgA結(jié)合，經(jīng)穿胞轉(zhuǎn)運(yùn)將pIgA從上皮細(xì)胞基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到頂膜。Mostov研究發(fā)現(xiàn)，在硫醇依賴性蛋白酶作用下，pIgR胞外部分脫落，形成分泌片SC（Secretory component，SC），SC和pIgA一起分泌到乳中，形成分泌型IgA（sIgA）[2]。sIgA對(duì)酸、堿以及蛋白酶水解作用有較強(qiáng)抵抗力，在消化道中維持其抗體活性。Luton等研究表明，乳中sIgA進(jìn)入仔豬消化道后附著在消化道黏膜表面，可阻止病原微生物對(duì)腸道黏膜上皮黏附作用，促進(jìn)病原微生物排出，減少腸道疾病發(fā)生[3]。未與pIgA結(jié)合的SC稱為游離SC，直接參與機(jī)體非特異性免疫活動(dòng)[4]。Willer等研究發(fā)現(xiàn)，人乳中游離SC可與福氏及宋氏志賀菌結(jié)合，預(yù)防新生兒痢疾[5]。

目前，對(duì)pIgR研究多集中在人類黏膜免疫方面，有關(guān)pIgR基因多態(tài)性是否影響仔豬腹瀉鮮見報(bào)道。因此，本研究選擇抗腹瀉能力差別較大的民豬和長白豬為試驗(yàn)對(duì)象[6-7]，通過PCR-SSCP結(jié)合測(cè)序方法分析豬pIgR基因外顯子1多態(tài)性，研究基因多態(tài)性與仔豬腹瀉性狀和生長性狀關(guān)系，旨在尋找與抗腹瀉相關(guān)的pIgR遺傳標(biāo)記，發(fā)掘民豬抗腹瀉遺傳優(yōu)勢(shì)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物

黑龍江省蘭西縣種豬場(chǎng)民豬母豬70頭，對(duì)應(yīng)仔豬720頭；長白母豬43頭，對(duì)應(yīng)仔豬410頭。

1.1.2耳組織采集

采集70頭民豬母豬和43頭長白豬母豬耳組織，約0.5 g，置于裝有70%乙醇Ep管中，-20℃保存，提取豬基因組DNA。

1.1.3仔豬腹瀉評(píng)分記錄

仔豬出生至35日齡，每日逐頭檢查哺乳仔豬肛門，根據(jù)有無糞便污染，是否紅腫及圈內(nèi)仔豬糞便狀況評(píng)分，記錄仔豬死亡原因及頭數(shù)。腹瀉狀況評(píng)分參照文獻(xiàn)[8]，見表1。腹瀉指數(shù)=糞便狀況評(píng)分之和/供試驗(yàn)豬總頭數(shù)，指數(shù)越高，腹瀉越嚴(yán)重；腹瀉致死率（%）=腹瀉死亡頭數(shù)/總頭數(shù)×100%。

表1　腹瀉狀況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Evaluation standard of diarrhea degree

1.1.4仔豬生長性能測(cè)定

稱量每頭仔豬出生重和35日齡重，計(jì)算哺乳期仔豬平均日增重，平均日增重=（35日齡重-初生重）/35。

1.1.5試驗(yàn)試劑

三氯甲烷、Tris飽和酚、蛋白酶K（Proteinase K）、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、DL2000marker、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甲醛、硝酸銀、乙醇等分析純等級(jí)試劑均購自哈爾濱適合生物科技有限公司。

1.1.6主要儀器和設(shè)備

梯度PCR儀，購自德國Biometro公司；冷凍離心機(jī)，購自Bakman公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自美國UVP公司；超純水儀，購自美國Milli-Q公司；紫外分光光度計(jì)Ultrospec 1000，購自美國Phamacia公司；熱循環(huán)儀2219，購自德國Bromma公司；DYY-Ⅲ33A型水平電泳槽，購自北京市六一儀器廠；垂直板電泳槽，購自北京東方特力有限公司；電子天平BL610，購自德國塞多利斯公司；電子恒溫水浴鍋DK98-1，購自天津市泰特斯儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1DNA提取與檢測(cè)

采用酚-氯仿法提取耳組織基因組[9]，1.5%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)分別檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，濃度合格DNA稀釋到200 ng·μL-1。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)豬pIgR基因序列（NCBI ID：397315），Primer 5.0設(shè)計(jì)引物P1（F:5'CCCTGCCCCTCATCCT 3'R:5'TCTTCCCTCTGGTCTCACCT 3'），擴(kuò)增外顯子1（680 bp），測(cè)序?qū)ふ襍NP位點(diǎn)；根據(jù)檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物P2（F:5'ATATACATCTGCCAG?GCTGG R:5'TGTTGATGACCACATTGCAG），擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)的基因片段（193 bp），用于SSCP分型。引物由哈爾濱適合生物科技有限公司合成。

1.2.3PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：ddH2O 7 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各0.3 μL、2×Power Taq PCRmasterMix 10 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，55.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，29～33個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min，擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4測(cè)序

民豬和長白豬兩個(gè)群體中，挑選12頭對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉程度差異較大母豬進(jìn)行外顯子1測(cè)序。

1.2.5SSCP檢測(cè)

PCR產(chǎn)物2 μL加6 μL上樣緩沖液（98%甲酰胺，0.025%二甲苯青，0.025%溴酚藍(lán)），100℃變性10min、冰浴5min，取2 μL樣品點(diǎn)樣于14%非變性聚丙烯酰胺凝膠。室溫條件下，150 V電泳15 h，電泳結(jié)束后，銀染顯色和基因分型。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Excel 2010計(jì)算不同群體基因型頻率和基因頻率；利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，判斷兩群體基因型分布是否存在差異，計(jì)算不同群體基因純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）；采用Duncan's檢驗(yàn)多重比較和差異顯著性分析pIgR基因型與腹瀉性狀和生長性狀關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增

pIgR兩條引物擴(kuò)增結(jié)果見圖1和2，目的基因特異性好、條帶清晰，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2測(cè)序及SSCP分型結(jié)果

pIgR外顯子1存在兩個(gè)SNP位點(diǎn)，第373位 C→T導(dǎo)致丙氨酸→纈氨酸變異，第394位A→G導(dǎo)致天氨酸→絲氨酸變異，測(cè)序峰圖見圖3。針對(duì)兩個(gè)突變位點(diǎn)SSCP分型發(fā)現(xiàn)，兩位點(diǎn)僅存在AA、BB和AB三種基因型，AA型為野生型，BB型為兩位點(diǎn)同時(shí)突變型，AB型為兩位點(diǎn)同時(shí)雜合型，SS?CP分型見圖4。

圖1　引物P1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification result of primer P1

圖2　引物P2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　PCR amplification result of primer P2

圖3　外顯子1部分測(cè)序結(jié)果，箭頭所指為突變位置Fig.3　Partial sequence of exon 1,arrow pointing to the position ofmutations

圖4　外顯子1的SSCP檢測(cè)結(jié)果Fig.4　SSCP detection results of exon 1

2.3不同品種基因頻率與基因型頻率

基因頻率與基因型頻率檢測(cè)結(jié)果見表2。民豬和長白豬均存在A、B兩種等位基因，且A為優(yōu)勢(shì)等位基因。民豬存在AA、AB和BB三種基因型，AB為優(yōu)勢(shì)基因型；長白豬存在AA和AB兩種基因型，AA為優(yōu)勢(shì)基因型。χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果表明，民豬和長白豬基因型分布存在極顯著差異（P< 0.01）。

2.4遺傳多態(tài)性分析

由表3可知，民豬雜合度（0.496）和多態(tài)信息含量（0.373）高于長白豬（分別為0.068和0.066），民豬表現(xiàn)為中度多態(tài)，長白豬表現(xiàn)為低度多態(tài)。

表2　民豬、長白豬外顯子1等位基因頻率和基因型頻率Table 2　Allele and genotype frequencies of exon 1 inmin pig and Landrace

表3　民豬、長白豬外顯子1多態(tài)性分析Table 3　Analysis of exon 1 polymorphism inmin pig and Landrace

2.5不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉程度比較

由表4可知，民豬群體中，不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉致死率差異顯著，具體表現(xiàn)為AB型兩腹瀉指標(biāo)均顯著低于AA型（P<0.05），低于BB型。長白豬群體中，AB型母豬對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉指數(shù)顯著低于AA型（P<0.05），腹瀉致死率低于AA型。

2.6不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬生長性能比較

由表5可知，民豬群體中，不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬35日齡重及平均日增重均有顯著差異，AB型35日齡重和平均日增重均顯著高于AA型（P<0.05），高于BB型。長白群體中，不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬35日齡重和平均日增重均無顯著影響，但AB型母豬對(duì)應(yīng)仔豬35日齡重和平均日增重均高于AA型。

表4　外顯子1不同基因型母豬仔豬腹瀉性狀Table 4　Piglet diarrhea traits of different sows on exon 1 genotype

表5　外顯子1不同基因型母豬仔豬生長性狀Table 5　Piglet growth traits of different sows on exon 1 genotype

3　討論與結(jié)論

本研究通過對(duì)民豬和長白豬pIgR外顯子1多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，兩群體共有3種基因型，其中AA 和AB基因型兩群體均有分布，BB基因型在長白豬群體中未檢測(cè)到，原因是BB基因型為長白豬不利基因型，在長期自然或人工選擇中被淘汰。χ2檢驗(yàn)表明，民豬和長白豬基因型分布存在極顯著差異（P<0.01）。

多態(tài)信息含量（PIC）、雜合度（He）和有效等位基因數(shù)（Ne）均可度量群體內(nèi)遺傳變異[10]。楊述林等對(duì)18個(gè)中國地方豬種26個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)，地方豬種等位基因數(shù)高于歐洲豬種[11-12]，表明中國地方豬種具有更高遺傳變異。本研究對(duì)民豬和長白豬pIgR外顯子1遺傳多態(tài)參數(shù)比較分析發(fā)現(xiàn)，民豬pIgR外顯子1的PIC、He和Ne值均高于長白豬，民豬群體變異程度高于長白豬群體。

研究顯示，pIgR的SNP與疾病易感性有關(guān)，如人類IgA腎炎和鼻咽癌[13-14]。仔豬腸道中，sIgA及游離SC可與致病微生物結(jié)合，限制致病微生物對(duì)腸細(xì)胞粘附，促進(jìn)病原微生物排出體外，而sIgA及游離SC合成分泌均需pIgR參與。本研究分析pIgR外顯子1不同基因型（AA、BB和AB型）母豬對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉程度差異，結(jié)果顯示，兩群體中AB型母豬對(duì)應(yīng)仔豬抗腹瀉能力較強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，pIgR基因外顯子1可作為豬抗腹瀉育種潛在遺傳標(biāo)記。

sIgA是母乳重要免疫因子之一，在新生動(dòng)物腸黏膜免疫中起關(guān)鍵作用。Johansen和Shimada等將小鼠pIgR基因敲除后，小鼠血清中pIgA顯著聚積，外分泌液中sIgA含量明顯減少[15-16]。Aroeti和Coyue等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)兔子pIgR基因點(diǎn)突變后，pIgR與pIgA結(jié)合能力也明顯降低[17-18]。本研究對(duì)pIgR SNP分析發(fā)現(xiàn)，pIgR外顯子1有兩個(gè)錯(cuò)義突變，三種基因型，不同基因型母豬對(duì)應(yīng)仔豬腹瀉程度差異顯著。pIgR基因外顯子1突變是否改變?nèi)橹衧IgA含量，進(jìn)而影響仔豬腹瀉，尚需深入研究驗(yàn)證。

[1]唐慶娟,戚欣,耿美玉.多聚免疫球蛋白受體(pIgR)在粘膜免疫中的重要功能[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2007,23(9): 724-729.

[2]Mostov K E.Transepithelial transport of immunoglobulins[J].An?nual Review of Immunology,1994,12(1):63-84.

[3]Luton F,Mostov K E.Transduction of basolateral-to-apical sig?nals across epithelial cells:ligand-stimulated transcytosis of the polymeric immunoglobulin receptor requires two signals[J].Molbi?olcell,1999,10(5):1409-1427.

[4]付金龍,劉沛.SC結(jié)構(gòu)、功能及其臨床研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志,2009,17(3):293-298.

[5]Willer Edam,Lima R de L,Giugliano LG.In vitro adhesion and invasion inhibition of Shigella dysenteriae,Shigella flexneri and Shigella sonnei clinical strains by humanmilk proteins[J].BMCmicrobiol,2004(4):18.

[6]王希彪,黃宣凱,崔世泉,等.民豬與長白豬哺乳仔豬腹瀉程度的差異及其對(duì)生產(chǎn)性能的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014, 45(7):79-82.

[7]王希彪,李建敏,許愿,等.哺乳仔豬腹瀉發(fā)生時(shí)間和程度的品種間差異及對(duì)增重的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(9): 79-83.

[8]汪蕊,王莉,王希彪.斷奶仔豬血清及腸道腸三葉因子ITF水平與腹瀉的關(guān)系研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(3):15-18.

[9]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:9-10.

[10]楊巧麗,孔晶晶,趙生國,等.豬SLA-DRA基因外顯子2多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(7): 1020-1027.

[11]楊述林.十八個(gè)中國地方豬品種遺傳多樣性分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[12]Laval G,Iannuccelli N,Legault C,et al.Genetic diversity of elev?en European pigbeerds[J].Genet Sel Evol,2000,32:187-203.

[13]Obara W,Iida A,Suzuki Y,et al.Association of single-nucleo?tide polymorphisms in the polymeric immunoglobulin receptor gene with immunoglobulin A nephropathy(IgAN)in Japanese pa?tients[J].JHum Genet,2003,48(6):293-299.

[14]Hirunsatit R,Kongruttanachok N,Shotelersuk K,et al.Polymeric immunoglobulin receptor polymorphisms and risk of nasopharyn?geal cancer[J].BMC Genet,2003(4):3-11.

[15]Johansen F E,Peknam,Norderhaug I N,et al.Absence of epithe?lial immunoglobulin A transport,with increasedmucosal leaki? ness,in polymeric immunoglobulin receptor/secretory componentdeficientmice[J].JExpmed,1999,190(7):915-922.

[16]Shimada S,Kawaguchimm,Kushiro A,et al.Generation of poly?meric immunoglobulin receptor-deficientmouse withmarked re?duction of secretory IgA[J].J Immunol,1999,163(10):5367-5373.

[17]Aroeti B,Kosen P A,Kuntz I D,et al.Mutational and secondary structural analysis of the basolateral sorting signal of the polymer?ic immunoglobulin receptor[J].Journal of Cell Biology,1993,123 (5):1149-1160.

[18]Coyne R S,Siebrechtm,Peitschm C,et al.Mutational analysis of polymeric immunoglobulin receptor/ligand interactions.Evidence for the involvement ofmultiple complementarity determining re?gion(CDR)-like loops in receptor domain I[J].J Biol Chem,1994, 269(50):31620-31625.

Polymorphism ofpIgRgene and its relation with piglet diarrhea

WANG Xibiao,TONG Xianwei,CUI Shiquan,DI Shengwei,LI Furong,LIU Zhiran,SONG Bin(School of Animal Sciences and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

The polymorphism ofpIgRexon 1 inmin pig and Landrace was detected with PCR-SSCP binding sequencingmethod,and the relationship between gene polymorphism and piglet diarrhea was analyzed.The results showed that twomissensemutations were detected inpIgRexon 1,and C373T led to alanine→Valine,A394G led to aspartic→serine.Min pig population revealed three genotypes including AA,AB and BB,and Landrace population had two genotypes with AA and AB,respectively,the difference of genotype distribution between the two groups was extremely significant difference(P<0.01).Inmin pig population, both piglet diarrhea index andmortality rate of different genotypic sows were significant difference(P<0.05). However,only piglet diarrhea index showed significant difference in Landrace population(P<0.05).

Min pig;pIgRgene;polymorphism;diarrhea;SSCP

S858.28

A

1005-9369（2016）04-0010-06

2016-03-17

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31501916）

王希彪（1965-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樨i的育種與生產(chǎn)。E-mail：wxibiao1967@aliyun.com